Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-23T13:46:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2472468 bytes, checksum: 0aaf75711e4e6fa640381d2fb14868a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T13:46:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2472468 bytes, checksum: 0aaf75711e4e6fa640381d2fb14868a2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A elevação da produção e comercialização de alimentos é acompanhada pelo aumento das infecções, hospitalizações e mortes relacionadas ao consumo de alimentos contaminados. Entre os alimentos relacionados a infecções alimentares, podemos destacar a carne suína e os ovos, como os principais responsáveis pelos casos de infecções alimentares, e o principal patógeno envolvido no consumo destes alimentos no mundo, são Salmonella Enteritidis em ovos e Salmonella Typhimurium em carne suína. O uso indiscriminado de antimicrobianos na produção animal promoveu diversos mecanismos de resistência em Salmonella, dificultando o controle e a eliminação deste patógeno. Desta forma, ha uma necessidade de desenvolvimento de novas práticas terapêuticas e os bacteriófagos ressurgem como uma alternativa de controle. O objetivo deste trabalho foi isolar e avaliar a atividade de bacteriófagos contra Salmonella Typhimurium e/ou Salmonella Enteritidis em poedeiras, ovos, suínos e na carne suína. No primeiro capítulo é apresentado a utilização de bacteriófagos em poedeiras e nas superfícies de ovos para a avaliação de seu efeito como método de controle de Salmonella Enteritidis. Foram realizados 2 experimentos distintos. O primeiro experimento avaliou o efeito de bacteriófagos livres e microencapsulados em ovos (clara, gema e casca) de galinhas poedeiras contaminadas com Salmonella Enteritidis. Foram utilizadas 50 poedeiras, distribuídas em 5 tratamentos, sendo T1 - Controle positivo - Aves contaminadas com Salmonella Enteritidis (ACSE); T2 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos livres (BL); T3 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos microencapsulados (BM); T4 - Não CSE e inoculadas com BL; T5 - Não CSE e inoculadas com BM. As aves do T1, T2 e T3 foram contaminadas oralmente pela ingestão de 1 mL de Salmonella Enteritidis (~1O6UFC-mL-1) enquanto os tratamentos T4 e T5 receberam apenas 1 mL de solução tampão PBS esterilizado. Seis horas apos a inoculação do patógeno, e em todo período experimental, as aves do T2 e T4 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos (~1O9 UFP-mL-1), enquanto as aves dos tratamentos T3 e T5 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos micro encapsulados (~1O9 UFP-mL-1). A aves tratadas com bacteriófagos livres apresentaram menor detecção do patógeno na superfície da casca, sugerindo que possa ter ocorrido redução da contaminação pelo patógeno. Foi possível isolar bacteriófagos na casca de todas os tratamentos em que ele foi utilizado. Além disso, também foi possível seu isolamento na clara dos ovos do T2. A utilização de bacteriófagos não eliminou o patógeno, mas reduziu o número de amostras positivas ao longo do tempo. O experimento dois avaliou diferentes metodologias de higienização de ovos em relação a presença de Salmonella Enteritidis em diferentes temperaturas e intervalos de tempo. Os ovos (n =720) foram separados em 8 grupos contendo trés diferentes combinações de tratamentos, com 90 ovos cada, sendo os tratamentos: higienizado (H), não higienizado (H), pasteurizado (P), não pasteurizado (P), com bacteriófagos (B), e sem bacteriófagos B), sendo representados por T1 (HPB), T2 (HPB), T3 (HPB), T4 (HP B), T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), T8 (HPB). Os tratamentos foram incubados a 4 0C, 7 0C e 24 0C e analisados nos intervalos de 1, 3, 7, 14 e 28 dias. A presença do patógeno foi observada em todas as amostras de casca incubada em todas as temperaturas e intervalos de tempos. Entretanto sua detecção na clara e na gema não foi possível quando os ovos foram incubados a 4 0C. Os tratamentos higienizados (T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB) e T8 (HPB)) apresentaram os maiores valores (p < 0,05) em relação aos outros tratamentos ao longo do tempo nas diferentes temperaturas. Além disso, o tratamento T2 (HPB) obteve, os menores valores médios de crescimentos (log UFC-mL-1) do patógeno em todas as temperaturas e amostras analisadas (p < 0,05). Estes resultados sugerem que a higienização e a pasteurização dos ovos podem contribuir para a contaminação e penetração do patógeno ao longo do tempo, mesmo em baixas temperaturas. Além disso, a utilização de bacteriófagos resultou em uma contagem media (log UFC-mL-1) do patógeno inferior na maioria dos tratamentos em que foi utilizado. O capitulo dois apresenta o isolamento de bacteriófagos específicos para as duas principais estirpes de Salmonela e sua utilização no controle do patógeno em ovos líquidos e em carne suína moída. Os ovos líquidos e a carne moída suína foram contaminados com os patógenos, incubados a 4 0C e a 24 0C e as amostras analisadas quanto a redução do patógeno em diferentes intervalos de tempos (1 dia, 7 dias e 14 dias. A Multiplicidade de Infecções(MOI) utilizada em todos os tratamentos foi de 1x 101 UFP/UFC. Foi possível observar redução significativa (p < 0,05) da concentração dos patógenos em todos os tratamentos realizados a 24 0C. A 4 0C o bacteriófago foi capaz de reduzir (p < 0,05) a concentração de Salmonella Typhimurium em um dia e uma semana de incubação na carne suína moída e no ovo líquidos. Entretanto, só foi possível observar a redução (p < 0,05) de Salmonella Enteritidis nas amostras de carne suína moída incubadas por 1 dia e 1 semana a 40C. Após duas semanas de incubação a 40C não houve redução significativa (p >0,05) dos patógenos em nenhum dos alimentos avaliados. Os maiores índices de redução ocorreram a 40C quando Salmonella Typhimurium foi o hospedeiro, sendo de 1,65 log10 UFC-g-1 em carne suína moída e 3,14 l log10 UFC- g-1 em ovos líquidos. Concluiu-se que o bacteriófago foi capaz de reduzir a contaminação de Salmonella Typhimurium em ambos alimentos, entretanto seu efeito foi não significativo para o controle de Salmonella Enteritidis em ovos líquidos. O terceiro capitulo teve como objetivo avaliar o efeito causado pelos bacteriófagos no trato gastrointestinal de suínos em relação ao efeito causado pelos antibióticos utilizados como melhoradores de desempenho. Dezoito suínos utilizados para o experimento foram divididos em três tratamentos: Tratamento controle (TC), tratamento com antibióticos (TA) e tratamento com bacteriófagos (TB). A ração dos suínos do TA foi suplementada com AUREO S-P 250®. Os animais do TB receberam diariamente, via oral, 5 mL do coquetel contendo 1,0 x 1010 UFP-mL-1 de bacteriófagos e os suínos do TC receberam apenas a ração basal. Após os 21 dias de tratamento os animais foram novamente pesados e abatidos, e o conteúdo fecal do ileo, ceco e colón foram coletados para a realização das análises. Para avaliar a diversidade de bactérias no colón, ileo e ceco, a região V3 do gene 16S rRNA do DNA metagenômico foi amplificada pela reação da polimerase em cadeia (PCR), usando os primers 338F e 518R e analisada pela DGGE. Analisando o dendograma foi possível observar que a maioria das amostras do ceco e do colón se agruparam de forma heterogênea. Estes agrupamentos apresentaram diferença significativa (p < 0,01) na composição microbiana presentes em cada amostra. Mesmo os efeitos dos tratamentos não terem se agrupado de forma homogênea no dendograma, os padrões de amplicons das amostras mostrou efeito significativo (p < 0,10) somente na comparação entre o TA e o TC, enquanto para as outras comparações (TB x TC e TB x TA) os efeitos não foram significativos (p > 0,05). Este resultado sugere uma pequena mudança na composição da microbiota dos animais do TB, apesar do resultado não ter sido estatisticamente significativo. / The increase in production and marketing of food is accompanied by an increase in infections, hospitalizations, and deaths related to the consumption of contaminated food. Among the foods related to food infections, we can highlight the pork and eggs as the main responsible for cases of foodborne illness, and the main pathogen involved in the consumption of these foods in the world, are Salmonella Enteritidis in eggs and Salmonella Typhimurium in pork. The indiscriminate use of antimicrobials in animal production promoted several mechanisms of resistance in Salmonella, making it difficult to control and elimination of this pathogen. Thus, there is a need to develop new therapeutic approaches and bacteriophages reappeared as a control alternative. The objective of this study was to isolate and evaluate the bacteriophage activity against Salmonella Typhimurium and / or Salmonella Enteritidis in laying, eggs, pigs and pork. In the first chapter is presented the use of bacteriophages in layers and the surfaces of eggs for the evaluation of its effect as Salmonella Enteritidis control method. Two separate experiments were performed. The first experiment assessed the effect of free and microencapsulated bacteriophage eggs (clear, yolk and shell) laying hens infected with Salmonella Enteritidis. 50 laying hens were distributed in five treatments: T1 - Positive Control - Poultry contaminated with Salmonella Enteritidis (ACSE); T2 - ACSE and inoculated with free bacteriophages (BL); T3 - ACSE and inoculated with microencapsulated bacteriophage (BM); T4 - Not CSE and inoculated with BL; T5 - Not CSE and inoculated with BM. The birds T1, T2 and T3 were infected orally by ingestion of Salmonella enteritidis 1 mL (~ 106 CFU-ml-1) while T4 and T5 treatments only received 1 ml of PBS sterile buffer. Six hours after inoculation of the pathogen, and throughout the experimental period the birds T2 and T4 received 1 ml of suspension of bacteriophages (~1O9 PFU-ml-1), while birds T3 and T5 treatments received 1 ml of suspension micro encapsulated bacteriophages (~ 106 PFU-ml-1). The birds treated with free bacteriophages showed lower detection of the pathogen in the shell surface, suggesting that may have occurred reduction of contamination by the pathogen. It was possible to isolate bacteriophage hulls of all treatments in which it was used. Furthermore, it was also possible in isolation of clear eggs T2. The use of bacteriophages did not eliminate the pathogen, but reduced the number of positive samples over time. The second experiment evaluated different eggs sanitization methods for the presence of Salmonella Enteritidis at different temperatures and time intervals. The eggs (n = 720) were separated into 8 groups containing three different combinations of treatments with 90 eggs each, the treatments being: sanitized (H) not sanitized (H), pasteurized (P), non-pasteurized (P), with bacteriophage (B) and without bacteriophages (B), being represented by T1 (HPB), T2 (HPB), T3 (HPB), T4 (HP B), T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), T8 (HPB). The treatments were incubated at 4 ° C, 7 ° C and 24 ° C and analyzed at intervals of 1, 3, 7, 14 and 28 days. The pathogen was observed in all the samples incubated peel at all temperatures and time intervals. But its detection in the clear and the yolk was not possible when the eggs were incubated at 4 ° C. The sanitized treatments (T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), and T8 (HPB)) showed the highest values (p < 0.05) compared to other treatments over time at different temperatures. Furthermore, the treatment T2 (HPB), gave the smallest average values of growth (log CFU-ml-1) pathogen at all temperatures and the samples analyzed (p < 0.05). These results suggest that the cleaning and pasteurization of eggs can contribute to contamination and pathogen penetration over time, even at low temperatures. Furthermore, the use of bacteriophages resulted in an average count (log CFU-ml-1) pathogen in the lower most treatments that was used. The chapter two presents the isolation of bacteriophages specific to the two main strains of Salmonella and their use in pathogen control in liquid egg and ground pork. Liquid egg and pork ground beef were contaminated with pathogens, incubated at 4 °C and 24 °C and the samples analyzed for the reduction of the pathogen in different time intervals (1 day, 7 days and 14 days. Multiplicity of Infection (MOI) used in all treatments was 1 x 101 PFU/CFU. it was observed a significant reduction (p < 0.05) the concentration of pathogens in all treatments carried out at 24 ° C. the bacteriophage 4 ° C was able to reduce (p < 0.05) the concentration of Salmonella typhimurium in a day and a week of incubation in the ground pork and egg liquids. However, it was only possible to observe a reduction (p < 0.05) in Salmonella Enteritidis samples minced pork incubated for 1 day and 1 week at 4 ° C. After two weeks of inoculation at 4 ° C showed no significant reduction (p > 0.05) of the pathogens in any of the evaluated food. the largest reduction ratios occurred at 4 ° C when Salmonella Typhimurium has been the host, and 1.65 log10 CFU-g-1 in ground pork and 3.14 log10 CFU-g-1 for liquid eggs. It was concluded that the bacteriophage is capable of reducing contamination of Salmonella Typhimurium in both foods, though its effect was not significant to control Salmonella Enteritidis in liquid eggs. The third chapter aimed to evaluate the effect caused by the bacteriophages in the gastrointestinal tract of pigs in relation to the effect caused by the antibiotics used as performance enhancers. Eighteen pigs used for the experiment were divided into three treatments: control treatment (TC) treatment with antibiotics (TA) and treated with bacteriophage (TB). The ration of the TA pigs was supplemented with AUREO S-P 250®. The animals received daily TB orally 5 ml cocktail containing 1.0 x 1010 PFU-ml -1 bacteriophages and TC pigs received only the basal ration. After 21 days of treatment the animals were weighed again and killed, and the faecal contents of the ileum, cecum and colon were collected for the analyzes. To evaluate the diversity of bacteria in the colon, ileum and cecum, the gene 168 rBNA V3 region of metagenomic DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primers 338F and 518R and analyzed by DGGE. Analyzing the dendrogram was observed that most of the samples of the cecum and colon were grouped heterogeneously. These groups showed significant differences (p < 0.01) in the microbial composition present in each sample. Even the effects of treatments have not been grouped homogeneously in the dendrogram, amplicon patterns of the samples showed significant effect (p 0.10) only in the comparison between TA and TC, while other comparisons (TB x CT x TA and TB) the effects were not significant (p > 0.05). This result suggests a slight change in the composition of the microbiota of animals of TB, despite the result was not statistically significant.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica Aplicada y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta enero de 2018 / Los cánceres del aparato digestivo (CAD) son, en su conjunto, la principal causa de defunciones por cáncer a nivel mundial. Pese al gran desarrollo de diversas terapias, el tratamiento contra este tipo de cáncer continúa siendo poco eficaz y conlleva un amplio número de efectos secundarios que disminuyen la calidad de vida del paciente. Esto hace necesario investigar y desarrollar nuevas terapias que combatan de forma específica y eficaz el desarrollo de tumores. En la actualidad, la inmunoterapia es una de las estrategias terapéuticas más promisorias. El sistema inmune posee el potencial de reconocer y eliminar específicamente a las células tumorales mediante el reconocimiento de proteínas expresadas diferencialmente en estas células, denominadas antígenos tumorales. Sin embargo, el tumor genera un microambiente que inhibe la respuesta inmune antitumoral, por lo que el desarrollo de terapias capaces de interrumpir esta inhibición puede permitir que el sistema inmune elimine eficientemente las células tumorales. Actualmente existen dos tratamientos de este tipo aprobados para su uso en humanos. El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una proteína de superficie altamente expresada en una gran variedad de CADs y por ende, un blanco atractivo para el desarrollo de inmunoterapias específicas contra este conjunto de cánceres. En este trabajo se generó un bacteriófago filamentoso M13 específico contra CEA para ser usado en una futura inmunoterapia como un agente inmunogénico que se una a CEA en la superficie de las células tumorales. Así, el fago, a través de su ADN genómico de hebra simple, activará a las células del sistema inmune innato infiltrantes del tumor y promoverá un microambiente proinflamatorio capaz de revertir la inmunosupresión del tumor y permitir que la respuesta inmune adaptativa elimine a las células tumorales de forma específica. El bacteriófago anti-CEA se generó en cultivos de E. coli transformadas con fagomio e infectadas con un fago auxiliar. El fagomidio pSEX81 permitió expresar un fragmento variable de anticuerpo de cadena simple (scFv) específico contra CEA fusionado a la proteína pIII. El fago auxiliar (denominado hiperfago) permitió expresar las proteínas que conformarán la nueva partícula viral. La presencia de la proteína de fusión scFv-pIII en el bacteriófago M13 anti-CEA se confirmó mediante western blot usando un anticuerpo específico contra la proteína pIII. La especificidad del fago anti-CEA contra el antígeno CEA purificado se confirmó mediante ensayos de ELISA. Por otra parte, se comprobó in vitro que el bacteriófago anti-CEA se une a la proteína CEA expresada en la superficie de líneas celulares tumorales de origen humano y murino mediante citometría de flujo. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que este fago se unirá al antígeno tumoral CEA in vivo, convirtiéndolo en una potencial inmunoterapia contra CADs / Gastrointestinal cancers are the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the great development of cancer therapies, the treatment of this type of cancer remains ineffective and involves a large number of side effects that negatively impact the life quality of patients. In order to solve these problems, development of new therapies able to specifically and effectively eradicate tumors is needed. Currently, immunotherapy is one of the most promising therapeutic strategies. The immune system has the potential to specifically eliminate tumor cells by recognizing tumor antigens, which are proteins differentially up-regulated in these cells. However, tumors create an immunosuppressive microenvironment that inhibits the immune responses against the tumor, therefore development of therapies capable of disrupting this inhibition may allow the immune system to eliminate tumor cells efficiently. Currently, two drugs following this principle have been approved for human use. Carcinoembryonic antigen (CEA) is a surface protein highly expressed in a variety of gastrointestinal cancers, thus it is an attractive target for the development of immunotherapies targeting this type of cancers. In this thesis, a M13 filamentous bacteriophage able to bind CEA at the surface of tumor cells was generated as an immunogenic agent for a future immunotherapy. This CEA-specific M13 filamentous bacteriophage, through its genomic single-stranded DNA, is expected to activate tumor-infiltrating innate immune cells promoting a proinflammatory microenvironment capable of disrupting tumor-induced immunosuppression and allowing adaptive immune responses to efficiently eliminate tumor cells. Furthermore, this strategy will promote the presentation of tumor antigens and the generation of tumor-specific adaptive immune responses The CEA-specific bacteriophage was generated in E. coli cultures transformed with a phagemid and infected with a helper phage. The phagemid vector pSEX81 was used for generating the CEA-specific single chain variable fragment (scFv) fused to the pIII protein on the surface of M13 bacteriophages. The helper phage (or hyperphage) allowed the expression of the other viral proteins needed to form the bacteriophage particles. The presence of scFv-pIII fusion protein in CEA-specific bacteriophage preparations was confirmed by western blot analysis using an M13 pIII-specific antibody. The capability of the bacteriophage to specifically bind purified CEA in vitro was confirmed by ELISA. Moreover, it was demonstrated that the CEA-specific bacteriophage binds CEA expressed on the surface of mouse and human tumor cell lines. The results obtained in this thesis suggest that this CEA-specific bacteriophage will bind to CEA-expressing tumors in vivo, and it represents a potential immunotherapy against gastrointestinal cancer. The in vitro observed specificity of the anti-CEA M13 bacteriophage suggests that this phage will bind to this tumor antigen in vivo, making it a powerful tool for potential gastrointestinal cancer targeted immunotherapies / CORFO Innova

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 38.pdf: 779592 bytes, checksum: bb7860a5216579fd5bbccc4e3c3d8a6d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / As hortaliças como a alface (Lactuca sativa) têm sido associadas a diversos surtos de doenças de origem alimentar. Dentre os patógenos envolvidos, os norovírus (NoV) são reconhecidos como os principais agentes etiológicos de gastrenterite, sendo as estirpes do genogrupo II (GII) mais prevalentes. Dessa forma, muito esforço tem sido realizado no desenvolvimento de métodos para detecção desses vírus em hortaliças. Os estudos têm focado na padronização dos métodos e otimização das etapas de extração, concentração e detecção do ácido nucléico viral. O uso de outros vírus como controle interno também tem sido estudado, para identificação de falhas durante a análise e evitar resultados falso-negativos. O presente estudo teve como objetivo investigar a contaminação de NoV GII pelo método de concentração por filtração em membrana negativa seguida de semi-nested PCR e PCR em tempo real e avaliar a qualidade microbiológica (pesquisa de Salmonella e enumeração de coliformes) de 90 amostras de alface (30 in natura, 30 minimamente processadas e 30 de serviços de alimentação) no Estado do Rio de Janeiro.O bacteriófago PP7 foi utilizado como controle interno e uma otimização do método comparando a solução salina fosfatada tamponada (PBS) e o tampão glicina (TG) foi realizada. Nenhuma amostra apresentou contaminação por NoV GII e Salmonella. As amostras in natura apresentaram qualidade microbiológica satisfatória de acordo com a legislação. Uma amostra minimamente processada (3,3%) e seis de serviços de alimentação (20%) apresentaram condições higiênico-sanitárias insatisfatórias devido ao número de coliformes termotolerantes acima do permitido, indicando que os procedimentos de higienização realizados nos serviços de alimentação não foram eficazes para eliminação dos micro-organismos ou que a contaminação pode ocorrer, por parte dos manipuladores. / Green leafy vegetables, as lettuce (Lactuca sativa) have been linked to diverse foodborne outbreaks worldwide. Among several pathogens involved, norovirus (NoV) are recognized as one of the most important etiological agent associated with gastroenteritis, being genotype II (GII) the most prevalent. In this manner, efforts have been made to develop methods to detect these viruses in green leafy vegetables. Researches have focused on standardizing methods and optimize stages of extraction, concentration and detection of viral nucleic acid. The use of others viruses as internal control has also been studied, to identifying possible errors during analysis and avoid false-negatives results. This study aimed to verify the contamination by NoV GII through concentration methodology by negative-membrane filtration followed by detection by semi-nested PCR and quantification by Real Time PCR and microbiological quality evaluation (Salmonella research and enumeration of total and thermo tolerant coliform) of 90 samples of lettuce (30 in natura, 30 minimally processed and 30 from food services) in the state of Rio de Janeiro. Bacteriophage PP7 was utilized as internal control and a method optimization comparing phosphate buffered saline (PBS) and Glycine buffer (GB) was carried out. No sample showed contamination by NoV GII and Salmonella. Samples of in natura lettuce exhibited satisfactory microbiology quality according Brazilian resolution. One minimally processed sample (3.3%) and six (20%) from food service showed unsatisfactory hygienic-sanitary conditions because of the number of thermotolerant coliforms above of allowed, indicating that hygienic proceedings in restaurants were not effective for eliminating those microorganisms or that the contamination may occur by employers. PP7 bacteriophage was detected in 40, 86.7 and 76.7% of in natura, minimally processed and food service, respectively. Using GB increased PP7 bacteriophage recovery (p = 0.029), but did not demonstrate significant difference in NoV GII recovery (p = 0.57), and increased sensitivity of semi nested PCR technique for detecting NoV GII in samples artificially contaminated. This last one exhibited lower sensitivity than Real Time PCR for NoV GII detection. Results point out that GB is an elution buffer more efficient and that PP7 bacteriophage is applicable as an internal control of this method.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gregoracci_GustavoBueno_M.pdf: 4620017 bytes, checksum: f7feaaf632175abbe340a9d82f379a0c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os bacteriófagos, vírus que infectam procariotos, são as entidades biológicas mais numerosas do globo. Sua abundância desencadeou revisões em diversos campos como genética, evolução e ecologia, e os fagos atualmente são reconhecidos como importantes vetores para o fluxo de matéria, energia e informação em ambientes naturais. Contudo, há uma enorme diferença entre a quantidade de bacteriófagos estimada no globo (mais de 1030 partículas virais) e a quantidade descrita na literatura (em torno de 5300 amostras). Esta amostragem restrita reflete complicações para estudos de diversidade viral e demonstra as limitações de nosso conhecimento sobre estes vírus. Além disso, a emergência de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos implica em uma necessidade de novas práticas terapêuticas, e os fagos representam uma alternativa digna de estudos aprofundados. Assim sendo, este trabalho objetivou o isolamento, a partir de esgoto, e a caracterização biológica de bacteriófagos líticos contra patógenos humanos, visando ampliar a amostragem destes vírus e selecionar novos possíveis agentes terapêuticos. A caracterização envolveu análises morfológica, genética e de especificidade de hospedeiros. As metodologias adaptadas de isolamento e caracterização permitiram a análise de mais de 20 bacteriófagos, todos pertencentes à ordem Caudovirales, bem como de uma proposição para a classificação taxonômica dos isolados. Merece destaque especial o isolamento de três fagos contra Chromobacterium violaceum, feito inédito na literatura, bem como estudos sobre a suscetibilidade deste organismo a diversos bacteriófagos isolados. Por fim, ensaios biológicos sugerem estudos posteriores sobre a aplicação de um destes fagos, denominado Shfl1, para a terapia de Shigella flexneri em infecções humanas, mas são incertos quanto ao potencial do mesmo para contenção deste patógeno no processamento de esgoto comum / Abstract: Bacteriophages, viruses that infect prokaryotic hosts, are the most numerous biological entities of the world. Their abundance implied in reviews in several areas of knowledge, like genetics, evolution and ecology, and phages are now recognized as important vectors in the flux of matter, energy and information in natural environments. However, there is a huge difference between the estimated number of bacteriophages in the world (more than 1030 viral particles) and the quantity described in the literature (around 5300 samples). This restricted sampling reflects in complications to studies of viral diversity and demonstrates our limited knowledge regarding these viruses. Furthermore, the emergence of bacteria resistant to multiple antibiotics implies in a need for new therapeutical approaches, and phages represent an alternative worthy of additional studies. As being so, our purpose in this study was to isolate, from raw sewage, and to biologically characterize lytic bacteriophages, intending to extend these viruses¿ sampling and to select possible new therapeutic agents. Characterization involved morphological, genetic and host range analysis. The adapted protocols for isolation and characterization permitted the analysis of more than 20 bacteriophages, all belonging to the Caudovirales order, as well as a tentative taxonomic classification of the samples. Other distinctive results include the isolation of three bacteriophages against Chromobacterium violaceum, previously unknown in the literature, as well as the study about the susceptibility of this organism to several isolated phages. Moreover, biological assays suggested further studies about the application of one of these phages, named Shfl1, in the treatment of Shigella flexneri infections in humans, but were uncertain about the potential of the same virus to restrain this pathogen during sewage processing / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Aisla un bacteriófago lítico denominado Vf1, procedente del mar peruano, capaz de infectar a Vibrio fluvialis, bacteria que afecta humanos y organismos acuáticos. El bacteriófago Vf1 fue caracterizado con respecto a su morfología, estabilidad térmica, diferentes rangos de pH, sensibilidad frente al cloroformo, exposición a la luz UV, rango de hospederos y la curva de crecimiento de un paso. La microscopía electrónica de transmisión, evidenció cabeza de forma icosaedrica con un diámetro de 82.773 nm y un talo largo no contráctil de 142.318 nm de longitud, características propias a la familia Siphoviridae. El fago Vf1, fue resistente al calor a 20°C por 30 minutos, perdiendo su viabilidad a partir de 50 y 60°C; y en valores de pH entre 7 y 8 mantuvo títulos elevados, disminuyendo el título entre 5 y 6, siendo nulo a valores de pH ácido. La viabilidad frente a la exposición al cloroformo, evidenció una reducción en el título del 50% y frente a la luz UV, la reducción fue del 100% a 90 segundos de exposición. En la curva de crecimiento de un paso evidenció un período de latencia de 20 minutos y el tamaño de la explosión o burst size fue 602 partículas por centro infectivo. Los parámetros biológicos evaluados en este estudio evidenciaron el potencial del bacteriófago Vf1 para poder ser utilizado en fagoterapia, además, la metodología evaluada podría ser utilizado para el aislamiento de otros bacteriófagos de ambientes marinos. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las Enfermedades Transmitidas por los Alimentos son consideradas como un problema importante de salud pública, donde Salmonella spp juega un rol fundamental, siendo Salmonella Enteritidis (SE) el serotipo mayormente involucrado en los brotes del país y el más aislado desde productos de origen animal, como lo es la carne. El objetivo de este estudio fue determinar la capacidad biocontroladora de una mezcla de 5 bacteriófagos líticos sobre Salmonella Enteritidis en carne fresca de cerdo contaminada experimentalmente. Para esto se trabajó con 2 grupos de 25 muestras cada uno correspondiente a carne fresca de cerdo molida. Un grupo fue contaminado con 3,9 x 103 UFC/mL de SE y se le agregó una alícuota de bacteriófagos (107 UFP/mL), manteniéndose a temperatura ambiente por 10 días. El otro grupo se contaminó con 3,9 x 104 UFC/mL de SE y se le agregó una alícuota de bacteriófagos (108 UFP/mL), manteniéndose a temperatura de refrigeración por 10 días. Cada grupo experimental contó con un grupo control de 25 muestras que solo fueron contaminadas con SE. Luego de 10 días los resultados mostraron que el 100% de las muestras fueron contaminadas, es decir, tanto los grupos experimentales como sus respectivos controles, independiente de la temperatura de almacenamiento. Sin embargo, en el grupo experimental mantenido a temperatura ambiente, se observó una reducción de 2,56 unidades logarítmicas, valor significativo (p < 0,05), al compararlo con su grupo control. Por otro lado, en el grupo mantenido a temperatura de refrigeración, los recuentos no fueron estadísticamente significativos (p > 0,05) entre el grupo experimental y su respectivo control. Estos resultados indican que el uso de esta mezcla de fagos líticos, bajo ciertas condiciones de temperatura, podría ser una alternativa para el biocontrol en alimentos logrando reducciones en la contaminación de SE que, junto a otras medidas, podrían disminuir la incidencia de brotes de ETA en el país

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-01T13:24:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1410315 bytes, checksum: 018838e11a8a7e3cca3d440cf4f025db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-01T13:24:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1410315 bytes, checksum: 018838e11a8a7e3cca3d440cf4f025db (MD5) Previous issue date: 2018-09-27 / Ralstonia spp. são conhecidas por causar murcha bacteriana em várias plantas de interesse econômico. O patógeno possui alta variabilidade genética, ampla variedade de hospedeiros e pode sobreviver no solo mesmo na ausência de hospedeiros. A compreensão das potenciais fontes de inóculo, que contribuem para a variabilidade genética no centro de origem do patógeno é interessante para o manejo da doença. O papel dos rios, plantas daninhas e da população nativa de Ralstonia spp. em áreas de vegetação natural no desenvolvimento de epidemias de murcha bacteriana é pouco compreendido. A variabilidade genética entre cepas de Ralstonia spp. em uma região onde a doença é endêmica pode elucidar a contribuição dos meios de dispersão e fatores associados à sobrevivência. No presente estudo, a detecção de Ralstonia spp. em rios de diferentes biomas do Brasil revelou o potencial destes recursos naturais para dispersar o patógeno. As plantas invasoras mostraram ser importantes reservatórios de ambas as espécies de Ralstonia que ocorrem no Brasil e colaboram para sua sobrevivência. Métodos de detecção não foram sensíveis para confirmar a presença de Ralstonia spp. em amostras de solo de áreas sem ocorrência de murcha bacteriana. Quando se analisaram 204 isolados de R. solanacearum e 60 isolados de R. pseudosolanacearum obtidos do município de Coimbra, Minas Gerais, constatou-se haver baixa variabilidade genotípica e clonalidade. Nenhuma estruturação foi observada para as regiões do município, mas a composição genotípica variou entre os anos amostrados. Para o controle alternativo da murcha bacteriana, cinco fagos pertencentes à família Siphoviridae, ordem Caudovirales, foram isolados em amostras de solo. A análise molecular e a gama de hospedeiros com diferentes isolados de Ralstonia spp., representando o Brasil, revelaram diferenças entre os vírus. Adicionalmente, houve diferenças quanto à gama de hospedeiros quando os cinco fagos foram expostos a 24 isolados de Ralstonia spp. Os fagos não foram capazes de prevenir a infecção e controlar o número de células de Ralstonia spp. no solo. Outros métodos de aplicação são necessários para avaliar a eficiência dos fagos no controle da murcha bacteriana. / Ralstonia spp. are known to cause bacterial wilt in several plants of economic interest. The pathogen has high genetic variability, wide host range and can survive in the soil even in the absence of hosts. Understanding potential inoculum sources that contribute to genetic variability in the center of origin is interesting to the management of the disease. The importance of rivers, weeds and native population of Ralstonia spp. in areas of natural vegetation in the development of epidemics of bacterial wilt is poorly understood. Genetic variability among strains of Ralstonia spp. in a local region where the disease is endemic can elucidate the contribution of the means of dispersal and factors of survival. In the present study, the detection of Ralstonia spp. was attempted in water of rivers of different biomes of Brazil and revealed the potential of these natural resources to disperse the pathogen. Weeds were important reservoirs of both species of Ralstonia that occur in Brazil, and collaborate to their survival. Methods of detection were not sensitive to confirm the presence of Ralstonia spp. in soil samples from areas without the occurrence of bacterial wilt. The genetic variability of 204 strains of R. solanacearum and 60 strains of R. pseudosolanacearum from the municipality of Coimbra, Minas Gerais, was low and there was evidence of clonality in the population. The population was not genetically structured according to the geographic region in the municipality, however the genotypic composition varied in time. To assess an alternative measure to control bacterial wilt, five phages were isolated. All phages belong to the Siphoviridae family, Caudovirales order. Molecular analysis and host range with different R. solanacearum strains revealed differences among the viruses. There were differences in the host range when the five phages were exposed to 24 Ralstonia spp. strains. The phages were not able to prevent tomato infection and control the number of cells of Ralstonia spp. in the soil. Other methods of application are necessary to evaluate the efficiency of the phages to control of bacterial wilt.

Orientador : Fumio Yokoya / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T04:20:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oriani_MariaRaqueldeGodoy_M.pdf: 3506082 bytes, checksum: a6a84567e488ebdd0225a7b620b46cf1 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Levando-se em consideração os poucos conhecimentos sobre a incidência de bactériófagos de bactérias láticas mesofíliças, na indústria de leite do Estado de São Paulo, e a sua influência sobre a capacidade acidificante dos fermentos licticos disponíveis em nosso mercado, o presente trabalho foi conduzido com o intuito de esclarecer a real situação dos laticínios no Estado foram coletadas 33 amostras de soro de queijo em 17 laticínios, que foram submetidas ao teste de inibição da producão de ácido lático, como medida prévia para avaliar a presença de bacteriófagos. Os soros resultantes desses experimentos quando submetidos ao teste de placa de lise. indicaram, que uma diminuição de 10% na acidez na presença de amostra suspeita ao contrário do estabelecido na literatura, não reflete a veracidade da presença de bacteriófagos em uma amostra.Nossos resultados mostraram que 74% das amostras foram falso positivas e 1% delas, falso negativa. Dentre os 16 bacteriófagos isolados, 12 foram específicos para L. lactis, 3 para L. diacetylactis e 1 capaz de lisar ambos microrganismos, evidenciando atividade fágica em 65% das indústrias avaliadas.Utilizando uma mistura dos bacteriófagos isolados, procedeu-se aos testes com os fermentos lácticos comerciais (4 do tipo BD, 2 do tipo D, 5 do tipo O e 1 simples - Lactococcus diacetylactis). Em testes de acidificacão dos fermentos. em 8 horas, somente 2 do tipo O mostraram diferença na capacidade de acidificação. Verificou-se que os fermentos submetidos à repicagem diária, mantiveram os bacteriófagos após 2O subcultivos em 2 fermentos ( tipos BD e D), com variação na capacidade acidificante somente para o tipo BD. A partir dos fermentos, foram obtidas bactérias componentes, que foram testadas individualmente quanto à resistência aos bacteriófagos, mostrando que o nível de sensibilidade varia consideravelmente: 23% do fermento BD1 e 40% do fermento D2. O fermento O3 composto de 5 cepas, 1 mostrou sensibilidade e o fermento O4, constituído de 4 cepas, 2 foram sensíveis. 5 bacteriófagos de nossa coleção não se mostraram infectivos a nenhum dos isolados. Um dos bacteriófagos mostrou-se infectivo para a quase totalidade dos isolados / Abstract: Since the knowledge of phage on mesophilic acid bacteria in milk processing industry of the State of São Paulo, and its effect on acidification performance of commercially avaliable lactic acid starter, this work was designed to elucidate the real situation of milk industry in this State. A total of 33 samples of whey were collecd in 17 cheese factories and tested on hability to inhibity acid production by selected starter as a mean to detect the presence of bacteriophage. These tests have shown that a decrease of 10% or more in the amount of acid produced in the presence of suspected sample, was not good indicative of presence of phage as it has bean assumed in the literature. Our results showed that 74% of samples were false positive and 1 % were false negative. Amongst 16 phages isolated 12 were specific for L. Lactis, 3 for L. diacetylactis and one was capable to cause lyses of both species, which indicates contamination in 65% of the industries analyzed. Commercially available starters (4 type BD; 2 type D; 5 type O and one simple starter) were tested with mixture of isolated phages. With acidification test for 8 hours, only 2 type O showed positive results. Daily transfer of cultured retained phages even after 20 subcultures in both types (BD and D), with acidification difference only on type BD. Pure cultures isolated from commercial starters were tested for phage resistance. Among isolated from BD1 23% were sensitive; from Dz 40% were sensitive. The starter 03 were composed of 5 strains, and one were sensitive; starter 04 with 4 strains, 2 were sensitive. Five of isolated phages were not infective on any of the isolates but one of them were infective for most of them / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Presenta a los bacteriófagos que son biocontroladores naturales de las bacterias como una alternativa para el control de las poblaciones de Vibrio cholerae, causantes de la enfermedad de transmisión alimentaria (ETA). El objetivo de este trabajo es aislar y caracterizar bacteriófagos capaces de infectar a Vibrio cholerae. Se toman muestras de aguas residuales de Lima - Perú. Los métodos empleados son para el aislamiento de Vibrio cholerae enriqueciendo, aislando en medio TCBS y bioquímica. Para el aislamiento y purificación del bacteriófago Φ K14 se realiza las pruebas de enfrentamiento en caldo, goteo, propagación y titulación. Para la caracterización microbiológica del bacteriófago Φ K14 se realiza las pruebas de rango de hospedero, multiplicidad de infección y curva de un paso. Para la caracterización fisicoquímica son las pruebas de estabilidad a diferentes condiciones ambientales (temperatura, pH y sensibilidad al cloroformo) y se realiza la microscopía electrónica. El bacteriófago K14 de Vibrio cholerae es caracterizado microbiológica y fisicoquímicamente de un total de 3 bacteriófagos aislados de aguas residuales es caracterizado microbiológica y fisicoquímicamente. Presenta una multiplicidad de infección (MOI) óptima de 0.001. El periodo latente del fago K14 es de 10 a 15 minutos y el tamaño de explosión de 25 UFP por célula infectada. Es estable a temperaturas de 40 oC, 50 oC y 60 oC e inestable a los 70 oC y 80 oC. El bacteriófago K14 no es sensible al cloroformo. Es inestable a pH 3 y estable del pH 7 a pH 9 pero tiene mayor estabilidad a pH 8. Según la micrografía electrónica el bacteriófago Φ K14 pertenece según sus estructuras a la familia Myoviridae. / Tesis

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:25:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O crescente surgimento de resistência bacteriana aos antibióticos convencionais é um grave problema que precisa ser enfrentado, seja pela descoberta de novas substâncias antimicrobianas, naturais ou sintéticas, ou através da pesquisa de terapias alternativas que sejam economicamente acessíveis. A terapia de fagos é uma dessas alternativas. Trata-se de uma forma de controle biológico, baseado em vírus específicos que infectam e destroem células bacterianas: os bacteriófagos. No entanto, esta é uma fonte terapêutica ainda pouco explorada. Esse trabalho utilizou o cultivo, isolamento e sequenciamento do genoma, além de técnicas de genômica de alto desempenho para isolar e caracterizar o genoma de bacteriófagos específicos para a linhagem enteroinvasiva de Escherichia coli ATCC 43893, visando o entendimento e a definição do ciclo de infecção desses vírus (líticos ou lisogênicos). A metodologia utilizada nessa pesquisa possibilitou o isolamento de 12 vírus. 8 diferentes linhagens virais tiveram seu material genético extraído e purificado, apresentando bom rendimento e quantidade reduzida de DNA bacteriano contaminante. O sequenciamento do genoma desses 8 vírus foi realizado usando a plataforma de nova geração MiSeq. Foi analisada a diversidade genética desses bacteriófagos e verificou-se que são vírus da ordem Caudovirales, sendo 2 da família Siphoviridae e 6 da família Myoviridae. Apenas um deles mostrou potencial de ter ciclo lisogênico, os outros sete vírus não continham nenhum gene que sugerisse isso. Entretanto, apesar dos bacteriófagos isolados não terem apresentado genes relacionados ao ciclo lisogênico, análises mais aprofundadas devem ser realizadas para comprovar que são realmente exclusivamente líticos, já que muitos não apresentam seu genoma completo e mais de 50% dos genes anotados não têm função definida. / serious problem that needs to be faced, either through the discovery of new antimicrobial substances, natural or synthetic, or by searching for alternative therapies that are affordable. The phage therapy is one of those alternatives. It is a form of biological control based on specific viruses that infect and kill bacterial cells: the bacteriophages. However, this therapeutic source is still poorly explored. This study used the cultivation, isolation and sequencing of the genome, as well as high-performance genomic techniques to isolate and characterize the genome of specific bacteriophages for enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893, for the understanding and the definition of the infection cycle (lytic or lysogenic) of these viruses. The methodology used in this study allowed the isolation of 12 viruses. 8 different viral strains had their genetic material extracted and purified, with good yield and reduced amount of contaminating bacterial DNA. The sequencing of the genome of these 8 viruses was conducted using the new generation MiSeq platform. The the genetical diversity of these bacteriophages was analyzed and it was found that the viruses belong to the Caudovirales order, which 2 belong to the Siphoviridae family and 6 to the Myoviridae family. Only one of them showed the potential to have lysogenic cycle, the other seven viruses contained no gene to suggest that. However, despite the isolated bacteriophages have not presented genes related to lysogenic cycle, further analysis should be conducted to demonstrate that they are really exclusively lytic, since many do not have their genome completed and more than 50% of the annotated genes have no defined function.