O cancro bacteriano, causado por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), é uma das doenças mais importantes da cultura do tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), especialmente para tomateiros estaqueados. O controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Os objetivos desta tese foram determinar um método de inoculação adequado à seleção de genótipos de tomateiro resistentes ao cancro bacteriano; avaliar a reação de genótipos de tomateiro à inoculação com Cmm; e avaliar o efeito de acibenzolar-S-metil e outros produtos fitossanitários no controle da doença. Para o ensaio de metodologia, foram avaliados quatro métodos de inoculação (aspersão de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; aspersão, sob pressão, de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; corte do sistema radicular, com tesoura, seguido de imersão na suspensão bacteriana; e ferimento na haste com alfinete entomológico transpassando uma gota de suspensão de inóculo depositada na axila foliar) e três concentrações de inóculo (108 ufc/mL, 107 ufc/mL e 106 ufc/mL). Posteriormente, foi avaliado o efeito da inoculação em plantas com diferentes idades, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a emergência. Foram utilizados os genótipos Kadá e Rotam-4 e um isolado bacteriano proveniente de Bragança Paulista, SP. A avaliação foi realizada através de uma escala descritiva, atribuindo-se notas que foram convertidas em índice de murcha bacteriana. A inoculação de Cmm, quatorze dias após a emergência das plantas, através da aspersão de suspensão bacteriana (108 ufc/mL) na face inferior das folhas, com avaliação aos 30 dias após inoculação, foi a metodologia mais apropriada para a avaliar a reação de genótipos de tomateiro. Estabelecida a metodologia, foram avaliados dez genótipos comerciais de tomateiro (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Júpiter, Olimpo, Fanny, Jumbo e Densus) para identificação de materiais resistentes ao cancro bacteriano, tendo-se Kadá e Rotam-4 como controles suscetível e resistente, respectivamente. Alambra e Jumbo apresentaram comportamento semelhante a Rotam-4, sendo materiais promissores para o plantio em áreas com histórico de ocorrência da doença. Para a avaliação de controle do cancro bacteriano foram testados os seguintes produtos: acibenzolar-S-metil (ASM), ASM + mancozeb, ASM + oxicloreto de cobre, mancozeb + oxicloreto de cobre, e oxitetraciclina. Três esquemas de aplicação dos produtos foram adotados: (E1) 4 aplicações (a primeira e a segunda realizadas seis e três dias antes da inoculação; a terceira e a quarta, aos três e seis dias após a inoculação); (E2) apenas as duas aplicações préinoculação; (E3) apenas as duas aplicações pós-inoculação. Esses produtos foram incorporados a meio de cultura para avaliação in vitro de seus efeitos sobre Cmm. Independente da forma de aplicação, o ASM, isolado ou em mistura com fungicidas, proporcionou reduções significativas na severidade da doença e não inibiu o desenvolvimento da bactéria in vitro. / Bacterial canker, caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), is one of the most important diseases of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Its control is based on a set of preventive measures, once there is a few information about resistant materials and the chemical control is not efficient. The objectives of this thesis were to determine a suitable inoculation methodology to bacterial canker resistance studies; to evaluate the reaction of commercial tomato genotypes to the inoculation with Cmm; and to evaluate the acibenzolar-S-methyl and other phytossanitary products effects on the control of that disease. To methodology trial, four inoculation methods were evaluated, including foliar pulverization with bacterial suspension; foliar pulverization under pressure with bacterial suspension; cutting of roots with scissor, followed by their immersion in bacterial suspension; and stem wounding with a pin passing over a drop of inoculum suspension deposited on the insertion point of leaf. Besides the inoculation methods, three inoculum concentrations were investigated: 108 cfu/mL; 107 cfu/mL and 106 cfu/mL. Later, it was evaluated the effect of inoculation on plants with different ages: 7, 14, 21 and 28 days after emergency. To those trials, genotypes Kadá and Rotam-4, and a bacterial isolate from Bragança Paulista, SP, were employed. The evaluation was accomplished through a descriptive scale, being attributed notes that were turned into bacterial wilt index. Inoculation of Cmm, fourteen days after emergency of plants, through aspersion with bacterial suspension (108 cfu/mL) over the inferior face of leaves, and evaluation 30 days after inoculation, was the most appropriated methodology to evaluate resistance to bacterial canker in tomato genotypes. After the establishment of the inoculation methodology, ten commercial tomato genotypes (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Jupiter, Olimpo, Fanny, Jumbo and Densus) were investigated to identify resistant materials to the bacterial canker. Kadá and Rotam-4 were employed as susceptible and resistant controls, respectively. Alambra and Jumbo had a similar behavior to Rotam-4, being the most promising materials for the planting in areas with report of occurrence of bacterial canker. To evaluate the bacterial canker control following products were tested: acibenzolar-S-methyl (ASM), ASM + mancozeb, ASM + copper oxicloride, mancozeb + copper oxicloride, and oxytetracycline. Three schemes of application of the products were adopted: (E1) 4 applications (first and second ones were accomplished six and three days before inoculation; third and fourth ones, three and six days after inoculation); (E2) two applications before inoculation only; (E3) two applications after inoculation only. The effect in vitro of these products on Cmm was also evaluated. ASM, isolated or in mixture with fungicides, provided significant reductions in the disease severity independent of the scheme of application and had no effect on bacterial development in vitro.

A cana-de-açúcar (S. officinarum) é uma gramínea perene de grande importância na economia brasileira. Devido a isto, estudos relativos ao aprimoramento das condições de cultivo são de grande interesse, podendo ser uma destas bases um melhor conhecimento sobre as comunidades microbianas associadas à cana-de-açúcar. Sabe-se que a rizosfera é um ambiente de íntima interação entre as plantas e seus respectivos microbiomas, sendo esta relação intermediada pela exsudação radicular. Este estudo teve como objetivo realizar o cultivo de bactérias da rizosfera e do solo de cana-de-açúcar, sendo os isolados obtidos posteriormente caracterizados genética (BOX-PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA) e metabolicamente (BIOLOG®). Os resultados demonstraram que o número de bactérias cultiváveis na rizosfera é maior comparado ao solo, sendo que dentre os isolados destaca-se a maior afiliação taxonômica ao filo Proteobacteria (principalmente as classes γ-proteobacteria e β- proteobacteria). A análise de BOX-PCR mostrou uma grande diversidade genética, mesmo quando comparados isolados obtidos a partir do mesmo meio de cultivo, ou pertencentes ao mesmo grupo taxonômico. Em contrapartida, a análise de sequenciamento parcial do gene 16S rRNA mostrou que muitos isolados preservam grande similaridade do gene ribossomal analisado. A análise de perfil metabólico corroborou com os dados de BOX-PCR, onde isolados com afiliação taxonômica bastante correlata apresentaram capacidades distintas de utilizar as diversas fontes de carbono avaliadas. Por fim, esta diversidade metabólica se traduziu na obtenção de respostas distintas de isolados pertencentes aos mesmos gêneros bacterianos, isolados do solo ou da rizosfera, quando estes foram cultivados na presença de exsudatos radiculares. De maneira geral, este estudo demonstrou que as plantas de cana-de-açúcar podem influenciar o comportamento das comunidades bacterianas presentes no solo, e indicaram que existe uma grande diversificação dos organismos presentes na rizosfera, sendo a resposta a este ambiente diferenciada de forma independente da afiliação taxonômica dos isolados. / The sugarcane plant (S. officinarum) is a perennial gamineous with a great importance for the Brazilian economy. Due to this, studies related to the improvement of cultivation conditions are of great importance, indicating that one of these bases must contribute with the better knowledge about the microbial communities associated with sugarcane. It is known that the rhizosphere is an environment that hosts an intimate interaction between plants and their respective microbiomes, being it mediated by the roots exudates. This study aimed to cultivate bacterial isolates from soil and rhizosphere of sugarcane, followed by the genetic (BOX-PCR and partial sequencing of the 16S rRNA gene) and metabolic (BIOLOG®) characterization of them. Results demonstrated higher numbers of cultivable bacteria in rhizosphere when compared to soil samples, with the prevalent affiliation of the isolates to the phylum Proteobacteria (specially with the classes γ-proteobacteria and β- proteobacteria). The BOX-PCR results showed a great genetic diversity, even when isolates obtained in the same culture medium or affiliated to the same taxa are compared. In counterpart, the analysis of the 16S rRNA gene sequence indicated that several isolates preserve high similarities in the ribosomal gene. The metabolic profiling results corroborated with the BOX-PCR data, which isolates highly correlated in the taxonomical analyses presented distinct capacities to use the carbon sources that were tested. At the end, this metabolic diversity was evidenced by the distinct behavior of isolates belonging to the same genera, isolated from soils or rhizosphere samples as well, when cultivated in the presence of roots exudates. In general, this study demonstrated that sugarcane plants can influence the behavior of bacterial communities present in soils, and indicated a great diversification of organisms present in the rhizosphere being the response to this environment very particular, regardless of the taxonomical affiliation of the isolates.

O biofilme bacteriano é o agente etiológico primário no desenvolvimento da resposta inflamatória observada na doença periodontal. Os receptores do tipo NOD (NLRs) são proteínas citosólicas que reconhecem componentes microbianos presentes no citoplasma liberados por bactérias invasoras. Sabendo que bactérias periodontopatogênicas têm a capacidade de invadir e colonizar diversas células do tecido periodontal, o presente projeto tem o objetivo de estudar a participação dos receptores do tipo NOD (NOD1 e NOD2) no reconhecimento das bactérias Porphyromonas gingivalis, na modulação da resposta imune e no processo de reabsorção óssea. Camundongos isogênicos machos da linhagem C57BL/6 (WT) e camundongos deficientes para o receptor NOD1 (NOD1-/-) e receptor NOD2 (NOD2-/-) foram infectados com Phorphyromonas gingivalis utilizando um modelo experimental de doença periodontal. O grau de reabsorção óssea foi avaliado por análise morfométrica macroscópica e histológica da maxila, além da quantificação do número de osteoclastos na crista óssea alveolar. O grau de inflamação local foi realizado por contagem do número total de bactérias orais, quantificação de neutrófilos no tecido gengival (MPO) e avaliação dos mediadores inflamatórios por ELISA. Foi também avaliada a expressão de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos no tecido gengival pela técnica de qPCR. Animais NOD1-/- e NOD2-/- apresentaram menor delta de reabsorção óssea quando comparados aos animais WT. Animais NOD2-/- infectados apresentaram debilitado controle bacteriano quando comparados aos animais WT infectados. Animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados apresentaram baixa expressão de Cxcl1 e MPO quando comparados aos animais WT infectados. Além disso, foi observado que animais NOD2-/- infectados apresentaram reduzida produção de TNF-α e elevada produção de IL-10 quando comparados aos animais WT infectados. Não foi detectado diferença estatística na expressão de fatores osteogênicos, Runx2 e osteocalcina, entre animais WT, NOD1-/- e NOD2-/- infectados. Embora não houve diferença no número de células TRAP positivas presentes na crista óssea alveolar entre os grupos no tempo avaliado, animais WT infectados apresentaram elevada expressão gênica de RANKL/OPG quando comparados aos animais NOD2-/- infectados. Além disso, a expressão de marcadores de atividades dos osteoclastos, catepsina k e matrix metaloproteinase-9, foi significantemente baixa nos animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados quando comparados aos animais WT infectados. Esses resultados permitem sugerir que independente das variáveis observadas, verificamos que a ausência dos dois receptores impede a rápida progressão da reabsorção óssea alveolar observada na periodontite, portanto os receptores NOD1 e NOD2 contribuem para progressão da reabsorção óssea no modelo experimental de periodontite. / The bacterial biofilm has been identified as an etiological agent in the pathogenesis of periodontal disease. The NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins that sense microbial by products released by invasive bacteria. Since periodontopathogenic bacteria are able to invade and colonize some periodontal tissue cells, the purpose of this study is to determine the role of NOD1 and NOD2 receptors in the recognition of invasive periodontopathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, modulating the immune response and bone resorption. Isogenic strain C57BL/6 males (WT), NOD1 (NOD1-/-) and NOD2 (NOD2-/-) knockout mice were infected with Porphyromonas gingivalis in an experimental model of periodontal disease. Alveolar bone resorption was evaluated by macroscopic and histological morphometric analysis, quantification of osteoclasts numbers in bone crest alveolar. Imune inflammatory response was evaluated by, bacterial load, neutrophils quantification and inflammatory mediators levels by ELISA. We also evaluated the osteogenic and osteoclastogenic markers expression in gingival tissue by Real time PCR techniques. NOD1-/- and NOD2-/- animals showed lower bone resorption when compared to WT animals. NOD2-/- infected animals expressed higher bacterial load compared to WT infected ones. NOD1-/- and NOD2-/- infected animals presented lower Cxcl1 and MPO levels compared to WT infected animals. In addition, NOD2-/- infected animals presented lower level of TNF-α and higher level of IL-10 when compared to WT infected animals. There was no significant difference in the osteogenic factors expression, Runx2 and osteocalcin, when compared NOD1-/- and NOD2-/- infected animals to WT infected ones. Although there was no difference in TRAP-positive cells number evaluated in the alveolar bone crest among the studied groups, WT infected animals showed elevated ratio RANKL/OPG when compared to NOD2-/- infected animals. Moreover, the expression of osteoclasts activity markers, cathepsin k and matrix metalloproteinase-9, was significantly lower in NOD1-/- and NOD2-/- infected animals compared to WT infected ones. These results suggest that NOD1 and NOD2 receptors contribute to progression of bone resorption in experimental model of periodontitis, since the lack of NOD like receptors impair the bone resorption.

O biofilme bacteriano é o agente etiológico primário no desenvolvimento da resposta inflamatória observada na doença periodontal. Os receptores do tipo NOD (NLRs) são proteínas citosólicas que reconhecem componentes microbianos presentes no citoplasma liberados por bactérias invasoras. Sabendo que bactérias periodontopatogênicas têm a capacidade de invadir e colonizar diversas células do tecido periodontal, o presente projeto tem o objetivo de estudar a participação dos receptores do tipo NOD (NOD1 e NOD2) no reconhecimento das bactérias Porphyromonas gingivalis, na modulação da resposta imune e no processo de reabsorção óssea. Camundongos isogênicos machos da linhagem C57BL/6 (WT) e camundongos deficientes para o receptor NOD1 (NOD1-/-) e receptor NOD2 (NOD2-/-) foram infectados com Phorphyromonas gingivalis utilizando um modelo experimental de doença periodontal. O grau de reabsorção óssea foi avaliado por análise morfométrica macroscópica e histológica da maxila, além da quantificação do número de osteoclastos na crista óssea alveolar. O grau de inflamação local foi realizado por contagem do número total de bactérias orais, quantificação de neutrófilos no tecido gengival (MPO) e avaliação dos mediadores inflamatórios por ELISA. Foi também avaliada a expressão de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos no tecido gengival pela técnica de qPCR. Animais NOD1-/- e NOD2-/- apresentaram menor delta de reabsorção óssea quando comparados aos animais WT. Animais NOD2-/- infectados apresentaram debilitado controle bacteriano quando comparados aos animais WT infectados. Animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados apresentaram baixa expressão de Cxcl1 e MPO quando comparados aos animais WT infectados. Além disso, foi observado que animais NOD2-/- infectados apresentaram reduzida produção de TNF-α e elevada produção de IL-10 quando comparados aos animais WT infectados. Não foi detectado diferença estatística na expressão de fatores osteogênicos, Runx2 e osteocalcina, entre animais WT, NOD1-/- e NOD2-/- infectados. Embora não houve diferença no número de células TRAP positivas presentes na crista óssea alveolar entre os grupos no tempo avaliado, animais WT infectados apresentaram elevada expressão gênica de RANKL/OPG quando comparados aos animais NOD2-/- infectados. Além disso, a expressão de marcadores de atividades dos osteoclastos, catepsina k e matrix metaloproteinase-9, foi significantemente baixa nos animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados quando comparados aos animais WT infectados. Esses resultados permitem sugerir que independente das variáveis observadas, verificamos que a ausência dos dois receptores impede a rápida progressão da reabsorção óssea alveolar observada na periodontite, portanto os receptores NOD1 e NOD2 contribuem para progressão da reabsorção óssea no modelo experimental de periodontite. / The bacterial biofilm has been identified as an etiological agent in the pathogenesis of periodontal disease. The NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins that sense microbial by products released by invasive bacteria. Since periodontopathogenic bacteria are able to invade and colonize some periodontal tissue cells, the purpose of this study is to determine the role of NOD1 and NOD2 receptors in the recognition of invasive periodontopathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, modulating the immune response and bone resorption. Isogenic strain C57BL/6 males (WT), NOD1 (NOD1-/-) and NOD2 (NOD2-/-) knockout mice were infected with Porphyromonas gingivalis in an experimental model of periodontal disease. Alveolar bone resorption was evaluated by macroscopic and histological morphometric analysis, quantification of osteoclasts numbers in bone crest alveolar. Imune inflammatory response was evaluated by, bacterial load, neutrophils quantification and inflammatory mediators levels by ELISA. We also evaluated the osteogenic and osteoclastogenic markers expression in gingival tissue by Real time PCR techniques. NOD1-/- and NOD2-/- animals showed lower bone resorption when compared to WT animals. NOD2-/- infected animals expressed higher bacterial load compared to WT infected ones. NOD1-/- and NOD2-/- infected animals presented lower Cxcl1 and MPO levels compared to WT infected animals. In addition, NOD2-/- infected animals presented lower level of TNF-α and higher level of IL-10 when compared to WT infected animals. There was no significant difference in the osteogenic factors expression, Runx2 and osteocalcin, when compared NOD1-/- and NOD2-/- infected animals to WT infected ones. Although there was no difference in TRAP-positive cells number evaluated in the alveolar bone crest among the studied groups, WT infected animals showed elevated ratio RANKL/OPG when compared to NOD2-/- infected animals. Moreover, the expression of osteoclasts activity markers, cathepsin k and matrix metalloproteinase-9, was significantly lower in NOD1-/- and NOD2-/- infected animals compared to WT infected ones. These results suggest that NOD1 and NOD2 receptors contribute to progression of bone resorption in experimental model of periodontitis, since the lack of NOD like receptors impair the bone resorption.

O uso de bactérias promotoras de crescimento vegetal ou agentes de biocontrole como inoculantes agrícolas é uma alternativa importante e ecologicamente correta, com grandes benefícios na agricultura para substituir, ou ao menos suplementar, a excessiva utilização de fertilizantes e pesticidas. Neste trabalho avaliamos a capacidade de biocontrole e de competência rizosférica de três bactérias com características de promoção de crescimento vegetal (Plant growth promoting - PGP): Bacillus mycoides B38V, Paenibacillus riograndensis SBR5 e Burkholderia sp. 89. As três bactérias avaliadas apresentaram grande versatilidade na utilização de substratos, o que poderia lhes garantir uma vantagem competitiva no ambiente rizosférico. Porém, inconsistências foram observadas nos ensaios em câmara de crescimento, ou seja, as características de PGP e de biocontrole observadas in vitro não se refletiram em benefícios para a planta. A linhagem 89 destacou-se pela produção de um metabólito estável com ampla atividade contra fungos fitopatogênicos. Através de abordagens genômicas e de análises multilocus, descrevemos Burkholderia sp. 89 como uma nova espécie membro do complexo Burkholderia cepacia, denominada de B. catarinensis 89T. O sequenciamento de seu genoma, seguido de uma análise pela ferramenta AntiSMASH, revelou a presença de um agrupamento gênico de peptídeo sintetases não ribossomais (NRPS) relacionadas com a biossíntese do sideróforo ornibactina e um agrupamento híbrido NRPS-policetídeo sintetase responsável pela biossíntese do glicolipopeptideo cíclico com atividade antifúngica burkholdina. Como estratégia de purificação de metabólitos secundários foi utilizada a metodologia da mineração de genoma combinada com fracionamento guiado por bioensaios seguida de análises em espectrômetro de massas. Desta forma, purificamos com sucesso duas variantes de ornibactina, D e F (761 e 789 Da, respectivamente), e detectamos a variante ornibactina B (m/z= 733) e as moléculas sinalizadoras homoserina lactonas C6-HSL, 3OH-C8-HSL e C8-HSL. Análises de espectrometria de massas demonstraram a presença de um grupo de metabólitos com massas de 1240, 1254, 1268, 1216, 1244 e 1272 Da, que, provavelmente, são novas variantes do antifúngico burkoldina. Sendo assim, B. catarinensis 89T possui potencial biotecnológico com possíveis aplicações farmacêuticas e agronômicas para o biocontrole de fungos fitopatogênicos. / The use of plant growth promotion bacteria or biocontrol agents as agricultural inoculants is an important eco-friendly alternative to substitute, or at least supplement, the excessive use of fertilizers and pesticides. In this work, we evaluated the biocontrol potential and rhizosphere competence of three bacteria that had shown plant growth promotion (PGP) abilities: Bacillus mycoides B38V, Paenibacillus riograndensis SBR5 and Burkholderia sp. 89. All three bacteria presented great versatility in their substrate utilization, which could enable them to survive in a competitive rhizosphere environment. However, inconsistencies were observed in the greenhouse experiments, whereas their interesting abilities observed in vitro did not result in benefits to the plants. Strain 89 produces a stable metabolite with a wide range of antifungal activity. Genomic comparisons and multilocus sequence analysis revealed Burkholderia sp. 89 as a new species of the Burkholderia cepacia complex and we described it as B. catarinensis 89T. We sequenced its genome and analyzed it with the AntiSMASH tool. This in silico prediction revealed the presence of a nonribosomal peptide synthetase (NRPS) cluster, which is related to the production of the siderophore ornibactin. Moreover, a hybrid NRPS- polyketide synthetase cluster for the production of the antifungal cyclic glicolipopeptide burkholdin was also found. A genome mining combined with a bioassay-guided fractionation with further mass spectrometry analysis was applied for the purification of these compounds. This approach enabled us to purify and characterize two variants of the siderophore ornibactin, D and F (761 and 789 Da, respectively). Also, we could detect the variant ornibactin B (m/z= 733) and the quorum sensing molecules homoserine lactones C6-HSL, 3OH-C8-HSL and C8-HSL in the supernatant of B. catarinensis 89T. Mass spectrometry analysis showed the presence of a group of metabolites with the masses 1240, 1254, 1268, 1216, 1244 and 1272 Da, which are probably new variants of the antifungal metabolite burkoldin. Therefore, B. catarinensis 89T has a great biotechnological potential for the production of metabolites with pharmaceutical and agricultural applications for the biocontrol of phytopathogenic fungi.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-21T11:44:06Z No. of bitstreams: 1 Ana Rosa Peixoto Nascimento.pdf: 846418 bytes, checksum: 7dd326913edffe1dc94410cf6178eac6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-21T11:44:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Rosa Peixoto Nascimento.pdf: 846418 bytes, checksum: 7dd326913edffe1dc94410cf6178eac6 (MD5) Previous issue date: 2005-02-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Submédio São Francisco is the main producting and exporting region of table grapes in Brazil, where the cultivated area with this fruit crop has been significantly expanded in the last years. However, the intensification of grape production, the use of susceptible cultivars, and the favorable environmental conditions of that region allowed the occurrence of disease and pest problems, with emphasis for the bacterial canker (Xanthomonas campestris pv. viticola - Xcv). Reported for the first time in Brazil, in plantations of the Submédio São Francisco in 1998, the canker is the most important bacterial disease of grapevine in that region. The present work aimed to study: methods of preservation and pathogen growth at different temperatures, pHs and NaCl concentrations; elaboration and validation of a diagramatic key for bacterial canker; and the reaction of grapevine varieties to the pathogen, based on the disease epidemiological components. The preservation methods: dried paper strips (DPS), periodic transfer (PT), sterile distiled water (SDW) and dried leaves (DL) were utilised for storing two Xcv strains during 12 months. The variables viability and pathogenicity were evaluatedmonthly and estimated by bacterial growth and area under disease incidence curve (AUDIC). Both the DPS and SDW methods maintained 100% of cell viability and showed higher AUDIC values during 11 months. PT did not permit growth at 30 days while DL allowed the pathogen isolation for 5 months. The influence of temperature (0, 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40 and 45°C), pH (5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5 and 9.0) and NaCl concentration (1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7%) on the growth of two Xcv strains was studied in NYD medium and evaluated in spectrophotometer. The minimum and maximum temperatures for Xcv growth were respectively 5 and 39°C, while the optimum growth was observed from 27 to 29°C. Xcv does not growth at 0 or 40°C. The optimum pH for Xcv growth ranged from 7.0 to 7.5. The pathogen growth declined from 3.0 % NaCl and was null at 6.0 %. Aiming to standardize methods to quantify bacterial canker severity a diagrammatic key was elaborated including the levels 2, 4, 8, 17, 34, 63 and 91% of diseased leaf area. To validate the diagrammatic key, 50 leaves with different levels of severity, previously measured by the softwareAutoCAD®, were evaluated by 10 raters with and without the use of the key. Two evaluations were performed with the key at 7-day intervals when different sequences of the same leaves were visually estimated by the same raters. The accuracy and precision of each rater were determined by simple linear regression between actual and estimated severity. Without the key, most of the raters overestimated disease severity. With the key raters obtained better levels of accuracy and precision; however, all tended to underestimate severity, with absolute errors concentrated around 10%. Raters showed good repeatability and high reproducibility of estimative by using the key compared to not using it. The reaction of 20 grapevine varieties, 13 scions and seven rootstocks, was evaluated in relation to disease resistance under greenhouse conditions. Plants were inoculated with a suspension of the strain Xcv1 (A570 = 108 CFU mL-1), incubated in a greenhouse and observed daily for epidemiological components of bacterial canker: incubation period (PI), incidence of leaves with symptoms (INC), incidence of leaves with canker (IFC), disease severity (SEV), progress rate of disease incidence (TPID), area under the disease severity progress curve (AACPSD). All varietieswere susceptible to the pathogen, although there were significant differences among them (P=0.05) for most of the analyzed variables. ‘Brasil’ showed the highest disease levels for all variables tested, while ‘Isabel’ and ‘Paulsen 1103’ presented the highest values of PI and the lowest values of INC, IFC, SEV, TPID and AACPSD, suggesting the potential of those varieties in programs of genetic breeding and integrated management of grapevine bacterial canker. The studied variables might be utilized in research including reaction of varieties to this disease. Considering all the epidemiological components, the analysis of the Euclidean distance by UPGMA allowed the separation of scion and rootstock varieties into three similarity groups each. / O Submédio São Francisco é o principal centro produtor e exportador de uvas de mesa do Brasil, onde a área plantada com esta cultura tem se expandido significativamente, nos últimos anos. No entanto, a intensificação do cultivo da videira, o plantio de variedades suscetíveis, além das condições climáticas prevalentes na região propiciam o surgimento de problemas fitossanitários, entre os quais se destaca o cancro bacteriano (Xanthomonas campestris pv. viticola - Xcv). Detectado pela primeira vez no Brasil, em parreirais do Submédio São Francisco, em 1998, o cancro é a doença bacteriana mais importante da videira na região. No presente trabalho foram estudados: métodos de preservação e o crescimento do patógeno em diferentes temperaturas, pHs e concentrações de NaCl; elaboração e validação de uma escala diagramática para cancro bacteriano; e reação de variedades de videira ao patógeno, baseada nos componentes epidemiológicos da doença. Os métodos dessecação em papel de filtro (DPF), repicagens periódicas (RP), água destilada esterilizada (ADE) e folhas herborizadas (FH) foramutilizados para preservar dois isolados de Xcv (Xcv1 e Unb1216) durante 12 meses. As variáveis viabilidade e patogenicidade foram avaliadas mensalmente e estimadas pela obtenção de crescimento bacteriano e área abaixo da curva de incidência da doença (AACID). Tanto o método DPF como ADE propiciaram viabilidade constante de 100 % durante 11 meses e os maiores valores de AACID. No método RP não se observou crescimento dos isolados aos 30 dias, enquanto que, em FH, Xcv foi isolada até cinco meses. Os efeitos da temperatura (0, 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40 e 45°C), pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 e 9,0) e concentração de NaCl (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7%) sobre o crescimento de dois isolados de Xcv em meio de cultura NYD foram estudados sendo que o crescimento foi avaliado em fotocolorímetro. As temperaturas mínima e máxima para o crescimento de Xcv foram respectivamente 5 e 39°C, enquanto que um crescimento ótimo foi observado no intervalo de 27 a 29°C. Xcv não cresce a 0 e 40°C. A faixa de pH ótima para o crescimento desta bactéria é de7,0 a 7,5. O crescimento de Xcv foi reduzido a partir de 3,0 % de NaCl, sendo o nível de 6,0 % letal para essa bactéria. Para padronizar métodos de quantificação da severidade do cancro bacteriano, foi elaborada uma escala diagramática com níveis de 2, 4, 8, 17, 34, 63 e 91% de área foliar lesionada. Navalidação da escala diagramática, 50 folhas com diferentes níveis de severidade da doença, mensurados previamente com o programa AutoCAD®, foram avaliadas por 10 pessoas sem e com a utilização da escala. Foram realizadas duas avaliações com utilização da escala com intervalo de sete dias, onde seqüências diferentes das mesmas folhas foram estimadas visualmente pelos mesmos avaliadores. A acurácia e a precisão de cada avaliador foram determinadas por regressão linear simples, entre a severidade real e a estimada. Sem a escala, a maioria dos avaliadores superestimou a severidade da doença. Com a escala, os avaliadores obtiveram melhores níveis de acurácia e precisão, embora tendessem a subestimar a severidade com erros absolutos concentrando-se na faixa de 10%. Os avaliadores apresentaram boa repetibilidade e elevada reprodutibilidade das estimativas com utilização da escala, o mesmo não sendo verificado sem a utilização desta. A reação de 20 variedades de videira, sendo 13 de copa e sete de porta-enxerto, foi avaliada quanto à resistência à doença, em casa de vegetação. As plantas foram inoculadas com a suspensão do isolado Xcv1 (A570 = 0,4 correspondente a108 UFC mL-1), incubadas em casa de vegetação e observadas diariamente quanto aos componentes epidemiológicos do cancro bacteriano: período de incubação (PI), incidência de folhas com sintomas (INC), incidência de folhas com cancro (IFC), severidade da doença (SEV), taxa de progresso da incidência da doença (TPID), área abaixo da curva de progresso da severidade da doença (AACPSD). Todas as variedades foram suscetíveis ao patógeno, embora diferindo significativamente entre si (P=0,05) para a maioria das variáveis analisadas. Em geral, ‘Brasil’ apresentou os maiores níveis de doença para todas as variáveis testadas, enquanto ‘Isabel’ e ‘Paulsen 1103’ destacaram-se ao propiciarem os maiores valores de PI e os menores valores de INC, IFC, SEV, TPID e AACPSD, indicando o potencial dessas para utilização em programas de melhoramento genético e de manejo integrado do cancro bacteriano da videira. As variáveis estudadas podem ser utilizadas em pesquisas envolvendo reação de variedades ao cancro bacteriano da videira. Quando considerado o conjunto doscomponenetes epidemiológicos, a análise da distância Euclidiana por UPGMA permitiu a separação das variedades de copa e porta-enxerto em três grupos de similaridade cada.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-21T13:25:13Z No. of bitstreams: 1 Carine Rosa Naue.pdf: 1778234 bytes, checksum: 87c8b0b79d12b0deec69551209abe1ed (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-21T13:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carine Rosa Naue.pdf: 1778234 bytes, checksum: 87c8b0b79d12b0deec69551209abe1ed (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The introduction and spread of grapevine bacterial canker caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) occurs, among other ways, through plantlets, grapevine cuttings and farming tools. This study aimed to: evaluate the effectiveness of treatments of cuttings to eradicate Xcv using thermotherapy, bactericides and sanitizers; prove the survival of Xcv into thinning shears; and select efficient sanitizers for disinfection of these tools and water used in the production of plantlets. In the first study, the Xcv isolates were tested for pathogenicity and "in vitro" sensitivity to bactericides and sanitizers (streptomycin+oxytetracycline, oxytetracycline+copper sulfate, kasugamycin and oxytetracycline; dodecyldimethyl ammonium chloride, sodium hypochlorite and benzalkonium chloride) at different concentrations. The eradication of Xcv on cuttings was tested in experiments with thermotherapy (50˚C for 30 and 40 min; 53˚C for 5 and 10 min); bactericides oxytetracycline+copper sulphate (150+2000, 165+2200, 180+2400 and 195+2600 mg L-1 of H2O) and oxytetracycline (600, 700, 800 and 900 mg L-1) and sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride (600, 1200, 1800, 2400, 3000 μl L-1) sodium hypochlorite (5000, 10000, 20000, 30000, 40000 μl L-1) and benzalkonium chloride (125, 167, 250, 334, 500 μl L-1). The bactericidal oxytetracycline and sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride and sodium hypochlorite provided the largest zones of inhibition, in vitro. However, it was not possible to recommend an efficient treatment of temperature/time, and concentrations of bactericides or sanitizers, among those tested, capable of eradicating Xcv of infected grapevine cuttings. In the second study, survival was evaluated 0-42 h after dipping the scissors in pathogen suspension. In vitro susceptibility test and initial selection in scissors were performed with the sanitizers dodecyldimethyl ammonium chloride (1200 μl L-1), sodium hypochlorite (20000 μl L-1), benzalkonium chloride (250 μl L-1), sodium dichloroisocyanurate (16.25 mg L-1), calcium hypochlorite (130 mg L-1), calcium oxychloride (97.5 mg L-1) and chlorine dioxide (25 μl L-1). To validate the efficiency of sanitizers for disinfection of scissors the first two products were tested at the same concentrations, and 50 cuts were sequentially made in vine leaves. The controls only with Xcv allow verifying the dissemination ability of Xcv from an inoculum source. The viability of the same sanitizers was studied 0-8 h after solution preparation. Disinfection of water contaminated with Xcv was tested with two bactericidal and three sanitizers. Xcv survived 24 h in thinning shears. Sodium hypochlorite (20000 μl L-1) and dodecyldimethyl ammonium chloride (1200 μl L-1) provided the greatest inhibition halos and disinfested scissors contaminated with Xcv. Solutions of these sanitizers remained viable for 8 h. Xcv was spread by contaminated thinning shears, on average, until the 24th cut. Disinfestation of the water contaminated with Xcv utilized in the plantlets production was obtained by dodecyldimethyl ammonium chloride (600 μl L-1), sodium hypochlorite (5000 μl L-1) and benzalkonium chloride (250 μl L-1). / A introdução e a disseminação do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) ocorre, dentre outras formas, por meio de mudas, bacelos e ferramentas de cultivo. Este trabalho teve como objetivos: avaliar a eficiência dos tratamentos de bacelos de videira para erradicação de Xcv utilizando termoterapia, bactericidas e sanitizantes; comprovar a sobrevivência de Xcv em tesouras de raleio; e selecionar sanitizantes eficientes para a desinfestação destas ferramentas e da água utilizada na produção de mudas. No primeiro trabalho, os isolados de Xcv foram testados quando à patogenicidade e realizado o teste de sensibilidade “in vitro” a bactericidas e sanitizantes (oxitetraciclina+estreptomicina, oxitetraciclina+sulfato de cobre, casugamicina e oxitetraciclina; cloreto de dodecildimetil amônio, hipoclorito de sódio e cloreto de benzalcônio) em diferentes concentrações. A erradicação de Xcv em bacelos de videira foi testada em experimentos com termoterapia (50oC por 30 e 40 min; 53oC por 5 e 10 min); bactericidas [oxitetraciclina+sulfato de cobre (150+2000, 165+2200, 180+2400 e 195+2600 mg L-1 de H2O) e oxitetraciclina (600, 700, 800 e 900 mg L-1)]; e sanitizantes [cloreto de dodecildimetil amônio (600, 1200, 1800, 2400, 3000 μL L-1); hipoclorito de sódio (5000, 10000, 20000, 30000, 40000 μL L-1) e cloreto de benzalcônio (125, 167, 250, 334, 500 μL L-1)]. O bactericida oxitetraciclina e os sanitizantes cloreto de dodecildimetil amônio e hipoclorito de sódio proporcionaram os maiores halos de inibição, in vitro. No entanto, não foi possível recomendar um tratamento termoterápico, bactericida ou sanitizante, dentre os testados, capaz de erradicar Xcv de bacelos de videira infectados. No segundo trabalho, a sobrevivência foi avaliada de 0 a 42 h após imersão das tesouras em suspensão do patógeno. Teste de sensibilidade de Xcv in vitro e seleção inicial em tesouras foram realizados com os sanitizantes cloreto de dodecildimetil amônio (1200 μl L-1), hipoclorito de sódio (20000 μl L-1), cloreto de benzalcônio (250 μl L-1), dicloroisocianurato de sódio (16,25 mg L-1), hipoclorito de cálcio (130 mg L-1), oxicloreto de cálcio (97,5 mg L-1) e dióxido de cloro (25 μl L-1). Para validação da eficiência dos sanitizantes na desinfestação de tesouras, os dois primeiros produtos foram testados nas mesmas concentrações, sendo realizados 50 cortes sequenciais, em folhas de videira. A testemunha com Xcv permitiu verificar a capacidade de disseminação de Xcv a partir da fonte de inóculo. A viabilidade dos sanitizantes foi estudada de 0 a 8 h após o preparo das soluções. Para desinfestação de água contaminada com Xcv foram testados 2 bactericidas e três sanitizantes. Xcv sobreviveu 24 h em tesouras de raleio. Hipoclorito de sódio (20000 μl L-1) e cloreto de dodecildimetil amônio (1200 μl L-1) proporcionaram os maiores halos de inibição e desinfestaram tesouras contaminadas com Xcv. As soluções destes sanitizantes mantiveram-se viáveis por 8 h. Xcv foi disseminada por tesouras de raleio contaminadas, em média, até o 24o corte. A desinfestação da água contaminada com Xcv utilizada na produção de mudas foi obtida pelo uso de cloreto de dodecildimetil amônio (600 μl L-1), hipoclorito de sódio (5000 μl L-1) e cloreto de benzalcônio (250 μl L-1).

As micobactérias não tuberculosas (NTM) podem ser encontradas em diversos ambientes, como solo, sistemas aquáticos naturais, sistemas de abastecimento de água potável e também em eucariotos. As micobactérias de crescimento rápido são um subgrupo de NTM que têm prevalência significativa em infecções relacionadas a traumas cutâneos, procedimentos cirúrgicos vídeo-assistidos e em infecções pulmonares, sendo Mycobacterium abscessus a espécie mais relevante desse grupo. Durante um pseudo-surto de infecções pulmonares pós-broncoscopia, ocorrido na cidade de São Paulo em 2007, cepas de M. abscessus subsp. bolletii (\"M. massiliense\") pertencentes ao clone epidêmico BRA100 foram detectadas em amostras coletadas do único broncoscópio usado e em amostras de lavado broncoalveolar. Todas as cepas, com exceção da F1660, apresentaram tolerância ao glutaraldeído, uma característica marcante do clone BRA100. Foi realizado o sequenciamento completo do genoma utilizando-se o sistema Illumina com metodologia de pares casados e as sequências obtidas foram comparadas, com enfoque na análise de genes potencialmente envolvidos na tolerância ao glutaraldeído. Encontramos em ambas as cepas cromossomos com 4,6 Mpb, com 64% de conteúdo GC. As sequências de nucleotídeos possuem 99% de identidade entre si. Ambos os cromossomos possuem 4.616 sequências codificantes de proteínas. Elementos de profago, como proteínas de bacteriófagos, estão presentes nos cromossomos. Bem como diversos genes associados à resistência a antibióticos e biocidas. Foram localizados operons mce, associados com a capacidade de sobrevivência em amebas e invasão de macrófagos e componentes da família T7SS, relacionadas à virulência em diversas espécies de micobactérias, como M. tuberculosis e também à transferência genética horizontal em M. smegmatis. Adicionalmente, foi detectada em ambas as cepas uma estrutura extracromossômica circular, de 97 Kbp, com 62,7% de conteúdo GC e 121 sequências codificantes. Embora a maioria das proteínas preditas tenha função desconhecida, foi possível encontrar um bloco de genes que pertencem ao sistema de secreção do tipo sete (T7SS), similar ao encontrado em plasmídeos de micobactérias de crescimento lento, sugerindo a troca de material genético entre essas espécies. Apenas na cepa tolerante ao glutaraldeído - F1725 - foi detectado um plasmídeo do grupo IncP, designado pBRA100, que contém genes que codificam resistência à kanamicina, amônio quaternário, sulfonamidas e estreptomicina, e um novo gene fosI, descrito neste estudo, que confere resistência à fosfomicina. Não foram encontradas nos cromossomos diferenças que possam justificar a tolerância ao glutaraldeído. A diferença marcante entre os dois genomas é a presença do plasmídeo pBRA100 na cepa tolerante ao glutaraldeído / Non-tuberculous mycobacteria (NTM) can be found in diverse environments as soil, water plant, natural water systems as well as in Eukaryotes. Among the NTM group, rapid growth mycobacteria (RGM) have a substantial prevalence in infections following cutaneous trauma, lung infection and after video assisted surgeries. Mycobacterium abscessus is considered to be the most relevant pathogen pertaining to the RGM group. During a pseudooutbreak of lung infections occurred in the city of São Paulo in 2007, strains from M. abscessus subsp. bolletii (\"M. massiliense\") pertaining to the BRA100 clone were detected in samples from the biopsy channel of the only bronchoscope in use as well as from bronchoalveolar lavage. All the strains but F1660 exhibited tolerance to glutaraldehyde, which is a remarking characteristic of the BRA100 clone. We report here the complete genome sequences for the strains F1725 and F1660, respectively tolerant and susceptible to glutaraldehyde. The genomes of both strains consist of a 4.6 Mpb chromosome with 4,616 coding sequences and high GC content of 64%. The chromosomes encode diverse proteins related to antibiotic and biocide resistance. Operons involved in virulence, as mce, are present as well as components from T7SS family, related to virulence in Mycobacterium tuberculosis and in horizontal gene transfer in M. smegmatis. Both strains harbored a circular extra-chromosomal structure, with T7SS system elements related to those found in plasmids from slow growing mycobacteria. It is circular, has 97 kbp and 121 open reading frames. Additionally, only F1725 strain has an IncP multidrug resistant plasmid, named pBRA100. It confers resistance to kanamycin, quaternary ammonium, sulfamethoxazole and streptomycin and also has new fosfomycin resistance gene fos I. No differences were found in the chromosomes that could justify tolerance to glutaraldehyde. The remarkable difference between the two genomes is the presence of plasmid pBRA100 in the glutaraldehyde tolerant strain

El fuego bacteriano, causado por Erwinia amylovora, es una enfermedad muy importante a nivel comercial y económico porque afecta a plantas de la familia de las rosáceas y es especialmente agresiva en manzano (Pyrus malus) y peral (Pyrus communis), así como en plantas ornamentales (Crataegus, Cotoneaster o Pyracantha). Esta enfermedad está distribuida por todo el mundo en zonas climáticas templadas de Amércia del Norte, Nueva Zelanda, Japón, Israel, Turquí y Europa. En España, el fuego bacteriano fue detectado por primera vez en 1995 en el norte del País (Euskadi) y más tarde en nuevos focos aparecidos en otras áreas. La enfermedad puede ser controlada comercialmente mediante la aplicación de pesticidas quimicos (derivados de cobre, antibioticos). Sin embargo, muchos de los productos químicos presentan baja actividad o causan fitotoxicidad, y la estreptomicina, el producto más eficaz, esta prohibido en muchos países, incluyendo España. Por tanto, en ausencia de apropiados agentes químicos, el control biológico se contempla como una buena alternativa. En el presente trabajo, un agente de control biológico, Pseudomonas fluorescens EPS62e, ha sido seleccionada de entre 600 aislados de las especies P. fluorescens y Pantoea agglomerans obtenidos de flores, frutos y hojas de plantas de la familia de las rosáceas durante una prospección llevada a cabo en varias áreas geográficas de España. La cepa ha sido seleccionada por su capacidad de suprimir la infecciones producidas por E. amylovora frutos inmaduros, flores y brotes de peral en condiciones de ambiente controlado, presentando unos niveles de control similares a los obtenidos mediante el control químico usando derivados de cobre o antibióticos. La cepa además ha mostrado la capacidad de colonizar y sobrevivir en flores y heridas producidas en frutos inmaduros en condiciones de ambiento controlado pero también en flores en condiciones de campo. La exclusión de E. amylovora medinate la colonización de la superficie, el consumo de nutrientes, y la interacción entre las células del patógeno y del agente de biocontrol es la principal causa de la inhibición del fuego bacteriano por la cepa EPS62e. Estas características constituyen aspectos interesantes para un desarrollo efectivo de la cepa EPS62e como un agente de biocontrol del fuego bacteriano en condiciones comerciales. / Fire blight, caused by Erwinia amylovora is a serious disease of rosaceous plants with great commercial and economic interest that is distributed over the world. Disease may be controlled commercially by the application of chemicals (copper compounds, antibiotics). Many chemical agents have low activity or cause phytotoxicity, and streptomycin, the most effective antibiotic, is not approved for use in many countries, including Spain. Therefore, in the absence of suitable chemical control agents, biological control could provide a useful alternative. In the present work, a biological control agent, Pseudomonas fluorescens EPS62e, has been selected among 600 isolates of P. fluorescens and Pantoea agglomerans obtained from flowers, fruits and leaves of rosaceous plants in a survey performed through several geographic areas of Spain. This strain has been selected for its capacity to suppress immature fruit, blossom and shoot infections caused by E. amylovora, under controlled environment conditions, providing control levels similar to chemical control with copper or antibiotic compounds. The strain has also shown the capacity to colonize and survive well in flowers and wounds on immature fruit under controlled environment conditions but also in flowers under natural conditions. Pre-emptive exclusion of the pathogen E. amylovora by surface colonization and nutrients depletion, and cell-to-cell interaction appear to be the main mechanisms of biocontrol. These characteristics constitute interesting traits for an effective development as a fire blight biological control agent under commercial conditions.

Pseudomonas fluorescens EPS62e es va seleccionar com a agent de biocontrol del foc bacterià per la seva eficàcia en el control de Erwinia amylovora. En aquest treball es van desenvolupar mètodes de traçabilitat que van permetre la seva detecció específica i quantificació. Mitjançant les tècniques RAPD i U-PCR es van obtenir fragments d'amplificació diferencial per EPS62e que es van seqüenciar i caracteritzar com marcadors SCAR per dissenyar una PCR en temps real. La PCR a temps real es va utilitzar simultàniament amb mètodes microbiològics per estudiar l'adaptabilitat epifítica de EPS62e en pomera i perera. L'ús combinat de mètodes microbiològics i moleculars va permetre la identificació de tres estats fisiològics de EPS62e: la colonització activa, l'entrada en un estat de viable però no cultivable, i la mort cel·lular. Aquest treball mostra que EPS62e està ben adaptada a la colonització de flors a camp, encoratjant la seva utilització dins d'una estratègia de control biològic contra el foc bacterià. / Pseudomonas fluorescens EPS62e was selected as a reliable biological control agent of fire blight for its high efficacy controlling Erwinia amylovora infections. In the present work, monitoring methods which allowed EPS62e specific detection and quantification were developed. RAPD and U-PCR fingerprints were used to obtain differential amplified fragments from EPS62e that were sequence characterized as SCAR markers. A real-time PCR was developed on the basis of the strain-specific SCAR markers, and was used simultaneously with microbiological methods to study the environmental fate of EPS62e in apple and pear orchards. The combined use of both microbiological and molecular methods permitted the identification of three physiological states for EPS62e, which consisted of active colonization, survival and entry into a viable but nonculturable state, and cell death. The present work shows that EPS62e is well adapted for blossom colonisation in the field, and encourages its utilisation in a fire blight.