Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2007. / ENGLISH ABSTRACT: The tolerance of Enterococcus mundtii ST4SA to stressful gastro-intestinal conditions in humans and animals is vital to its success as a probiotic. The need for new effective probiotics with stronger inhibitory (bacteriocin) activity has arisen due to the increasing number of antibiotic resistant pathogens. Enterococci are used in the fermentation of sausages and olives, cheese making and as probiotics. Their role as opportunistic pathogens in humans makes them a controversial probiotic (Moreno et al., 2005). Enterococci occur naturally in the gastro-intestinal tract which renders them intrinsic acid and bile resistance characteristics. E. mundtii ST4SA produces a 3950 Da broad-spectrum antibacterial peptide active against Gram-positive and Gram-negative bacteria, and viruses. The bacteria include Enterococcus faecalis, Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus. E. mundtii ST4SA inactivates the herpes simplex viruses HSV-1 (strain F) and HSV-2 (strain G), a measles virus (strain MV/BRAZIL/001/91, an attenuated strain of MV), and a polio virus (PV3, strain Sabin). This study focuses on the genetic stability of E. mundtii ST4SA genes when exposed to stress factors in the human and animal gastrointestinal tract. Based on results obtained by real-time PCR, the expression of genes encoding bacST4SA, RecA, GroES and 23S rRNA by E. mundtii ST4SA were not affected when the cells were exposed to acid, bile and pancreatic juice. This suggests that these genes of E. mundtii ST4SA will remain stable in the intestine. This could indicate that other genes of E. mundtii ST4SA could remain stable in the host. Further studies on the stability of genes encoding antibiotic resistance and virulence factors should be conducted to determine their stability and expression in the host in stress conditions. Concluded from this study, E. mundtii ST4SA is an excellent probiotic strain. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Enterococcus mundtii ST4SA se weerstandsvermoë teen stresvolle gastrointestinale kondisies is essensieel vir die sukses van hierdie organisme as ‘n probiotikum. Die aanvraag vir nuwe, meer effektiewe probiotika met sterker inhibitoriese (bakteriosien) aktiwiteit is as gevolg van die toename in antibiotikum weerstandbiedende patogene. Enterococci word algemeen gebruik as probiotika, sowel as in die fermentasie van worse, olywe en kaas. Hulle rol as oppertunistiese patogene in mense veroorsaak kontroversie as gevolg van hul toenemende gebruik as probiotika. Enterococci is deel van die natuurlike mikroflora in die gastrointestinale weg van mense en diere. Dit verleen aan hierdie spesies ‘n natuurlike weerstandsvermoë teen maagsure, galsoute en pankreatiese afskeidings. E. mundtii ST4SA produseer ‘n 3950 Da wye spektrum anti-bakteriese peptied, aktief teen Gram positiewe en Gram negatiewe bakterieë sowel as virusse. Hierdie bakterieë sluit Enterococcus faecalis, Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae en Staphylococcus aureus in. E. mundtii ST4SA inaktiveer die herpes simpleks virus HSV-1 en HSV-2, ‘n masels virus (MV/BRAZIL/001/91), en ‘n polio virus (PV3, stam Sabin). Hierdie studie fokus op die genetiese stabiliteit van E. mundtii ST4SA gene, wanneer hulle blootgestel word aan stress faktore in die mens en dier gastrointestinale weg. “Intydse” PKR data gebasseer op die uitdrukking van die bacST4SA, RecA, GroES en 23S rRNA gene in stresvolle kondisies dui aan dat E. mundtii ST4SA nie geaffekteer word wanneer die sel blootgestel word aan suur, gal en pankreatiese vloeistowwe nie. Hierdie resultate dui aan dat hierdie gene van E. mundtii ST4SA stabiel sal bly in die intestinale weg van die mens en dier. Dit kan aandui dat ander gene van E. mundtii ST4SA soos die wat kodeer vir virulensie faktore en antibiotikum se weerstandsvermoë stabiel mag bly in die gasheer. Verdere studies wat fokus op die stabiliteit van gene wat kodeer vir antibiotikum weerstandbiedendheid en virulensie faktore moet uitgevoer word om hulle stabiliteit en uitdrukking in die gasheer te bepaal. Bevindings van hierdie studie dui aan dat E. mundtii ST4SA goeie potensiaal het as ‘n probiotikum.

Orientador: Saulo Santesso Garrido / Resumo: Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma alternativa interessante como bioconservantes de alimentos devido a sua eficiência e, principalmente, à baixa toxicidade quando comparados aos conservantes químicos tradicionais. As bacteriocinas, uma classe de PAMs, têm atividade antimicrobiana em espécies responsáveis pela degradação de alimentos e, portanto, atualmente são exploradas como bioconservadores. A Leucocina C-TA33a (LeuC), um tipo de bacteriocina produzida pela cepa bacteriana Leuconostoc mesenteroides TA33a, é conhecida por ter um amplo espectro antimicrobiano. Estudos de alinhamento da estrutura primária de diferentes bacteriocinas revelaram que LeuC conserva em sua estrutura regiões homólogas também compartilhadas por outras bacteriocinas, como Sacacina P, Bavaricina A e Enterocina A, possivelmente revelando uma importante relação entre essas sequências de aminoácidos e suas atividades antimicrobianas. Este estudo tem como objetivo sintetizar diferentes peptídeos baseados na estrutura primária da Leucocina CTA33a, a fim de identificar as principais regiões responsáveis pela atividade antimicrobiana. Os peptídeos LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 e LeuC-Cys9,14 foram sintetizados por metodologia de fase sólida, purificados e analisados por HPLC e caracterizados por ESI-MS. Ensaios em meio líquido foram realizados para a determinação do percentual de inibição de crescimento microbianos dos peptídeos sobre espécies patogênicas. Os micro-organismos testados fora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial peptides (PAMs) are an interesting alternative, because biopreservatives present high efficiency and low toxicity when compared to classic preservatives. Bacteriocins, a class of PAMs, have antimicrobial activity in species responsible for food degradation and are currently being exploited as biopreservatives. The Leucocin C-TA33a (LeuC), a type of bacteriocin, is produced by the Leuconostoc mesenteroides TA33a strain and is known for a broad antimicrobial spectrum. Studies of alignment of the primary structure of different bacteriocins revealed that LeuC retains in its structure homologous regions also shared by other bacteriocins, such as Sacacin P, Bavaricin A and Enterocin A, possibly revealing an important relationship between these amino acid sequences and their antimicrobial activities. This study aims to synthesize different peptides based on the primary structure of Leucocin C-TA33a, with the objective of identifying the main regions responsible for antimicrobial activity. The peptides LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 and LeuC-Cys9,14 were synthesized by solid phase methodology, purified by HPLC and characterized by ESI-MS. Liquid assays were performed to determine the percentage of inhibition of microorganisms of the peptides on pathogenic species. The microorganisms tested were Salmonella serotype Typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Studies were also conducted through circular dichroism, molecular ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Listeria monocytogenes causa a listeriose, uma doença zoonótica grave que causa infecções do sistema nervoso central (meningite, encefalite e meningoencefalite), bacteremia primária e septicemia. A doença apresenta baixa morbidade e alta mortalidade e acomete, principalmente, grupos de risco, como mulheres grávidas, neonatos, indivíduos imunocomprometidos e idosos. L. monocytogenes tem sido encontrada com freqüência em alimentos in natura e/ou processados, como queijos e outros produtos lácteos. Esse estudo objetivou isolar bactérias lácticas a partir de leite de cabra, capazes de produzir peptídeos antimicrobianos (bacteriocinas), identificar estas cepas, caracterizar as bacteriocinas produzidas e avaliar o seu potencial de aplicação no controle da multiplicação de L. monocytogenes em queijo de cabra durante armazenamento a 8-10°C. Trabalhando-se com leite de cabra cru, foi possível isolar seis cepas produtoras de bacteriocinas (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi). Através de testes fenotípicos apropriados e sequenciamento do 16S rRNA, essas cepas foram identificadas como Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). A caracterização físico-química e biológica das bacteriocinas produzidas pelas cepas DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicou que eram resistentes ao calor e extremos de pH, mas apresentavam características diferentes em relação ao espectro de ação, sensibilidade a agentes químicos, adsorção à células-alvo e lise das células de L. monocytogenes. O efeito do pH, temperatura e composição do meio de cultura na produção das bacteriocinas foi também cepa-dependente. A cepa DF4Mi apresentou melhor atividade antimicrobiana e foi selecionada para o estudo de inibição de L. monocytogenes em queijos. Para isso, foram preparados lotes de queijo frescal, feito com leite de cabra pasteurizado adicionado e não adicionado da cepa DF4Mi (106 UFC/mL), experimentalmente contaminado com L. monocytogenes (103 UFC/g), além dos controles positivo (queijo adicionado de nisina 12,5 mg/Kg) e negativo (leite adicionado de uma cepa de L. lactis subsp. lactis não bacteriocinogênica). Observou-se que a cepa DF4Mi apresentou efeito bacteriostático no queijo, sendo capaz de inibir a multiplicação do patógeno durante o armazenamento a 8-10°C por 10 dias. No entanto, inibição semelhante foi obtida nos queijos com a bactéria lática não bacteriocinogênica, indicando que a inibição não pode ser creditada às bacteriocinas. Nos queijos-controle com nisina, foi observada uma redução de 2 log na contagem de L. monocytogenes após 10 dias a 8-10°C. Já nos queijos preparados sem nisina e sem nenhuma bactéria lática, as contagens de L. monocytogenes atingiram contagens elevadas (106 UFC/g) após 10 dias de armazenamento a 8-10°C. / Listeria monocytogenes causes listeriosis, a serious zoonotic disease that causes infections in the central nervous system (meningitis, encephalitis and meningoencephalitis), bacteremia and septicemia. The disease presents low morbidity and high mortality and affects mainly those in the risk group, such as pregnant women, neonates, immunocompromised individuals and the elderly. L. monocytogenes has been frequently detected in in natura and processed foods. Like cheeses and other dairy products. This study aimed to isolate lactic acid bacteria capable of producing antimicrobial compounds from goat milk, identify the isolates, characterize the bacteriocins and evaluate their potential application in controlling the growth of L. monocytogenes in goat cheese during storage at 8-10°C. Six bacteriocinogenic strains (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi) were successfully isolated from raw goat milk. Using appropriate phenotypic tests and 16S rRNA sequencing, these strains were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). The physico-chemical and biological characterization of the bacteriocins produced by the strains DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicated that they were resistant to heat and pH extremes, but presented different spectrum of activity, sensitivity to chemicals, adsorption to target cells and lysis of L. monocytogenes. The effect of pH, temperature and culture media composition in bacteriocin production was also strain-dependent. The strain DF4Mi presented the best antimicrobial activity and was selected for the studies on inhibition of L. monocytogenes in cheese. Frescal cheese was manufactured with pasteurized goat milk added of a culture of DF4Mi (106 CFU/mL), and experimentally contaminated with L. monocytogenes (103 CFU/g). Control cheeses were also prepared: those added of 12.5 mg/Kg nisin (positive control) and those added of a non-bacteriocinogenic L. lactis subsp. lactis strain. The strain presented a bacteriostatic effect, controlling the growth of the pathogen for 10 days at 8-10°C. However, a similar effect was observed in the cheeses prepared with the non-bacteriocinogenic strain, indicating that the inhibition cannot be credited to bacteriocins. In the cheeses containing nisin, a 2 log reduction in the counts of L. monocytogenes was achieved after 10 days at 8-10°C. In the cheeses with no added nisin or lactic acid bacteria, the counts of L. monocytogenes after 10 days at 8-10°C were high (106 CFU/g).

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

O efeito combinado de bacteriocina produzida por Lacfobacillus sake 2ª e embalagem em atmosfera modificada sobre o controle de Lisferia monocytogenes F5069r em lingüiça frescal foi avaliado. A cepa L. sake 2a foi co-inoculada com L. monocytogenes F5069r (resistente a cloranfenicol e eritromicina) em lingüiça frescal. As lingüiças foram embaladas com ar, 100% CO2 ou 50%CO2/50%N2 e armazenadas a 6°C. A multiplicação de L. Monocytogenes F5069r e L. sake 2a foi monitorada durante 4 semanas em intervalos de 7 dias. A avaliação sensorial, por meio do teste triangular, foi realizada após 5 e 11 dias, os quais foram estipulados de acordo com a vida-de-prateleira do produto. Após 28 dias de estocagem, a população de L. monocytogenes nas amostras inoculadas com L. sake 2a e embaladas com atmosfera modificada foi 6.4 ciclos logarítmicos menor que no controle sem a bactéria lática e embalado em ar. No entanto, a influência da atmosfera modificada sobre as características sensoriais do produto foram detectáveis após cinco dias de estocagem, independente da adição de L. sake 2a. Ao final da primeira semana, a influência de L. sake 2a sobre L. monocytogenes foi menos importante (redução de 0,4 log, não significante) que a influência da embalagem em atmosfera modificada (redução de 1,4 log, significante). No décimo primeiro dia, nenhuma diferença sensorial foi encontrada entre as amostras com e sem L. sake 2a embaladas em atmosfera modificada. Após 14 dias, a população de L. monocyfogenes nas amostras com L. sake 2ª embaladas em atmosfera modificada foi 3,5 log menor que no controle sem a bactéria lática e embalado em ar. Os resultados sugerem que o uso combinado de atmosfera modificada e bacteriocina produzida por L. sake 2a apresenta um efeito sinergístico sobre o controle de L. monocytogenes F5069r em lingüiça frescal refrigerada. / Lactobacillus sake 2a is a bacteriocinogenic strain isolated from \"lingüiça frescal\", a Brazilian sausage. The combined effect of modified-atmosphere packaging and addition of L. sake 2a on inhibition of L. monocyfogenes in \"lingüiça\" was evaluated. Samples were inoculated with L. monocytogenes and/or L. sake 2a, packed with oxygen-permeable film, 100%CO2 or 50%CO2+50%N2 and stored at 6°C. Microbial counts were performed weekly. Sensorial evaluation (triangle tests with 16 subjects) was performed after 5 and 11 days (shelf-life). After the fourth week, L. monocytogenes population in samples packed with modified atmosphere containing L. sake 2a was 6.4 log lower than in samples without any treatment. However, the influence of the modified atmosphere on the sensorial characteristics of the product was already detectable on the fifth day (a risk of 5%), regardless the addition of L. sake 2a. By the end of the first week, the influence of L. sake 2a on the inhibition of L. Monocytogenes was less important (reduction of 0.4 log, non significant) than the influence of the packaging (reduction of 1.4 log, significant). On the 11th day, no significant sensorial difference was found between the samples with and without L. sake 2a packed with modified atmosphere. By the end of the second week, L.monocytogenes counts in samples packed with modified atmosphere containing L. sake 2a were 3.5 log lower than counts in samples without any treatment. Combination of results suggests that modified atmosphere and L. sake 2a act synergistically on inhibition of L. monocytogenes in \"lingüiça frescal\".

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - Capa_Abstract.pdf: 84206 bytes, checksum: fde95bad13eae98fb18c23bd5a1f8e62 (MD5) Previous issue date: 2011-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Silage is a sort of conserved fodder obtained through the fermentation of forage by lactic bacteria, which convert the soluble carbohydrates in lactic acid. This acid is responsible for reducing the pH of the ensiled mass, inhibiting the growth of deteriorating and pathogenic microorganisms, with no interference in the nutritional features of the ensiled culture. In addition to the lactic acid, the lactic bacteria may produce other antimicrobial compounds, such as the bacteriocins. In the present study, it was isolated 256 cultures of lactic bacteria from Estilosantes Campo Grande, in varied periods of fermentation. Among the 256 isolates obtained, 83% (214) displayed antagonist activity against the indicator microorganism. Among these, only 10% were capable of growing in basal medium. An analysis of the genetic diversity of 20 isolates was done by BOX-PCR. Eight isolates of lactic bacteria which presented high antagonist activity and elevated growth rate were selected and their fermenting profile in 49 carbohydrates sources allowed the identification of theses isolates, such as Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. The analysis of the 16S rDNA showed the same identification. The crude extract of the antimicrobial substance similar to bacteriocin (Blis) of three isolates inhibited the growth of the indicator microorganism, and the antagonist activity was also observed after pH neutralization (pH 7,0) with NaOH. The antagonist activity of the Blis crude extract was lost after the treatment with proteolytic enzymes. These three lactic acid bacteria isolates presented a broad spectrum of antagonist activity, inhibiting several species of different microorganisms. The antimicrobial feature of these isolates observed in this in this work, associated with other growth and fermentation physiological parameters shows that the lactic bacteria cultures isolated in silage from Estilosantes Campo Grande are potential candidates to be evaluated as inoculants in legume silage. / A silagem é uma forma de forragem conservada obtida por meio da fermentação da forrageira pelas bactérias lácticas, que convertem os carboidratos solúveis em ácido láctico. Este ácido é responsável por reduzir o pH da massa ensilada, inibindo o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos, sem interferir com as características nutricionais da cultura ensilada. Além do ácido láctico, as bactérias lácticas podem produzir outros compostos antimicrobianos, como as bacteriocinas. Neste estudo, foram isoladas 256 culturas de bactérias lácticas da silagem de Estilosantes Campo Grande, em diferentes períodos de fermentação. Dos 256 isolados de bactérias lácticas obtidos, 83% (214) demonstraram atividade antagonista contra o micro-organismo indicador. Dentre estes, apenas 10% foram capazes de crescer em meio basal. Análise da diversidade genética de 20 isolados foi realizada por BOX-PCR. Oito isolados de bactérias lácticas que apresentaram alta atividade antagonista e elevada velocidade de crescimento foram selecionados e o perfil de fermentação de 49 carboidratos permitiu a identificação desses isolados como Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. A análise do gene 16S rDNA mostrou a mesma identificação. O extrato bruto da substância antimicrobiana semelhante a bacteriocina (Blis) de três isolados de bactérias lácticas inibiu o crescimento do micro-organismo indicador, e a atividade antagonista do extrato também foi observada após a neutralização do pH (pH 7,0) com NaOH. A atividade antagonista do extrato bruto da Blis foi perdida após o tratamento com enzimas proteolíticas. Estes tres isolados de bactérias lácticas demonstraram amplo espectro de atividade antagonista, inibindo várias espécies de micro-organismos diferentes. A característica antimicrobiana destes isolados observada neste trabalho, associada com outros parâmetros fisiológicos de crescimento e fermentação faz com que as culturas de bactérias lácticas isoladas de silagem de Estilosantes Campo Grande sejam candidatos potenciais para serem avaliados como inoculantes em silagens de leguminosas.

Submitted by JESSELEINE CRISTINE MONTEIRO DA SILVA null (jesse_cris@hotmail.com) on 2017-09-20T20:56:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final Jesseleine.pdf: 1516064 bytes, checksum: 56e50bf83bbdb465716b33121512f13f (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-27T17:48:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_jcm_me_araiq.pdf: 1516064 bytes, checksum: 56e50bf83bbdb465716b33121512f13f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T17:48:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_jcm_me_araiq.pdf: 1516064 bytes, checksum: 56e50bf83bbdb465716b33121512f13f (MD5) Previous issue date: 2017-09-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Devido ao crescente aumento de doenças transmitidas por alimentos, a segurança microbiológica se torna uma questão de saúde pública pelas suas características de endemicidade, alta morbidade e pela dificuldade da adoção de medidas de controle desses microrganismos. Diante deste fato, o objetivo deste trabalho foi sintetizar e caracterizar os análogos peptídicos LeuB e LeuC-1 derivados de bacteriocinas naturais denominadas Leucocinas. Os peptídeos foram sintetizados manualmente pelo método de síntese em fase sólida, submetidos à desproteção total e clivagem, com liberação dos peptídeos brutos. Foram realizadas as análises comparativas usando HPLC e ESI-MS, e com os respectivos peptídeos puros foram feitos os ensaios antimicrobiano, enzimático, permeabilização, antioxidante, hemolítico e de espectroscopia de dicroísmo circular. Com isso, observou-se que o método de síntese dos análogos foi adequado e o processo de purificação possibilitou a obtenção dos peptídeos com alto grau de pureza. O peso molecular teórico dos peptídeos foi confirmado por espectrometria de massas. O LeuB apresentou uma maior capacidade em inibir o crescimento de Escherichia coli O157:H7 e em Salmonella sorovar Typhimurium, enquanto que LeuC-1 apresentou efeito de inibição de crescimento de Listeria monocytogenes e também de S. sorovar Typhimurium. É importante destacar que todas essas bactérias são de interesse na área de alimentos, já que são as causadoras da maioria dos casos de infecção alimentar. O ensaio de inibição enzimática com DNA girase e Topoisomerase IV mostrou que apenas o peptídeo LeuB possui capacidade de inibição destas enzimas bacterianas, sugerindo um possível mecanismo de ação deste derivado de Leucocina. Este peptídeo também apresentou a capacidade de permeabilizar miméticos de membrana bacteriana composto de POPC/POPG (75/25). Por sua vez, o peptídeo LeuC-1 não apresentou capacidade significativa de inibição da atividade das enzimas DNA girase e Topoisomerase IV e também não apresentou capacidade de permeabilização de miméticos de membrana. Porém, LeuC-1 apresentou uma boa atividade antioxidante, obtida pelo método de ABTS. Ambos os peptídeos apresentaram baixa toxicidade em eritrócitos, comprovadas pelos ensaios hemolíticos. Estruturalmente, os peptídeos LeuB e LeuC-1 tendem a se estruturar em α-hélice. Assim sendo, este trabalho possibilitou a obtenção de dois peptídeos com potencial de aplicação como conservantes alimentares a partir de mecanismos distintos de ação sem apresentar citotoxicidade para células vermelhas do sangue. LeuB possui uma suposta atuação como inibidor de topoisomerases bacterianas e capacidade de permeabilização de miméticos de membrana. LeuC-1 possivelmente atua em diferentes vias metabólicas da bactéria, porém ainda não foi possível elucidar o mecanismo alvo deste mimético peptídico. / Due to the increase of foodborne diseases, microbiological safety becomes a public health issue due to its characteristics of endemicity, high morbidity and the difficulty of adopting control measures of these microorganisms. In view of this fact, the objective of this work was to synthesize and characterize LeuB and LeuC-1 peptidics analogues derived from natural bacteriocins called Leucocins. The peptides were synthesized manually by the solid phase synthesis method, subjected to total deprotection and cleavage, with release of the crude peptides. Comparative analyzes were performed using HPLC and ESI-MS, and with the respective pure peptides the antimicrobial, enzymatic, permeabilization, antioxidant, hemolytic and circular dichroism spectroscopy. With this, it was observed that the method of synthesis of the analogs was adequate and the purification process allowed to obtain the peptides with high purity. The theoretical molecular weight of the peptides was confirmed by mass spectrometry. LeuB showed a greater capacity to inhibit the growth of Escherichia coli O157: H7 and Salmonella serovar Typhimurium, whereas LeuC-1 presented inhibition effect of growth of Listeria monocytogenes and also of S. serovar Typhimurium. It is important to highlight that all these bacteria are interesting in the area of food, since they are the cause of most cases of food infection. The enzyme inhibition assay with DNA gyrase and Topoisomerase IV showed that only the LeuB peptide has the ability to inhibit these bacterial enzymes, suggesting a possible mechanism of action of this Leucocin derivative. This peptide also showed the ability to permeabilize bacterial membrane mimetics composed of POPC/POPG (75/25). On the other hand, the LeuC- 1 peptide did not present significant capacity to inhibit the activity of the enzymes DNA gyrase and Topoisomerase IV and also did not present permeabilization capacity of membrane mimetics. However, LeuC-1 presented a good antioxidant activity, obtained by the ABTS method. Both peptides had low erythrocyte toxicity, as demonstrated by hemolytic assays. Structurally, the LeuB and LeuC-1 peptides tend to be α-helix structured. Therefore, this work enabled two peptides with application potential as food preservatives to be obtained from distinct mechanisms of action without presenting red blood cell cytotoxicity. LeuB has a supposed action as inhibitor of bacterial topoisomerases and permeabilization capacity of membrane mimetics. LeuC-1 possibly acts on different metabolic pathways of the bacterium, but it has not yet been possible to elucidate the target mechanism of this peptidic mimetic. / CNPq: 150928/2015-7

Nous avons étudié la présence de bactéries lactiques capables de produire des bactériocines dans des fromages traditionnels Slovènes. Dans cinq échantillons de Tolminc (fromage au lait de vache) et quatre échantillons de Kraški ovčji sir (fromage au lait de brebis), nous avons recherché la présence de 19 gènes de bactériocines par PCR. L'ADN a été extrait directement à partir des fromages ainsi qu'à partir de consortia microbiens de ces fromages isolés sur gélose CATC, Rogosa et M17. Nous avons utilisé des tests par diffusion sur gélose pour déterminer l'activité antimicrobienne des consortia sur différentes bactéries indicatrices. L'activité anti-staphylococcique a aussi été déterminée in situ dans du lait et du fromage. L'avantage compétitif des souches productrices de bactériocines a été évalué en effectuant des repiquages successifs des consortia dans du lait. Lors de ces essais, nous avons suivi la présence de différents déterminants génétiques de bactériocines ainsi que l'activité antimicrobienne des consortia. Ces mêmes propriétés ont aussi été déterminées pour des souches individuelles productrices de bactériocines, qui ont été isolées du consortium initial ou de consortia obtenus après propagation dans le lait. La mise en évidence de gènes de bactériocines par PCR dépendait de l'efficacité d'extraction de l'ADN. L'extraction de l'ADN total était plus efficace lorsque l'homogénéisation du fromage était réalisée avec une solution de citrate de sodium. Dans l'ADN issu des fromages et consortia microbiens, nous avons détecté plusieurs gènes de bactériocines. Leur nombre diminuait lors de la propagation dans le lait, ce qui indique un faible avantage compétitif des souches productrices de bactériocines. Les résultats n'ont montré un avantage compétitif que pour des souches comportant des déterminants génétiques de la cytolysine. Nous n'avons détecté une production de bactériocines dans les fromages que lorsque qu'une culture pure d'une souche productrice de nisine A a été ajoutée. La différence entre la détection de déterminants génétiques de bactériocines et l'activité antimicrobienne montre la complexité qui relie ces deux propriétés.En raison des limitations concernant les tests par diffusion sur gélose pour détecter l'expression des gènes in situ, nous avons mis en place une méthode moléculaire basée sur la reverse transcription et la PCR en temps réel. Cette méthode sera très utile pour de futures études concernant le rôle des bactériocines dans les fromages. / We examined the presence of lactic acid bacteria (LAB) able to produce different bacteriocins in traditional Slovenian cheeses. In five samples of Tolminc cheese (from cows' milk) and four samples of Kraški ovčji sir (from ewes' milk) we looked for the presence 19 LAB bacteriocins' gene determinants using PCR. The DNA analysed was extracted directly from cheese samples as well as from cultivable microbial consortia of cheese which were isolated on CATC, Rogosa and M17 agar media. We used diffusion tests to determine the antimicrobial activity of microbial consortia against different indicator bacteria. Anti-staphylococcal activity was also determined in situ in milk and cheese. Competitive advantage of bacteriocinogenic strains was examined by consecutive propagation of microbial consortia in milk. During this we followed the presence of different bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity of microbial consortia. The same properties were also determined for individual bacteriocinogenic strains that were isolated from initial consortia and from consortia obtained after propagation in milk. The success of finding bacteriocin gene determinants with PCR depended greatly on the efficiency of DNA extraction. The extraction of total DNA was the most successful when sodium citrate was used for cheese homogenisation. In DNA of different cheeses and microbial consortia we detected a number of bacteriocin gene determinants. Their number was reduced during the process of propagation in milk, which indicates a poor competitive advantage of some bacteriocinogenic strains. The results demonstrated competitive advantage only for strains that carried gene determinants for cytolysin. We detected bacteriocin activity in cheese only when monoculture of nisin A producer was added. The discrepancy between detected bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity shows the complexity that links these two properties. This method will be very useful in the future studies of the role of bacteriocins in cheese.

Listeria monocytogenes causa a listeriose, uma doença zoonótica grave que causa infecções do sistema nervoso central (meningite, encefalite e meningoencefalite), bacteremia primária e septicemia. A doença apresenta baixa morbidade e alta mortalidade e acomete, principalmente, grupos de risco, como mulheres grávidas, neonatos, indivíduos imunocomprometidos e idosos. L. monocytogenes tem sido encontrada com freqüência em alimentos in natura e/ou processados, como queijos e outros produtos lácteos. Esse estudo objetivou isolar bactérias lácticas a partir de leite de cabra, capazes de produzir peptídeos antimicrobianos (bacteriocinas), identificar estas cepas, caracterizar as bacteriocinas produzidas e avaliar o seu potencial de aplicação no controle da multiplicação de L. monocytogenes em queijo de cabra durante armazenamento a 8-10°C. Trabalhando-se com leite de cabra cru, foi possível isolar seis cepas produtoras de bacteriocinas (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi). Através de testes fenotípicos apropriados e sequenciamento do 16S rRNA, essas cepas foram identificadas como Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). A caracterização físico-química e biológica das bacteriocinas produzidas pelas cepas DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicou que eram resistentes ao calor e extremos de pH, mas apresentavam características diferentes em relação ao espectro de ação, sensibilidade a agentes químicos, adsorção à células-alvo e lise das células de L. monocytogenes. O efeito do pH, temperatura e composição do meio de cultura na produção das bacteriocinas foi também cepa-dependente. A cepa DF4Mi apresentou melhor atividade antimicrobiana e foi selecionada para o estudo de inibição de L. monocytogenes em queijos. Para isso, foram preparados lotes de queijo frescal, feito com leite de cabra pasteurizado adicionado e não adicionado da cepa DF4Mi (106 UFC/mL), experimentalmente contaminado com L. monocytogenes (103 UFC/g), além dos controles positivo (queijo adicionado de nisina 12,5 mg/Kg) e negativo (leite adicionado de uma cepa de L. lactis subsp. lactis não bacteriocinogênica). Observou-se que a cepa DF4Mi apresentou efeito bacteriostático no queijo, sendo capaz de inibir a multiplicação do patógeno durante o armazenamento a 8-10°C por 10 dias. No entanto, inibição semelhante foi obtida nos queijos com a bactéria lática não bacteriocinogênica, indicando que a inibição não pode ser creditada às bacteriocinas. Nos queijos-controle com nisina, foi observada uma redução de 2 log na contagem de L. monocytogenes após 10 dias a 8-10°C. Já nos queijos preparados sem nisina e sem nenhuma bactéria lática, as contagens de L. monocytogenes atingiram contagens elevadas (106 UFC/g) após 10 dias de armazenamento a 8-10°C. / Listeria monocytogenes causes listeriosis, a serious zoonotic disease that causes infections in the central nervous system (meningitis, encephalitis and meningoencephalitis), bacteremia and septicemia. The disease presents low morbidity and high mortality and affects mainly those in the risk group, such as pregnant women, neonates, immunocompromised individuals and the elderly. L. monocytogenes has been frequently detected in in natura and processed foods. Like cheeses and other dairy products. This study aimed to isolate lactic acid bacteria capable of producing antimicrobial compounds from goat milk, identify the isolates, characterize the bacteriocins and evaluate their potential application in controlling the growth of L. monocytogenes in goat cheese during storage at 8-10°C. Six bacteriocinogenic strains (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi, DF5Mi, DF6Mi e DF60Mi) were successfully isolated from raw goat milk. Using appropriate phenotypic tests and 16S rRNA sequencing, these strains were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis (DF2Mi, DF3Mi, DF4Mi e DF5Mi), Leuconostoc lactis (DF6Mi) and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DF60Mi). The physico-chemical and biological characterization of the bacteriocins produced by the strains DF4Mi, DF6Mi e DF60Mi indicated that they were resistant to heat and pH extremes, but presented different spectrum of activity, sensitivity to chemicals, adsorption to target cells and lysis of L. monocytogenes. The effect of pH, temperature and culture media composition in bacteriocin production was also strain-dependent. The strain DF4Mi presented the best antimicrobial activity and was selected for the studies on inhibition of L. monocytogenes in cheese. Frescal cheese was manufactured with pasteurized goat milk added of a culture of DF4Mi (106 CFU/mL), and experimentally contaminated with L. monocytogenes (103 CFU/g). Control cheeses were also prepared: those added of 12.5 mg/Kg nisin (positive control) and those added of a non-bacteriocinogenic L. lactis subsp. lactis strain. The strain presented a bacteriostatic effect, controlling the growth of the pathogen for 10 days at 8-10°C. However, a similar effect was observed in the cheeses prepared with the non-bacteriocinogenic strain, indicating that the inhibition cannot be credited to bacteriocins. In the cheeses containing nisin, a 2 log reduction in the counts of L. monocytogenes was achieved after 10 days at 8-10°C. In the cheeses with no added nisin or lactic acid bacteria, the counts of L. monocytogenes after 10 days at 8-10°C were high (106 CFU/g).