Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-23T18:00:26Z No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T13:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T13:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) Previous issue date: 2008 / Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que havia um erro no “primer” 5’ utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit “Bac-to-Bac” (Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina. Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados, via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho:GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição. Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus recombinantes expressando uma proteína de fusão “poliedrina + proteína capsidial + cauda de hexa-histidina” que poderá ser utilizada para produção de anticorpos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work goal was the production of a modified baculovirus vector capable of expressing an heterologous protein fused to the polyhedrin and to an hexahistidin tag. The PH fragment (polyhedrin gene with an NcoI site and a histidin tag at its 3’ end) was synthesized through PCR reaction. In the first attempt to obtain the PH fragment, instead of the polyhedrin gene, PCR reaction amplified a fragment of Escherichia coli genome. In the second attempt, the problem was the 5’ “primer”, which had an extra nucleotide and disrupted the PH fragment reading frame. In the third attempt, the correct PH fragment was obtained and cloned into pFastBac1 vector (Invitrogen), generating pFastPH. A recombinant baculovirus (vAcPH) expressing the PH protein was obtained through site-specific transposition (“Bac-to-Bac” kit, Invitrogen). SDS-PAGE showed the presence of a protein with molecular weight (MW) superior to the native polyhedrin MW (28,6 KDa). In Western Blot experiment, PH protein was recognized by antibody against polyhedrin and by antibody against hexahistidin tag, proving that the PH protein was being expressed. Also, this work attempted to use the modified baculovirus vector to express and purify the capsid protein of viruses present in the garlic virus complex (GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV). NcoI sites were added, through PCR, to both ends of these genes. In the future, these genes these genes may be cloned in pFastPH vector to generate baculovirus expressing these virus coat proteins fused to the PH gene. The purified fusion proteins may then be used in experiments to obtain antibodies against them.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-24T16:48:55Z No. of bitstreams: 1 2008_AnabeleALima.pdf: 2370665 bytes, checksum: 623c68923c82ff2824292fd7e4052e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-02-20T11:45:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AnabeleALima.pdf: 2370665 bytes, checksum: 623c68923c82ff2824292fd7e4052e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-20T11:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AnabeleALima.pdf: 2370665 bytes, checksum: 623c68923c82ff2824292fd7e4052e47 (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA fita dupla, específicos de artrópodes, que têm sido utilizados, principalmente, como agentes de controle biológico de insetos-praga e como vetores de expressão de genes heterólogos. A utilização do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) no controle da lagarta da soja, A. gemmatalis, no Brasil, é o maior exemplo mundial de sucesso de um vírus utilizado como bioinseticida. Uma das características interessantes do genoma viral do AgMNPV está na ausência dos genes quitinase (v-chiA) e catepsina (v-cath), que por sua vez estão presentes na maioria dos genomas dos baculovírus pertencentes ao grupo I do gênero Nucleopolyhedrovirus (NPV). A ausência dos genes v-chiA e v-cath pode ser responsável pela ausência de liqüefação de larvas de A. gemmatalis mortas pela infecção do AgMNPV. Este trabalho teve como objetivo a construção de AgMNPV recombinantes com a introdução individual ou em conjunto dos genes v-chiA e v-cath, derivados dos vírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus (CfDefNPV) no genoma viral, para a observação dos efeitos causados pela infecção viral em larvas de A. gemmatalis, comparativamente ao vírus AgMNPV selvagem. O DNA plasmidial do vetor de transferência, contendo os dois genes derivados do vírus CfDefNPV, foi cotransfectado com o DNA de um vírus recombinate derivado do AgMNPV, o vírus vAgGalA2, em células A. gemmatalis (UFL-AG-286). O novo vírus recombinante construído (vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath) foi isolado pelo método de diluição seriada, em placa de 96 poços. O vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath foi capaz de promover a liqüefação do corpo das larvas de A. gemmatalis após a morte das mesmas. Porém, não houve diferenças significativas com relação à virulência, e conseqüentemente, o tempo de morte das larvas comparado com o AgMNPV selvagem. Os AgMNPV recombinantes possuindo apenas um dos genes (v-chiA ou v-cath) ainda não foram isolados e, desta forma, não foi possível analisar o efeito causado por esses genes separadamente, em larvas de A. gemmatalis. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are double-stranded DNA viruses, arthropod-specific that have been mainly used as biological-control agents of insect pests and as heterologous gene expression vectors. The use of the Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) in Brazil, for the control of the velvetbean caterpillar is the most successful example of a virus used as a biological pesticide. One of the interesting features of the AgMNPV genome is the absence of chitinase (v-chiA) e catepsin (v-cath) genes, which in turn are present in most of the genomes of baculoviruses belonging to group I of the Nucleopolyhedrovirus genus. The absence of v-chiA and v-cath genes may be responsible for the lack of liquefaction of A. gemmatalis larvae killed by AgMNPV. The aim of this work was the construction of recombinant AgMNPV with the introduction of each gene (v-chiA or v-cath) alone or both of them, derived from the baculoviruses Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus (CfDefNPV) into the AgMNPV genome and observation of the effects caused by the viral infection in A. gemmatalis larvae, comparared with the wild-type AgMNPV infection. A recombinant transfer vector DNA, containing both genes derived from CfDefNPV, was co-transfected with DNA from vAgGalA2 virus, derived from AgMNPV, in A. gemmatalis (UFL-AG-286) cells. The new recombinant AgMNPV virus construct (vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath) was isolated using the serial dilution method in 96 well-plates. The vAgp2100Cf.v-chiA/vcath was able to promote liquefaction of infected A. gemmatalis larvae soon after death. However, we have not detected significant differences with regard to virulence, and consequently, the time of death, when compared with the wild-type AgMNPV. The AgMNPV recombinants, containing only one of the genes (v-chiA or v-cath) have not xx been isolated yet, and therefore, it was not possible to analyse the effects caused from this genes separately in A. gemmatalis larvae.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-16T16:54:09Z No. of bitstreams: 1 2012_SaluanaRochaCraveiro_Parcial.pdf: 10672925 bytes, checksum: 0939eba1de8766746468f493f67e2742 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-16T17:51:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_SaluanaRochaCraveiro_Parcial.pdf: 10672925 bytes, checksum: 0939eba1de8766746468f493f67e2742 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-16T17:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_SaluanaRochaCraveiro_Parcial.pdf: 10672925 bytes, checksum: 0939eba1de8766746468f493f67e2742 (MD5) / A lagarta falsa-medideira (Pseudoplusia includens; Walker, 1857) tornou-se uma praga de grande importância nas lavouras de soja no Brasil. Sete isolados virais, caracterizados como variantes genotípicos do baculovirus Pseudoplusia includens single nucleopolyhedrovirus(PsinSNPV), foram obtidos de larvas P. includens coletadas em plantações de soja e algodão no Brasil e Guatemala. Visando determinar a diversidade genética e filogenia de sete isolados de PsinSNPV (IA a IG), sequências parciais dos genes lef-8 e lef-9(late expression factor), pif-2 (per os infectivity factor 2),phr (DNA photolyase) e polh/gran (polyhedrin/granulin)foram obtidas e árvores filogenéticas foram construídas usando análises da máxima parcimônia (MP) e Bayesiana (IB).DNA de sete isolados foi amplificado por PCR utilizando oligonucleotideos degenerados específicos aos genes lef-8, lef-9, pif-2, phr e polh/gran e as sequências obtidas foram de 513, 260, 357, 780 e 510 pb de tamanho, respectivamente. Para cada gene, as sequências alinhadas mostraram pouco polimorfismo nucleotídico entre os isolados de PsinSNPV. A relação filogenética de PsinSNPV com outros 57 baculovirus sequenciados foi também determinada a partir de sequências nucleotídica e peptídica, individual e concatenada, dos genes lef-8, lef-9, pif-2 e polh/gran. As árvores filogenéticas demostraram que PsinSNPV agrupou-se com os baculovirus do gênero Alphabaculovirus Grupo II, onde PsinSNPV é mais proximamente relacionado ao Chrysodeixis chalcites NPV (ChchNPV) e Trichoplusia ni SNPV (TnSNPV). Árvores filogenéticas por máxima parcimônia e Bayesiana foram obtidas da concatenação das sequências nucleotídicas dos cinco genes lef-8, lef-9, phr, pif-2 epolh, onde pif -2 foi o mais variável. As árvores exibiram dois grupos monofiléticos estreitamente relacionados, um contendo os isolados IB, IC e ID e o outro contendo os isolados IA, IE, IF e IG. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The soybean looper (Pseudoplusia includens ; Walker, 1857) has become a major pest in soybean crops in Brazil. Seven isolates, characterized as genotypic variants of the Pseudoplusia includens single nucleopolyhedrovirus(PsinSNPV) baculovirus were obtained from P. includenslarvae collected in soybean and cotton crops in Brazil and Guatemala. In order to determine the genetic diversity and phylogeny of the seven isolates PsinSNPV (IA - IG), partial sequences of the genes lef-8and lef-9(late expression factor), pif-2 (per osinfectivity factor 2), phr (DNA photolyase) and polh/gran (polyhedrin/granulin) were obtained and phylogenetic trees constructed using maximum-parsimony (MP) and Bayesian analyses (IB). DNA from seven isolates was amplified by PCR using lef-8, lef-9, pif-2, phrand polh/gran specific degenerate primers and the sequences obtained were 513, 260, 357, 780 and 510 bp long, respectively. For each gene, the aligned sequences showed little nucleotide polymorphism between PsinSNPV isolates. The phylogenetic relationship of PsinSNPV with 57 other baculoviruses was also determined from the individual and concatenated nucleotide and amino acid sequences of the genes lef-8, lef-9, pif-2and polh. The phylogenetic trees clearly place PsinSNPV with the group II Alphabaculovirus, where PsinSNPV is most closely related to ChchNPV and TnSNPV. Maximum parsimony and Bayesian phylogenetic trees were obtained from the concatenation of the nucleotide sequence of the five genes, lef-8, lef-9, phr, pif-2 andpolh, where pif-2 was by far the most variable. The trees exhibited two closely related monophyletic groups, one containing the isolates IB, IC and ID and another containing the isolates IA, IE, IF and IG.

Dissertação (Mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-06-01T11:13:33Z No. of bitstreams: 1 2012_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 1831896 bytes, checksum: b70d1a421b0235fc55aca44a22aab16f (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2012-06-02T12:15:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 1831896 bytes, checksum: b70d1a421b0235fc55aca44a22aab16f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-02T12:15:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DanielMendesPereiraArdissondeAraujo.pdf: 1831896 bytes, checksum: b70d1a421b0235fc55aca44a22aab16f (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA dupla-fita circular que infectam insetos principalmente da ordem Lepidoptera. O problema de seu uso como inseticida é o tempo que este leva para matar o inseto hospedeiro. A fim de resolver este problema, inserção de genes inseticidas no genoma viral pode ser requerida. Uma importante fonte de proteínas inseticidas é o veneno de aracnídeos, cujo alvo e ação permanecem pouco elucidados. Assim, promopos o uso de baculovírus como ferramenta para entender mecanismo de ação de peptídeos tóxicos em células de inseto. Diante disso, diferentes versões da toxina putativa BaTx derivada de biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha caranguejeira Brachypelma albiceps foram obtidas por PCR e usadas para construção de baculovírus recombinantes. Os recombinantes foram usados para infecção de duas linhagens de lepidópteros, IPLB-Sf1-AE e BTI-Tn5B1-4 e a viabilidade celular foi avaliada durante a infecção. As diferentes versões da toxina causaram morte celular precoce por necrose em níveis diferenciados. Análise estrutural e ultraestrutural mostraram clara mudança citomorfológica em células, corroborando perda de integridade da membrana plasmática e do conteúdo citoplasmático, permanência do núcleo com carioteca intacta e associada a restos de membranas circundantes. Esta característica criou um aspecto rugoso quando observado em microscopia de luz. Além disso, o gene da toxina BaTx foi expresso em sistema procariótico para obtenção de antisoro policlonal murino. Entretanto, quando testado contra extratos de células infectadas com recombinantes, não houve marcação. Fato este esperado, uma vez que a toxina não foi observada em gel SDS-PAGE. Não há relatos de genes de toxinas de aranha com ação citotóxica clonadas em baculovírus, provavelmente esta característica não permitiu que houvesse acúmulo da toxina em níveis diagnosticáveis por imunomarcação ou pode ter promovido instabilidade peptídica. Peptídeos formadores de canais apresentam alto conteúdo de resíduos básicos (arginina e lisina), de cisteínas e conformação em folha-beta. BaTx apresenta todas estas características, porém alvo e ação permanecem obscuros. Canais tipo-TRP são encontrados em insetos e há indícios da presença desses transportadores na membrana plasmática e em membranas intracelulares. Talvez estes canais possam ser o alvo de ação da toxina BaTx. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are dsDNA circular virus infectives to insects mainly from the Order Lepidoptera. Its biopesticide use problem is the time of death during insect infection. To solve this problem, insecticide genes can be inserted into the viral genome. An important insectice protein source is the venom of arachinids. However, the target and action of many peptides remain unclear. Baculoviruses can be used as a tool to udersatand the toxic peptides playing in insect cells. Thus, different vesions of a putative toxin were obtained from cDNA library of the tarantula Brachypelma albiceps venom gland by PCR and used to construct recombinant baculoviruses. The recombinants were used to infect two lepidopteran cell lines, IPLB-Sf1-AE and BTITn5B1- 4, and cell viability was evaluated during infection. The toxin versions caused wide and early cell death by necrosis in different levels. Structural and ultrastructural analyses showed clear cytomorphological changes, corroborating loss of the plasma membrane integrity and cytoplasmic contents, and nucleus with intact karyotheca linked with surrounding plasma membrane remains. The features created a rough aspect when those infected cells were observed by light microscopy. Furthermore, the BaTx toxin gene was expressed by a prokaryotic system to obtain murine polyclonal antiserum. However, when the antiserum was tested against infected cells extract with recombinant virus carrying the BaTx toxin no reaction was detected. This observation was expected since the toxin was not observed by SDS-PAGE. There are no reports of spider toxin genes with necrotic action cloned into baculovirus, probably this feature did not allowed toxin accumulation in detectable levels by immunoblot or it could have promoted protein instability. Channel former peptides show high content of basic amino acid residues (lysine and arginine), cystein residues, and beta-sheet conformation. BaTx presents all those features, but its target and mode of action remain unknown. TRP-like channels are found in insects and there is evidence of the presence of these iontransporters in intracellular membranes as well as in plasma membrane. Perhaps TRPlike channels can be the BaTx toxin target of action.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-10-06T18:17:33Z No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) Previous issue date: 2008 / Avanços nas técnicas de cultura de células têm possibilitado o isolamento e precisa caracterização de baculovírus mutantes. A maioria desses mutantes é derivada do vírus AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus), principalmente pela sua facilidade de propagação e estabilidade em cultura de células. Durante a rotina de purificação de um baculovírus recombinante, dois vírus mutantes derivados de AcMNPV, o vSynlitx1B12P (MutPolh) e o vSynlitx1G4 (MutApo) foram isolados (dados não publicados). A infecção pelo MutPolh não resultava na produção de poliedros e diferia da infecção tipo selvagem pela presença de massas protéicas dispersas no citoplasma. Para explicar esse fenótipo, o vírus MutPolh foi previamente investigado e análises moleculares revelaram uma mutação pontual no gene da poliedrina. Esse gene é altamente conservado entre os baculovírus e mudanças em sua seqüência nucleotídica podem levar à formação de poliedros mutantes, morfologicamente distintos do tipo-selvagem. O outro vírus mutante, o MutApo, mostrou induzir rápida e massiva morte nas células por ele infectadas. Esse mutante também foi investigado através de técnicas moleculares e foi encontrada uma inserção de DNA interrompendo um gene inibidor de apoptose (p35). Neste trabalho analisaram-se os efeitos citopatológicos desses dois mutantes em células de inseto das linhagens Sf-21 e Tn-5B. Estudos estruturais e ultraestruturais confirmaram os resultados das análises moleculares prévias feitas para esses mutantes. As observações ultra-estruturais feitas em células infectadas pelo MutPolh submetidas a imunomarcação mostraram que os agregados protéicos encontrados no citoplasma dessas células eram, de fato, acúmulo de poliedrina não cristalizada. Ainda, o mutante MutApo mostrou induzir eventos característicos da apoptose nas células dessas linhagens. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Advances in cell culture techniques allowed the isolation and precise characterization of baculoviruses mutants. The majority of these mutants is derived from the virus AcMNPV, mainly due to its facility of propagation and stability in cell culture. During the purification routine of a recombinant baculovirus, two mutants derived from AcMNPV, vSynlitx1B12P (MutPolh) and vSynlitx1G4 (MutApo) were isolated (unpublished). The insect cell by the MutPolh did not result in polyhedra production and differed from wild-type infection by the presence of proteinaceous masses dispersed in the cytoplasm. To explain this phenotype, the virus MutPolh was previously investigated and molecular analysis revealed a point mutation in the polyhedrin gene. This gene is highly conserved among baculoviruses and changes in its nucleotide sequence may lead to mutant polyhedra, morphologically different from the wild-type. The other mutant virus, MutApo, was show to induce quick and massive cell death in infected cells. This mutant was also investigated and was found a DNA insertion interrupting an inhibitor of apoptosis gene (p35). In this work, the cytopathologic effects induced by these two mutants in Sf-21 and Tn-5B insect cell lines were analyzed. Structural and ultrastructural studies confirmed the findings of the molecular analysis previously done for these mutants. The observation of MutPolh-infected cells revealed that the proteinaceous aggregates found in the cytoplasm were, actually, accumulation of uncrystalized polyhedrin. Observations of cells infected by the MutApo mutant also confirmed previous information, showing that this mutant induces characteristic apoptosis events in these insect cell lines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-12-23T13:36:55Z No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-06T16:18:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-06T16:18:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) Previous issue date: 2007-02-15 / A Dengue é a doença humana transmitida por mosquitos mais comum que pode evoluir para um doença potencialmente letal denominada de febre hemorrágica do dengue (FHD). Essa doença é causada por um vírus de RNA fita simples, senso positivo e envelopado que pertence ao gênero Flavivirus, onde o genoma é organizado em uma única fase aberta de leitura (ORF), que codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré- M e envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Entre as proteínas virais, a proteína do envelope é uma das mais antigênicas e a proteína NS1 está relacionada com a lise de células infectadas, mediada pelo sistema complemento. Diferentes sistemas de expressão podem ser usados para a expressão de antígenos virais para o desenvolvimento de vacinas e/ou diagnóstico. Entre estes sistemas, o sistema de expressão baseado em baculovírus (BEV) é um dos mais populares e eficientes. Baculovírus infectam artrópodes, principalmente insetos e possuem um genoma de DNA circular, dupla fita. Existem muitas vantagens do BEV em relação a outros sistemas de expressão, como, por exemplo, o alto nível de expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que foram, então, usados para infectar larvas de Spodoptera frugiperda. Extratos de tecido adiposo de larvas infectadas (96 h.p.i.) foram analisadas por SDS-PAGE e Western- blot, usando um anticorpo contra o vírus do dengue, que detectou um polipeptídeo por volta de 70 kDa em ambos os extratos. Esse polipeptídeo é diferente do tamanho predito da proteína do envelope (~50 kDa) e das proteínas do envelope mais NS1 fusionadas (~90kDa). Entretanto, a análise transcricional confirmou que os genes estavam sendo transcritos em células infectadas. Nós também usamos o virus vAcDENS1 em um ensaio de fusão de membrana e confirmamos a formação de sincício dependente de pH, o que é uma característica da proteína do envelope do vírus do dengue. O gene NS1 foi também clonado em um plasmídeo, sob o comando do promotor hsp70 de Drosophila melanogaster e usado em uma co-transfecção com um plasmídeo contendo um gene de resistência à puromicina, visando a construção de células de inseto estavelmente transformadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and its infection may evolve to a potentially lethal disease known as Dengue haemorrhagic fever (DHF). This disease is caused by a positive-sense, single-stranded, enveloped RNA virus that belongs to the genus Flavivirus within Flaviviridae and its genome is organized in a single ORF which encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS12b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is one of the most antigenic and NS1 play a possible role in complement-mediated cytolysis. Different heterologous expression systems may be used for the expression of viral antigens for vaccine and/or diagnosis development. Among these, the Baculovirus Expression System (BEV) is one of the most popular and efficient system. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using BEV, when compared to other expression systems, such as high expression levels and post-translational modifications that allows the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. A Brazilian Dengue 1 isolate was used to amplify the envelope gene alone or envelope plus NS1 gene by RT-PCR using specific oligonucleotides and cloned into the commercial transfer vector pFastBac1 (Invitrogen). This plasmid has site-specific regions which allows transposition of the chosen insert into a baculovirus genome (bacmid) propagated in Escherichia coli. The recombinant bacmid DNA is used to obtain recombinant baculovirus and heterologous protein expression in virus-infected insect cells. Two different recombinant virus were obtained, vAcDE and vAcDENS1, and they were used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) were analysed by SDS-PAGE and Western blot using an anti-Dengue antibody which detected a polypeptide around 70 kDa in both extracts. The size of this polypetide is different from the predicted size of the envelope protein (~50 kDa) and the fused envelope and NS1 proteins (~90kDa). However, transcriptional analysis confirmed that the genes were being transcribed in infected cells. We also used the vAcDENS1 virus in a membrane fusion assay and confirmed pH-dependent syncytium formation, which is a characteristic of the dengue virus envelope protein.. The NS1 gene alone was cloned under the control of hsp70 promoter and used to co-transfect insect cells with a plasmid containing the puromycin resistance gene, in order to produce stably transformed insect cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2012-01-24T20:24:06Z No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-01-24T20:24:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-24T20:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA originalmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado e hoje baculovírus podem ser aplicados para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo podem ser utilizados como vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero, entretanto estudos comprovam que são capazes de entrar nessas células e produzir algumas proteínas virais. Apresentam ainda capacidades imunoestimulatórias e o estudo da interação baculovírus-saúde humana se torna cada vez mais importante com o aumento das várias aplicações biomédicas do uso desse vírus. Esta tese teve como objetivos, avaliar os efeitos imunológicos e a segurança dos baculovírus para vertebrados e o seu uso como vetores de expressão para produção de insumos biotecnológicos pela expressão das proteínas dos envelopes dos vírus da Febre Amarela e Vírus da Raiva. Para avaliar os efeitos imunológicos em vertebrados, foi realizada a inoculação intranasal de camundongos BALB/c com os dois fenótipos (ODVs contidos nos corpos de inclusão poliédrica, OB ou PIB e vírus extracelular, BV) dos baculovírus AcMNPV e AgMNPV. Foi demonstrado que os baculovirus são capazes de modular a resposta imune de mamíferos in vivo e in vitro. BVs ou PIBs de AgMNPV podem aumentar uma resposta de células Th1 e podem ser considerados mais úteis como vetores de vacinação ou adjuvantes imunológicos do que AcMNPV. AgMNPV na forma selvagem ou recombinante, pode ser também utilizado para alterar o tipo de resposta adaptativa desenvolvida. Com relação à expressão de proteínas heterólogas em células de inseto, os genes da proteína do envelope (E) do vírus da Febre Amarela (YFV) e da glicoproteína 16 G (RVGP) do vírus da Raiva foram introduzidos no genoma de um baculovírus e expressas em células de inseto. Tanto a proteína recombinante E (derivadas de YFV) como a proteína RVGP (derivada do vírus da Raiva) fusionada à proteína poliedrina de baculovírus foram antigenicamente similares às proteínas dos vírus selvagens, mostrando potencial para uso diagnóstico ou vacinal. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are DNA viruses originally used only as a biological control because they are able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 70's and 80's, its potential as a tool for expression of heterologous proteins began to be explored and today it can be applied to express vaccine or diagnosis antigens and can even be used as vectors for gene therapy and DNA vaccines. Its biosafety is guaranteed by the fact of not being able to replicate in mammalian cells but studies show that they are able to enter this cells and produce some viral proteins. They also present immunostimulating capabilities and the study of human health-baculovirus interaction becomes increasingly important with the increasing number of biomedical applications of using this virus.. This thesis had as objectives, to evaluate the immunological effects and safety of baculoviruses for vertebrates and to use baculoviruses as expression vectors for the production of biotechnological products by the expression of envelope proteins from yellow fever virus and Rabies Virus., In order to evaluate the effects of baculovirus in the immune system of vertebrates, intranasal inoculation of BALB / c mice with both phenotypes (ODVs in polyhedral inclusion bodies, OB and extracellular virus, BV) of AgMNPV and AcMNPV baculovirus was performed. It was shown that baculovirus was able to modulate the immune response in mammals in vivo and in vitro. BVs or PIBs of AgMNPV can increase a Th1 response and may be more useful as vectors for vaccination or immune adjuvants than AcMNPV. Wild or recombinant AgMNPV can also be used to change the type of adaptive response developed. Regarding the heterologous expression of proteins in insect cells, the the envelope protein gene of Yellow Fever virus and the glycoprotein G gene of Rabies virus were introduced into the genome of a baculovirus e expressed in insect cells. Both the recombinant proteins (E derived from YFV and RVGP derived from Rabies virus and fusioned with 18 polyhedrin of baculovirus) were shown to be antigenically similar to the wild type proteins, showing potential to be used for vaccine development or diagnosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-29T13:51:11Z No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / O lepidóptero Condylorrhiza vestigialis é uma das principais pragas desfolhadoras da cultura de álamo no Brasil. Como uma alternativa de controle desta praga, o baculovírus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) vem sendo aplicado em plantações de Álamo na região de Cascavel-PR. Devido à ocorrência no campo de lagartas mortas por infecção viral apresentando tegumento liquefeito e intacto, os genes virais catepsina (v-cath) e quitinase (chiA), essenciais para a liquefação do tegumento da lagarta morta por vírus, foram investigados quanto a sua presença ou ausência nos genomas de dois isolados de campo de CoveMNPV. A amplificação destes genes por PCR usando oligonucleotídeos degenerados foi altamente inespecífica em ambas as amostras. Embora os produtos detectados em gel de agarose fossem dos tamanhos esperados, as suas sequências não corresponderam aos genes v-cath e chiA, indicando uma possível ausência desses genes no genoma de CoveMNPV. Bioensaios demonstraram um comportamento semelhante para ambas às amostras de campo, onde à maioria das lagartas mortas apresentou o tegumento íntegro. Os perfis de restrição do DNA viral, gerados pela clivagem com cinco endonucleases de restrição (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII e PstI), foram idênticos para ambos os isolados, tanto para bandas principais como submolares. Para melhor entender as diferenças nos dois isolados de campo de CoveMNPV, seus genomas foram sequenciados utilizando o sequenciador automático FLX 454 (Roche). Após a montagem, anotação e análise, os dois isolados foram comparados por meio da avaliação de polimorfismos, onde o percentual de similaridade entre eles foi de 99.97%. O genoma do CoveMNPV é de 125.767 pares de base (pb) e tem um conteúdo G+C de 42.9%, e contém 138 fases abertas de leitura (ORFs), 9 bros e 4 hrs. Análise filogenética baseada nas sequências deduzidas de aminoácidos do genoma completo e nas sequências nucleotídicas de 11 genes comuns a todos os baculovírus (core genes) classificou o CoveMNPV como espécie irmã do clado AgMNPV/CfDEFMNPV. A ausência dos genes v-cath e chiA foi confirmada no genoma de ambos os isolados, e análise filogenética do locus lef-7/gp64 sugere que este evento tenha ocorrido no ancestral do AgMNPV, CfDEFMNPV e CoveMNPV. Com base na presença de bandas submolares no perfil de restrição do DNA dos isolados de CoveMNPV, clones virais foram purificados por plaque assay a partir de uma das misturas de genótipos de campo. Três destes clones, nomeados CoveMNPV-C2, -C6 e -C8, foram selecionados e amplificados in vivo e in vitro. Análise comparativa dos DNAs não mostrou qualquer alteração entre os perfis de restrição gerados por BstEII, HindIII e PstI, sugerindo a não recuperação do genótipo de campo após a primeira passagem dos clones in vivo. Os clones foram submetidos a ensaios de infectividade in vivo e in vitro, evidenciando diferenças nos seus graus de virulência. Além disto, os OBs dos clones demonstraram diferenças na morfologia do poliedro como revelado por microscopia eletrônica de transmissão. Com base nestes dados, os genes polh e fp25k responsáveis pela formação do poliedro, antes e após a passagem dos clones in vivo, foram amplificados e sequenciados. Nenhuma alteração no gene polh foi detectada, mas o gene fp25k do C8 e C6 apresentou uma mutação frameshift pela inserção de um único nucleotídeo resultando em uma proteína truncada. Após a passagem destes clones in vivo houve uma diminuição na frequência do mutante com relação ao selvagem. Os OBs do C8 apresentaram poucos ou nenhum ODV no seu interior, fenótipo este esperado para um fp25k mutado, e o que também justifica sua menor virulência observada em ensaios in vivo. O clone que se mostrou mais virulento em ensaios in vivo, CoveMNPV-C2, foi similar ao isolado de campo após passagem in vitro, não mostrando qualquer mutação no gene fp25k e produzindo ODVs oclusos. Estas evidências sugerem que este clone é geneticamente mais estável, uma vez que não houve alteração em consequência da passagem em cultura de células, enquanto que os outros clones foram identificados como mutantes de poucos poliedros (FP: few polyhedra). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lepidopteran, Condylorrhiza vestigialis is a major defoliating pest of poplar in Brazil. The baculovirus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) has been applied in poplar plantations in the region of Cascavel-PR as an alternative to chemical control of this pest. Due to the occurrence of dead caterpillars in the field with either intact or liquefied integument, the presence or absence of virus-encoded cathepsin (v-cath) and chitinase (chiA) genes, essential for the liquefaction of the integument of caterpillars killed by virus, were investigated in the genomes of two CoveMNPV field isolates. Amplification of these genes by PCR using degenerate primers was highly nonspecific in both samples. Although some products detected by agarose gel electrophoresis were of the expected sizes, their sequences did not correspond to the v-cath and chiA genes, indicating a possible lack of these genes in the CoveMNPV genome. Bioassays showed a similar behavior for both field samples, where most killed caterpillars possessed an intact integument. The restriction profiles of the viral DNA, generated by cleavage with five restriction endonucleases (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII and PstI), was identical in the two isolates, for both major and submolar bands. To better understand the differences in the two CoveMNPV field isolates, their genomes were sequenced using the 454 FLX automated sequencer (Roche). Following assembly, annotation and analysis, the two genomes were compared to evaluate polymorphisms, where the percentage similarity between them was 99.97%. The CoveMNPV genome is 125,767 base pairs (bp) and has a G+C content of 42.9%, and contains 138 open reading frames (ORFs), 9 bros and 4 hrs. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences of the complete genome and nucleotide sequence of 11 core genes placed CoveMNPV as sister to AgMNPV and CfDEFMNPV. The absence of v-cath and chiA genes was confirmed in the genome of both isolates, and phylogenetic analysis of the lef-7/gp64 locus suggests that this event occurred in the ancestor of AgMNPV, CfDEFMNPV and CoveMNPV. Based on the presence of submolar bands in DNA restriction profiles of CoveMNPV isolates, viral clones were purified by plaque assay from a mixture of field genotypes. Three of these clones, named CoveMNPV-C2, -C6-and -C8, were selected and amplified in vivo and in vitro. Comparative DNA analyses showed no change in the restriction profiles generated by BstEII, HindIII and PstI suggesting the no recovery of field genotype after the first passage of the clones in vivo. The clones were also subjected to in vivo and in vitro infectivity assays, showing differences in their degree of virulence. Furthermore, the OBs of the clones also demonstrated differences in polyhedron morphology as revealed by transmission electron microscopy. Based on these data, the polh and fp25k genes responsible for polyhedron formation, before and after passage of the clones in vivo, were amplified and sequenced. No change in the polh gene was detected, but the fp25k gene of C8 and C6 showed a frameshift mutation by insertion of a single nucleotide resulting in a truncated protein. After the passage of these clones in vivo there was a decrease in the frequency of the mutant relative to the wild-type. The OBs of C8 had few or no ODVs inside, which is the expected phenotype for an fp25k-defective mutant, and also explains its lower observed virulence in in vivo assays. The clone showing greater virulence in in vivo assays, CoveMNPV-C2, was similar to the field isolate after passage in vitro, did not show any mutation in the fp25k gene and produced occluded ODVs. This evidence suggests that this clone is genetically more stable, since it did not change as a result of passage in cell culture, whereas other clones were identified as few polyhedra (FP) mutants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-27T13:27:34Z No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / O silenciamento gênico, ou RNA de interferência (RNAi), atua como um mecanismo de defesa contra infecções virais em organismos eucarióticos. Ao longo da evolução, os vírus adquiriram proteínas específicas com a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em diferentes pontos do processo. Como por exemplo, as proteínas AC2 de begomovírus, NS1 do vírus da gripe (Influenza A) e NSs de um tospovírus (Tomato spotted wilt virus - TSWV). Neste estudo, pretendeu-se induzir mecanismos de supressão de silenciamento gênico através da expressão heteróloga de AC2, NS1 e NSs por baculovírus AcMNPV – Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, a fim de analisar o efeito na replicação viral em diferentes células de inseto. Assim, no primeiro capítulo, foi feita uma revisão sobre o silenciamento gênico, a ação de proteínas virais supressoras de RNAi e o uso potencial de baculovírus recombinantes como agentes bioinseticidas melhorados. O segundo capítulo descreve a clonagem dos genes AC2, NS1 e NSs, a construção dos baculovírus recombinantes (vAcAC2, vAcNS1 e vAcNSs) e os ensaios preliminares de infecção em célula e em larvas de inseto. Nesses ensaios, o vAcNSs (contendo o gene NSs) foi o recombinante com maior influência na replicação do baculovírus selvagem AcMNPV. Por sua vez, o terceiro capítulo relata a ação da proteína supressora de silenciamento NSs de TSWV, expressa pelo baculovírus vAcNSs, em três linhagens hospedeiras: uma permissiva, derivada de Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); outra semipermissiva, derivada de Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); e, uma linhagem não-permissiva, derivada de Bombyx mori (BM-5). Os resultados mostraram que vAcNSs, em células semipermissivas, obteve maior eficiência na replicação quando comparado ao selvagem, pois produziu mais vírus extracelulares; em uma linhagem celular não-permissiva, causou efeito citopático, enquanto a infecção com o tipo selvagem AcMNPV não provocou nenhuma alteração morfológica; aumentou a produção de poliedros do baculovírus tipo selvagem em todas as linhagens de células testadas; aumentou fortemente a expressão da proteína fluorescente verde (EGFP) nas células semipermissivas e em hemócitos de A. gemmatalis quando co-infectado com um AcMNPV recombinante contendo o gene egfp. A análise de microscopia confocal revelou que a NSs acumulou em abundância no citoplasma de células permissivas e semipermissivas. Em contraste, a NSs foi detectada no núcleo da célula não-permissiva. A ausência de moléculas curtas de RNA (siRNA) de transcritos de egfp em linhagens semipermissivas e permissivas indica atividade de supressão do silenciamento gênico. Por outro lado, vAcNSs não suprimiu o RNAi na linhagem celular nãopermissiva. Por fim, o quarto capítulo investiga a ação bioinseticida do baculovírus vAcNSs em larvas de Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis - um hospedeiro permissivo e outro semi-permissivo, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a DL50 do vAcNSs para S. frugiperda e A. gemmatalis, quando comparada à DL50 observada para o tipo selvagem AcMNPV. Entretanto, o TL50 foi significativamente diferente, com valores menores para vAcNSs em S. frugiperda [5,62 dias com 1 p.f.u. e 4,82 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [7,46 dias com 1 p.f.u. e 3,2 dias com 105 p.f.u.] quando em comparação com o TL50 do AcMNPV em S. frugiperda [8,5 dias com 1 p.f.u. e 7,52 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [20,11 dias com 1 p.f.u. e 7,34 dias com 105 p.f.u.]. Estes resultados corroboram os dados observados in vitro, indicando que a proteína NSs de TSWV aumenta a replicação do baculovírus e pode contribuir para gerar bioinseticidas mais eficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Gene silencing, or RNA interference (RNAi), works as a eukaryotic defense mechanism against viral infections. During evolutionary time viruses acquired specific proteins, which are able to halt the silencing process in different steps of its biochemical pathway e.g. the AC2 protein from Begomovirus, the NS1 protein from influenza (Influenza A) and the NSs protein from Tomato spotted wilt virus (TSWV). In this study we sought generation and evaluation of the gene-silencing suppression effect of three different genes, AC2 from begomovirus, NS1 from Influenza A and NSs from TSWV, via heterologous expression by recombinant Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV, genus Alphabaculovirus, family Baculoviridae) in different insect cell lines. In the first chapter, a review concerning gene silencing, suppression of gene silencing by viral proteins and the potential use of recombinant baculovirus as bio-insecticidal agents suitable for biological control is presented. The second chapter describes the cloning strategies designed for the construction of recombinant baculoviruses carrying the AC2, NS1 and NSs genes (vAcAC2, vAcNS1 and vAcNSs, respectively) as well as the results of preliminary insect cell infection assays. In these preliminary assays, vAcNSs had more influence on wild type AcMNPV replication than vAcAC2 and vAcNS1. The third chapter shows the effect of the protein NSs from TSWV on virus replication in different host insect cell lines: one permissive, Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); other semi-permissive, Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); and a non-permissive cell line, Bombyx mori (BM-5). Results showed that infection of the semi-permissive cell line by vAcNSs was more efficient than infection by wild type AcMNPV, since production of budded virus was higher. In the non-permissive cell line, vAcNSs was able to produce cytopathic effects whereas no morphological alteration was found when wild type AcMNPV was inoculated. When vAcNSs and wild type AcMNPV were co-inoculated, production of polyhedra was enhanced despite the insect cell line used. Co-infection of vAcNSs and a recombinant AcMNPV carrying the egfp gene was also evaluated. In the semi-permissive cell line and in A. gemmatalis hemocytes (permissive cell line) co-infection greatly increased enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression. Northern blotting assays showed absence of small interfering RNA (siRNA) molecules associated to egfp transcripts in the permissive and semi-permissive cell lines, which indicates suppression of gene silencing activity by the NSs protein. On the other hand, vAcNSs was not able to suppress the siRNA production in the non-permissive cell line. Confocal microscopy analysis showed that the NSs protein accumulated abundantly in the cytoplasm of permissive and semipermissive infected cells. In contrast, high amounts of NSs were detected in the nuclei of nonpermissive cells. Finally, chapter four presents the study of the bio-insecticidal activity of vAcNSs on Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, a permissive and semipermissive host, respectively. The vAcNSs LD50 for S. frugiperda and A. gemmatalis was not statistically different from wild-type AcMNPV. However, the LT50 values were significantly smaller for vAcNSs in S. frugiperda [5.62 days with 1 p.f.u. and 4.82 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [7.46 days with 1 p.f.u. and 3.20 days with 105 p.f.u.) when compared to the LT50 for AcMNPV in S. frugiperda [8.5 days with 1 p.f.u. and 7.52 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [20.11 days with 1 p.f.u. and 7.34 days with 105 p.f.u.]. These in vivo results are in accordance with the data observed in vitro indicating that the protein NSs from TSWV could efficiently improve baculovirus replication and be used to generate more effective bioinsecticides.

Orientador : Octavio Henrique de Oliveira Pavan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T16:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia-Canedo_AlejandraMariaG_M.pdf: 4619225 bytes, checksum: 161aebc5592898277bfc4cb85606a52f (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Dois baculovírus diferentes, o vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs) e o Vírus de Poliedrose Nuclear de Anticarsia gemmatalis (VPNAg), foram inoculados em lagartas de D.saccharalis. Os efeitos da infecção dos dois vírus foram estudadas inoculando-os de maneira isolada, simultânea e alternada. A dose utilizada para ocasionar uma mortalidade semelhante foi 100 vezes maior para o VPNAg cujo hospedeiro original pertence a outra família de Lepidoptera. A alta produção de poliedros e grânulos dos dois vírus, Obtida tanto quando ambos foram inoculados simultaneamente como quando um deles é pré-inoculado, demonstra a inexistência de qualquer tipo de interferência na multiplicação ou desenvolvimento dos vírus no mesmo hospedeiro. O estudo comparativo da infecção desses dois vírus nos tecidos gorduroso e intestinal, através da utilização de microscopia de contraste de fase, mostrou que ambos são capazes de se multiplicar e formar uma grande quantidade de cristais virais em células diferentes do tecido gorduroso, o que indica que a infecção por um vírus modifica a célula de maneira a deixa-la incapaz de permitir uma segunda infecção. No tecido intestinal, no entanto, somente foram encontrados poliedros. A presença do VPNAg em mais de um tecido, e a alta quantidade de cristais formados, muitas vezes maior que a do VGDs, demonstra a sua capacidade de propagar a infecção dentro do inseto uma vez iniciada. Assim sendo, a baixa virulência do VPNAg (verificada pelo alto valor de DL50), parece dever-se à existência de somente alguns variantes genéticos com capacidade para a invasão na população originalmente utilizada. O VGDs e o VPNAg apresentam diferentes períodos de incubação e o período mais curto conferiu uma vantagem, no desenvolvimento, ao VPNAg quando inoculado em indivíduos mais velhos. O tipo de interação obtido, analisando-se os valores de mortalidade larval quando os dois vírus foram inoculados simultaneamente, foi do tipo aditivo, não sendo encontrado efeito sinergístico ou antagônico o que sugere a ação independente de cada vírus. A multiplicação viral no organismo da lagarta parece ser suficientemente veloz de tal forma a evitar que uma segunda inoculação, aplicada 24 horas após a primeira aumente de maneira significativa a mortalidade larval. Assim sendo a quantidade de vírus formados mascararia o efeito da segunda dose viraI. O desenvolvimento dos dois vírus em células do mesmo tecido, que poderia gerar o surgimento de recombinantes genéticos, não foi investigado mais detalhadamente, porém, não se observou o aparecimento de cristais, morfológica ou numericamente diferentes dos utilizados originalmente que pudesse indicar tal acontecimento / Abstract: Two baculoviruses, the Diatraea saccharalis Granulosis Virus (DsGV) and the Anticarsia gemmatalis Nucleopolyhedrosis Virus (AgNPV), were studied infecting the sugarcane borer (SCB), D. saccharalis. The effects of the infecting of these two viruses were analysed by their inoculation simultaneously, sequencially and individually. Being a original virus of the SCB, the DsGV was inoculated in a dose 100 fold smaller than the AgNPV whose original host belongs to a different family of Lepidoptera. Regardless of the inoculation timing being simultaneous or sequencial in one order or the other, a high inclusion body production was observed for both viruses. This type of result discards the possibility of interference between the two pathogens. A comparative study of the infection process of both viruses in the fat body and intestinal tissue, in phase-contrast microscopy, showed their ability to replicate and produce normal inclusion bodies in high amounts in different fat body cells. In the intestinal cells only AgNPV was able to develop and produce polyhedra while no sign of the granules of DsGV were observed. In the fat body, even though neighboring cells were found to bear both types, thus, suggesting some type of inhibitory mechanism. Despite the fact that the AgNPV is developing in an alternate host, thus, having a high LD50 value, once it infects the larvae it is able to develop in a typical infection process. The AgNPV develops in several tissues, producing regular polyhedra in graet amounts, in most cases, more than the capsule production by DsGV. These observations suggest a barrier in host at invasion level being determined by a Iow frequency of genetic variants being able to start infection in the population. The DsGV and AgNPV in the SCB present different infection processes being the AgNPV faster in killing the insect, thus, showing more effectiveness in older larvae. The interaction observed between the two baculoviruses was of the aditive type while no synergism or interference type of effect was observed suggesting independent and non competitive behavior between the two pathogens. As suggested by previous data, the viral replication seems to be fast enough as to eliminate any significant mortality increase by a second inoculation performed after 24 hours following the first inoculum. The simultaneous development of the two different virus in the same individual and same body tissue could result in genetic recombinants. However, further studies should be conducted to confirm these preliminary observations / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas