Introdução: A incidência de tumores adrenocorticais em crianças é particularmente elevada nas regiões sudeste e sul do Brasil, correlacionandose com a ocorrência da mutação germinativa p.R337H do supressor tumoral p53, entretanto, o carcinoma adrenocortical é uma neoplasia endócrina maligna rara em todo o mundo com uma incidência aproximada de 0,5 - 2 casos por milhão por ano. Esta condição é uma doença heterogênea, apresentando frequentemente comportamento clínico agressivo e letal. A cascata de sinalização Wnt é uma via importante de transdução de sinal em cânceres humanos e tem sido implicada na tumorigênese adrenocortical. A atividade desta via de sinalização é dependente da quantidade de beta-catenina citoplasmática e nuclear. Mutações ativadoras no gene da beta-catenina (CTNNB1) foram relatadas em diversas neoplasias humanas. Estudos demonstraram que mutações no gene CTNNB1 são os defeitos genéticos mais frequentemente encontrados em adenomas e em carcinomas adrenocorticais. O estudo destas mutações demonstrou que as alterações no gene CTNNB1 localizam-se principalmente exon 3, que codifica a porção amino terminal da beta- catenina. Objetivos: determinar a ocorrência e a frequência das mutações somáticas no exon 3 do gene CTNNB1. Adicionalmente, determinar a imunorreatividade de beta-catenina e de p53 em tumores adrenocorticais benignos e malignos de crianças e adultos. Correlacionar os resultados da análise de mutações gênicas e os dados de imunorreatividade com as características hormonais, a mutação p.R337H do p53, o diagnóstico histológico e a evolução dos tumores adrenocorticais de crianças e adultos. Métodos: Neste estudo, a análise de imunohistoquímica para beta-catenina e p53 foi realizada em 103 tumores adrenocorticais benignos e malignos (40 crianças e 63 adultos), estando as amostras histológicas alocadas em micromatriz tecidual (TMA). A pesquisa de mutações no exon 3 do gene CTNNB1 foi determinada por seqüenciamento automático em 64 tumores adrenocorticais. Resultados: a imunorreatividade para beta-catenina em citoplasma e/ou núcleo foi evidenciada de maneira similar nos tumores adrenocorticais benignos e malignos de crianças e de adultos (15% e 23,8%, respectivamente). O percentual das células neoplásicas imunorreativas para beta-catenina em citoplasma e/ou núcleo não foi significativamente diferente entre os tumores clinicamente benignos e malignos pediátricos (15,6% vs. 12,5%, respectivamente; p=0,93) e entre adenomas e carcinomas adrenocorticais de adultos (28,5% vs. 17,8%, respectivamente; p=0,38). A síndrome endócrina causada pelo perfil de secreção hormonal foi similar entre os tumores adrenocorticais com presença ou ausência de acúmulo citoplasmático e/ou nuclear de beta-catenina em crianças e adultos. A associação entre acúmulo anormal de beta-catenina e diminuição de sobrevida foi avaliada nos pacientes adultos portadores de carcinomas adrenocorticais isoladamente (n=25), sendo observada na curva de Kaplan- Meier uma tendência de significância (log-rank p=0,07). A análise do gene CTNNB1 revelou mutações somáticas em heterozigose em 10 tumores adrenocorticais (4 crianças e 6 adultos). As mutações encontradas no gene CTNNB1 foram, sobretudo do tipo missense (p.Ser45Pro, p.Ser45Phe, p.Asp32Asn, p.Pro44Ala_Ser45Pro; p.His36Gln_Ser37Lys). Outras mutações encontradas compreenderam: a inserção de um único nucleotídeo (p.E9GfsX14), dando origem a uma desvio de leitura do exon 3; além da deleção dos três nucleotídeos do códon 45 (p.Ser45del). Todos os tumores com mutações somáticas no gene CTNNB1 mostraram acúmulo anormal para ?-catenina, com exceção de um caso. A presença de alterações no gene CTNNB1 não se associou ao tamanho do tumor (Teste de Mann-Whitney: p=0,75), desfecho desfavorável tanto no grupo pediátrico (log-rank p=0,29) como no grupo de pacientes adultos (log-rank p=0,77). Todos os pacientes portadores da mutação germinativa do gene TP53 apresentaram imunorreatividade nuclear de p53 nas células tumorais. Não foi encontrada correlação entre a presença de acúmulo anormal de beta-catenina e imunorreatividade nuclear de p53, considerando os grupos de crianças e de adultos portadores de tumores adrenocorticais. Adicionalmente, não foi observada correlação entre mutações no gene CTNNB1, bem como acúmulo anormal de beta-catenina, com a imunorreatividade nuclear de p53 no grupo de tumores adrenocorticais de pacientes adultos, porém, interessantemente, avaliando isoladamente o grupo de tumores adrenocorticais pediátricos, foi observada relação entre a presença de mutações no gene CTNNB1 e a presença de acúmulo nuclear de p53 (X2: p=0,009). Conclusões: Estes dados confirmam a participação da via Wnt na tumorigênese adrenocortical de crianças e de adultos, que apresenta uma prevalência de ativação semelhante entre crianças e adultos. O acúmulo citoplasmático e/ou nuclear de beta-catenina provavelmente é um marcador biológico de mau prognóstico do carcinoma de adrenocortical de adultos. Adicionalmente, observamos evidências de uma correlação positiva entre mutações no gene CTNNB1 e acúmulo nuclear de p53 em tumores adrenocorticais pediátricos, confirmando uma possível relação destas duas vias na tumorigênese do córtex da glândula suprarrenal / Introduction: The incidence of adrenocortical tumors in children is particularly high in the southeastern and southern regions of Brazil, correlating with the occurrence of p.R337H p53 tumor suppressor germline mutation. However, adrenocortical carcinoma is a worldwide rare endocrine malignancy with an approximate incidence of 0.5 to 2 cases per million per year. This condition is a heterogeneous disease and is often lethal. The Wnt signaling pathway is an important signal transduction pathway in human cancers and has been implicated in adrenocortical tumorigenesis. The activity of this signaling pathway is dependent on the amount of nuclear and cytoplasmic beta-catenin. Activating mutations of ?-catenin (CTNNB1) gene have been reported in several human malignancies. Studies have shown that CTNNB1 mutations are the most common genetic defect found in adrenocortical adenomas and carcinomas. The study of these mutations demonstrated that the changes in CTNNB1 gene are mainly located in exon 3, which encodes the amino terminal portion of the beta- catenin. Objectives: to determine the occurrence and frequency of CTNNB1 somatic mutations and the abnormal beta-catenin and p53 accumulation in benign and malignant adrenocortical tumors in both children and adults. We also evaluated the correlation of the gene mutations analysis and immunohistochemistry data with the hormonal characteristics, the p.R337H germline mutation, the histological diagnosis and the prognosis of adrenocortical tumors in children and adults. Methods: In this study, immunohistochemistry for beta-catenin and p53 was performed in 103 benign and malignant (40 children and 63 adults) adrenocortical tumors. The histological samples were allocated in a tissue microarray (TMA). The study of the CTNNB1 gene was performed by direct sequencing of 64 adrenocortical tumors. Results: The beta-catenin abnormal accumulation was similar in benign and malignant adrenocortical tumors of children and adults (15 % and 23.8 %, respectively). The percentage of cells with beta-catenin abnormal accumulation was not significantly different between benign and malignant pediatric adrenocortical tumors (15.6% vs. 12.5 %, respectively; P=0.93) and between adrenocortical adenomas and carcinomas in adults (28.5% vs 17.8 %, respectively; p=0.38). The endocrine syndrome caused by hormonal tumor secretion was similar in patients with and without beta-catenin abnormal accumulation both in pediatric and adult patients. The association between beta-catenin abnormal accumulation and decreased survival was evaluated in adult patients with adrenocortical carcinomas (n=25) and a trend toward significance was observed (log-rank p=0,07). The analysis of the CTNNB1 gene revealed heterozygous somatic mutations in 10 adrenocortical tumors (6 adults and 4 children). The mutations found in CTNNB1 gene were mainly missense (p.Ser45Pro, p.Ser45Phe, p.Asp32Asn, p.Pro44Ala_Ser45Pro; p.His36Gln_Ser37Lys). Other mutations found included: a single nucleotide insertion (p.E9GfsX14) and a deletion within codon 45 of exon 3 of CTNNB1 gene, (p.Ser45del). All tumors with somatic mutations in the CTNNB1 gene showed abnormal beta -catenin accumulation, except for one case. The mutations in CTNNB1 gene was not associated with tumor size (Mann - Whitney: p=0.75), unfavorable outcome in both pediatric (log -rank p=0.29) and adult group of patients (log-rank p=0.77). All patients with TP53 germline mutation showed p53 nuclear accumulation in the tumor cells. No correlation was found between the presence of beta-catenin abnormal accumulation and p53 nuclear accumulation in adrenocortical tumor cells of children and adults. In addition, no correlation was observed between CTNNB1 mutations, as well as beta-catenin abnormal accumulation, with p53 nuclear accumulation in adults adrenocortical tumors. Interestingly, the evaluation of pediatric adrenocortical tumors revealed a relationship between the occurrence of CTNNB1 mutations and the presence of p53 nuclear accumulation (X2: p=0.009). Conclusions: These data confirm the involvement of the Wnt pathway in adrenocortical tumorigenesis of children and adults, which has a prevalence similar activation between children and adults. We observed that abnormal beta-catenin accumulation in adults adrenocortical carcinoma is probably associated with a dismal prognosis. Additionally, we found evidence of a positive relationship between CTNNB1 mutations and p53 nuclear accumulation in pediatric adrenocortical tumors, confirming a possible connection of these two pathways in the pediatric adrenocortical tumorigenesis

Nos mamíferos, a determinação sexual é governada pelo equilíbrio entre duas vias de sinalização paralelas e antagônicas: a via masculina SOX9/FGF9 e a via feminina RSPO1/beta-catenina/WNT4. A R-spondina 1 é uma importante reguladora do processo de diferenciação ovariana e atua modulando a via de sinalização Wnt canônica (Wnt/beta-catenina). Em humanos, mutações em RSPO1 causam uma rara síndrome genética autossômica recessiva caracterizada por Distúrbios do Desenvolvimento Sexual (DDS) 46,XX Testicular ou Ovotesticular, hiperceratose palmoplantar (HPP) e predisposição para o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas (MIM 610644). Identificamos um paciente brasileiro, proveniente de uma grande família consanguínea, que apresentava a associação de HPP e DDS 46,XX Testicular SRY negativo. A avaliação da região codificadora do gene RSPO1 identificou a nova variante alélica c.305G>A (p.Cys102Tyr). O estudo de segregação realizado em 67 familiares demonstrou que a variante c.305G>A segrega em perfeita concordância com o fenótipo de HPP, exibindo um padrão de herança autossômico recessivo. Na família foram identificados 10 indivíduos afetados pelo fenótipo de HPP. As avaliações clínica e hormonal e os estudos molecular e citogenético nesses indivíduos resultou na caracterização de: (a) quatro indivíduos do sexo masculino 46,XX e/ou SRY negativo, com ambiguidade genital e perfil hormonal alterado; (b) cinco indivíduos do sexo masculino 46,XY e/ou SRY positivo, sem ambiguidade genital, com perfil hormonal normal e (c) uma mulher 46,XX, fértil. Experimentos de transfecção transitória in vitro demostraram que a proteína mutante tem menor capacidade de transativação do plasmídio reporter da via Wnt. As simulações de dinâmica molecular constataram que a troca p.Cys102Tyr aumenta a flexibilidade do backbone da R-spondina-1, diminuindo a energia de ligação da proteína ao complexo de receptores, LGR5 e RNF43. Em conjunto, nossos achados demonstram que a variante c.305G > A é patogênica, sendo responsável pela síndrome genética diagnosticada na família brasileira. As análises de expressão gênica e os estudos de imuno-histoquímica, por sua vez, detectaram um aumento da expressão do gene SOX9 e maior imonorreatividade para a proteína Sox9 no tecido testicular do caso índice. Esses resultados sugerem que o processo de reversão sexual nos indivíduos XX ocorra por uma hiperexpressão de SOX9 secundária à menor ativação da via Wnt/beta-catenina na gônada durante a embriogênese. No presente estudo também relatamos o primeiro caso de indivíduo de cariótipo 46,XX portador de mutação em homozigose no gene RSPO1 que não desenvolveu DDS. A variabilidade do fenótipo sexual não está associada com alterações no número de cópias dos genes WNT4 ou do SOX9 e região cis-regulatória. No entanto, a avaliação do exoma da família encontrou uma associação entre o polimorfismo do receptor LGR5 rs17109924 e a atenuação do fenótipo de DDS. Todavia, serão necessários estudos funcionais para esclarecer o impacto biológico da interação das variantes RSPO1 p.Cys102Tyr e LGR5 rs171099 / In mammals, sex determination is governed by the balance between two parallel and antagonic signaling pathways: the male SOX9/FGF9 and the female, RSPO1/beta-catenin/WNT4 pathways. R-spondin 1 regulates the ovarian differentiation process by its modulating action through the canonic Wnt pathway (Wnt/beta-catenin). In humans, patogenic mutations in RSPO1 cause a rare, autosomic recessive syndrome characterized by 46,XX Testicular or Ovotesticular disorders of sexual development (DSD), palmoplantar keratosis (PPK) and predisposition to squamous cell carcinoma (MIM 610644). We identified and studied a SRY-negative 46,XX DSD patient with PPK from a large, consaguineous, brazillian family. Through a \"candidate gene\" approach we identified in the proband a new allelic variant in the coding region of RSPO1, c.305G > A. This variant presented full concordance with the PPK phenotype by segregation analyses in 10 of 67 members of this family. Clinical, hormonal, cytogenetic and molecular genetic studies characterized three patterns in individuals with this variant: (a) four 46,XX and/or SRY-negative males with ambiguous genitalia and altered hormonal profile; (b) five 46,XY and/or SRY-positive males without ambiguous genitalia with normal hormonal profile; (c) one 46,XX fertile woman. In vitro experiments demonstrated that transient transfection of the mutant protein resulted in lower transactivation of the Wnt pathway-reporter plasmid. Moreover, molecular dinamic studies showed that p.Cys102Tyr increased the R-spondin-1 backbone flexibility, thus decreasing the interaction between this protein and its receptors, LGR5 and RNF43. Thus, both in vitro and in silico analysis demonstrate the pathogenicity of the RSPO1 variant c.305G > A. In addition, in the index case, a higher expression of SOX9, corroborated by a reactive immunohistochemistry in testicular tissue, suggested that the process of sexual reversal in the XX individual is driven by a higher SOX9 expression possibly due to a lower Wnt/beta-catenin signaling pathway activation during embriogenesis. In this study, we also reported the first 46,XX individual with RSPO1 mutation without DSD, in which no copy number abnormality was detected in WNT4, SOX9 and its cisregulatory regions. Whole exome sequencing of the affected individuals revealed, in turn, that the LGR5 rs17109924 polymorphism associates with a protacted DSD phenotype in the fertile woman with normal hormonal profile. Despite this evidence, future studies are nedded to address causality and biological impact between RSPO1 p.Cys102Tyr and LGR5 rs17109924 variants

La formation de la gaine de myéline est un processus complexe et finement régulé. Une altération de l’expression des gènes codant pour les protéines structurales de cette gaine entraine de graves neuropathies démyélinisantes. Notre objectif est d’identifier de nouvelles voies de signalisation capables de moduler l’expression de ces gènes. Les cellules de Schwann et les oligodendrocytes contiennent et synthétisent de grande quantité de dérivés oxydés du cholestérol : les oxystérols. Ces molécules sont connues pour leurs rôles dans le maintien de l’homéostasie du cholestérol et dans la progression des maladies neurodégénératives. Les oxystérols peuvent être classés en deux groupes : ceux dont l’oxydation a lieu sur la chaine carbonée latérale (25OH) et ceux qui portent une oxydation sur l’un des cycles du cholestérol (7KC). Nous nous sommes tout d’abord intéressés à la première catégorie d’oxystérols. Nous avons montré que le 25OH, réprimait l’expression des gènes de la myéline périphérique P0 et PMP22. Cette activité répressive était le fruit d’un mécanisme direct conduisant à une augmentation de la quantité des LXRs liés à leurs éléments de réponse sur les promoteurs des gènes de la myéline, et d’un mécanisme indirect provoquant une diminution de l’activité de la voie Wnt/β-caténine. En revanche, dans le SNC, nos résultats indiquent que le 25OH active l’expression des gènes de la myéline PLP et MBP. Le traitement, par ces oxystérols, de cultures organotypiques de cervelet démyélinisées par la lysolécithine permet une remyélinisation des axones des cellules de Purkinje. Nous nous sommes ensuite penchés sur le rôle du corégulateur transcriptionnel RIP140. Ce dernier peut soit agir comme un corépresseur soit comme un coactivateur. Il peut interagir avec le LXR. L’invalidation de RIP140 dans le poisson zèbre altère les gaines de myéline. Nous avons montré que RIP140 possédait des rôles bivalents dans la régulation de la myélinisation. En effet, il est capable d’activer mais aussi de réprimer l’activité transcriptionnelle de P0 et de PMP22. Enfin, nous nous sommes intéressés à la seconde catégorie d’oxystérols. Le 7KC est l’oxystérol majoritairement présent dans le SNP et la CS. Il est connu pour moduler l’action du récepteur aux dioxines : le AhR. Ce récepteur a été très largement étudié dans un cadre toxicologique. Cependant ses rôles et ses ligands endogènes restent à ce jour encore assez méconnus. Nos résultats indiquent que le AhR est impliqué dans le contrôle de l’expression des gènes de la myéline périphérique. L’invalidation du AhR, chez la souris, provoque des anomalies structurales de la gaine de myéline conduisant à des déficits moteurs. Cette étude a permis de mieux comprendre les dialogues entre les voies de signalisation gouvernant le processus de myélinisation. Ce travail apporte également de nouvelles perspectives thérapeutiques des maladies neurodégénératives comme la CMT1A ou la sclérose en plaques. / The myelination of axons is a complex process performed by Schwann cells (SC) and by oligodendrocytes (OL) respectively in the peripheral nervous system (PNS) and in the central nervous system (CNS). A slight change in expression of myelin structural proteins has a deep impact on the development and preservation of nerve fibers and their myelin sheaths, as observed for example in Charcot-Marie-Tooth disease or in Pelizaeus-Merzbacher disease. Our aim is to identify new signaling pathways able to control the expression of these structural proteins. SC and OL contain and synthesize high amount of reactive molecules generated from the oxidation of cholesterol: the oxysterols. Their implication in cholesterol homeostasis and in the progression of neurodegenerative disorders is well known but few data are available for their functions in myelination of PNS and CNS. Firstly, we demonstrate that oxysterols inhibit peripheral myelin gene expression: MPZ and PMP22. This downregulation is mediated by two mechanisms: by increasing the binding of LXRs to myelin genes promoters and by inhibiting the Wnt/β-catenin pathway leading to a decrease of b-catenin recruitment at the levels of the MPZ and PMP22 promoters. However, in the CNS, our data demonstrate that activation of LXRS by oxysterols stimulate myelin genes expression (PLP and MBP). Interestingly, by using demyelinated organotipc culture of cerebellum, we show that oxysterols enhance OL differentiation and promote remyelination, via LXRs. Then, we studied the role of the transcriptional coregulatory, RIP140, in myelination. RIP140 is able to act as a corepressor or as a coactivator and can interact with LXRs. In Zebrafish, the knocked down of the orthologue of RIP140 led to a decrease of peripheral and central myelin gene expression and to a defect in myelin sheath ultrastructure. Finally, we focused on impact of AhR in myelination process. AhR is a ligand activated transcription factor mostly known to interact with environmental pollutant like dioxins to mediate their toxic and carcinogenic effect. However, its detoxifying activity is posterior to the apparition of the gene and its physiological roles and endogenous ligands remain elusive. We show that the main oxysterol in the nervous system is 7-ketocholesterol which is an endogenous modulator of AhR. We report that the constitutive absence of AhR in mice leads to defects in locomotion behaviors. We studied the impact of this invalidation on the myelin of sciatic nerve. We observed a severe demyelinating phenotype and deregulation of myelin genes expression. Moreover, we demonstrated a cross-talk between AhR and Wnt/β-catenin pathways. Our data reveal a new endogenous role of AhR in myelination process.