Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T15:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RicardoBeltramede_M.pdf: 4343326 bytes, checksum: c45de34d36b3510fa7bea078864506dc (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias envolvidas na proliferação e função/disfunção da célula beta e a aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares da diabetes. A patogênese da diabetes melito tipo 2 (T2DM) é complexa, mas frequentemente está associada com obesidade e distúrbios do metabolismo de lipídios (hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia). A T2DM envolve o desenvolvimento de um quadro de resistência periférica à insulina parcialmente compensada por hiperinsulinemia e hiperplasia da célula beta pancreática, resultando em intolerância à glicose e hiperglicemia. Os mecanismos interligando os estados de obesidade/hipercolesterolemia e resistência à insulina ao fenômeno da hiperplasia da célula beta não são completamente conhecidos. A presente dissertação teve como objetivos: 1) caracterizar um modelo animal adequado para se estudar a proliferação e disfunção da célula beta pancreática, e 2) avaliar, no pâncreas endócrino desses animais, a possível ativação da via de sinalização Wnt/beta-catenina, conhecida por estar envolvida no processo de proliferação celular em outros tecidos/órgãos. Para tal, foram empregados camundongos C57BL/6, wild-type (WT) e knockout para receptor de lipoproteína LDL (LDLr-/-), os quais foram submetidos à dieta hiperlipídica (HF) por 60 dias. Após a dieta HF, os animais WT tornaram-se obesos e hipercolesterolêmicos, bem como moderadamente hiperglicêmicos, hiperinsulinêmicos, intolerantes à glicose e resistentes à insulina, caracterizando-os como pré-diabéticos. Além disso, os animais alimentados com dieta HF apresentaram uma diminuição significativa na resposta secretora das células beta à glicose. De modo geral, os animais LDLr-/- apresentaram uma susceptibilidade relativamente mais alta à dieta HF, sugerida pela acentuada hipercolesterolemia, intolerância à glicose, e reduzida secreção de insulina estimulada por glicose observadas nestes animais. No entanto, a dieta HF induziu, de forma semelhante em animais WT e LDLr-/-, uma diminuição significativa no conteúdo celular de Cx36, uma proteína associada à junção comunicante e um marcador de diferenciação terminal da célula beta. Ambos os grupos WT e LDLr-/- alimentados com dieta HF mostraram aumento na proliferação de células beta, como avaliada pela imunomarcação das ilhotas para a proteína Ki67, mas apenas os animais WT exibiram alterações morfométricas indicativas de hiperplasia do pâncreas endócrino, tais como aumento na massa total de ilhotas e de células beta. Uma vez estabelecido que camundongos WT alimentados com dieta HF por 60 dias consistiam em um modelo adequado para a segunda etapa deste estudo, fomos investigar a possível ativação da via Wnt/beta-catenina nas ilhotas pancreáticas desses animais, avaliando-se a distribuição e expressão celular das proteínas beta-catenina total, beta-catenina ativada, c-Myc e ciclina D. A análise por imunofluorescência para beta-catenina não mostrou acúmulo citoplasmático ou translocação para o núcleo desta proteína em ilhotas pancreáticas, que poderia indicar ativação da via Wnt/beta-catenina no nosso modelo de hiperplasia do pâncreas endócrino. No entanto, a análise por Western Blot revelou um aumento significativo na expressão de beta-catenina ativada e ciclina D em ilhotas de animais alimentados com dieta HF em relação ao grupo controle. Concluindo, a dieta HF por 60 dias induz alterações metabólicas típicas da pré-diabetes em animais WT e LDLr-/-. O estado de pré-diabetes está associado a uma diminuição da expressão de Cx36 nas células beta pancreáticas, sugerindo um possível papel da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes na patogênese da T2DM. A maior susceptibilidade metabólica à dieta HF apresentada por camundongos LDLr-/-, em relação aos WT, pode ser explicada pela maior deficiência na secreção de insulina em resposta à glicose e ausência de hiperplasia compensatória do pâncreas endócrino. Ainda, a análise preliminar de expressão protéica de algumas proteínas da via Wnt/beta-catenina sugere que esta via parece estar ativada durante o processo de hiperplasia do pâncreas endócrino observada no nosso modelo animal / Abstract: The pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is often associated with obesity and dyslipidemia (hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia). T2DM involves intolerance to glucose and insulin resistance partially compensated by hyperinsulinemia and pancreatic beta cell hyperplasia. The mechanisms linking obesity/hypercholesterolemia and insulin resistance to beta cell hyperplasia are not fully known. The Wnt/beta-catenin signaling pathway has been reported to be involved in cell growth and differentiation in several tissues/organs but its role in endocrine pancreas development and function is still unclear. This work aimed at: 1) establishing an appropriate animal model of T2DM to study pancreatic beta cell proliferation and dysfunction and, 2) investigating a putative involvement of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in the beta cell hyperplasia in this model. To this end, we employed C57BL/6 wild-type (WT) and LDL lipoprotein receptor knockout (LDLr-/-) mice, fed a high fat (HF) diet for 60 days. After feeding a HF diet, WT mice became obese, hypercholesterolemic and moderately hyperglycemic, hyperinsulinemic, glucose intolerant and insulin resistant, characterizing them as pre-diabetics. Moreover, animals fed a HF diet showed a significant decrease in beta-cell secretory response to glucose. In general, LDLr-/- animals showed a relatively higher susceptibility to HF diet, as suggested by a marked hypercholesterolemia, glucose intolerance and reduced insulin secretion stimulated by glucose observed in these animals as compared to the control ones. However, HF diet induced similarly in both WT and LDLr-/- mice a significant decrease in cellular content of Cx36, a gap junctional protein and marker of terminally differentiated beta cell. Both WT and LDLr-/- fed a HF diet showed increased proliferation of beta cells, as assessed by Ki67 immunostaining, but only WT mice exhibited morphometric changes indicative of endocrine pancreas hyperplasia, such as increased total islet and beta cell masses. After we investigated a possible activation of Wnt/beta-catenin signaling pathway in these hyperplasic pancreatic islets of WT animals fed a HF diet. This was done by assessing the distribution and cellular protein expression of some proteins associated to this pathway (i.e., total and activated beta-catenin, c-Myc and cyclin D) in islets of our animal model. Beta-catenin immunofluorescence showed no cytoplasmic accumulation or translocation into the nucleus of beta cells in HF-fed mice. However, immunoblotting revealed a significant increase of unphosphorylated beta-catenin (activated) and cyclin D expression in islets of HF diet-fed animals when compared to its control group. In conclusion, a HF diet for 60d induced pre-diabetes state in both WT and LDLr-/- mice. The pre-diabetes state is associated with a decreased expression of Cx36 in pancreatic beta cells, suggesting a possible role of intercellular communication mediated by gap junctions in the pathogenesis of T2DM. The relatively high metabolic susceptibility to the HF diet showed by LDLr-/- mice, as compared to WT, may be explained by a marked impairment of glucosestimulated insulin secretion and a lack of compensatory hyperplasia of the endocrine pancreas. In addition, the protein expression analysis suggests that the Wnt/beta-catenin pathway may be activated during the islet hyperplasia process in our animal model / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Rebeca de Souza Azevedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-27T23:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dutra_SabrinaNogueira_D.pdf: 4132202 bytes, checksum: 8d692501f423535818a567ec7a79ed11 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A queilite actínica (QA) é uma desordem potencialmente maligna dos lábios, resultado da exposição crônica e excessiva ao raios ultravioleta, e que pode evoluir para um carcinoma de células escamosas de lábio. A via de sinalização Wnt/?-catenina atua em genes relacionados ao ciclo e a proliferação celular e está envolvida no desenvolvimento e progressão tumoral, e algumas de suas moléculas já foram identificadas em QA. O objetivo deste estudo foi correlacionar as características histopatológicas da QA com dois sistemas de classificação para gradação histopatológica, o da OMS e do sistema binário; e avaliar a participação de marcadores da via de sinalização Wnt/?-catenina por meio de reação imunoistoquímica contra os anticorpos Wnt1, Wnt5a, ?-catenina, axina, APC e ciclina D1 em casos de QA, e relacionar esta expressão com os dois sistemas de classificação. Os resultados mostraram correlação das características histopatológicas com o aumento da displasia epitelial de forma mais evidente pelo sistema binário do que pela classificação da OMS; positividade de Wnt 1, potente ativador da via canônica, em 96,7% dos casos; marcação anormal citoplasmática com ou sem marcação nuclear de ?-catenina em 81,9% dos casos; positividade de ciclina D1 em 75,4 % dos casos; negatividade de Wnt 5a, que possui potencial inibidor da via e pode contribuir indiretamente para ativação da via canônica; positividade de APC e axina em 96,7% e 95% dos casos de QA. Além disso, os anticorpos Wnt1, ciclina D1, APC e axina apresentaram aumento do índice de marcação imunoistoquímica de acordo com o aumento do grau de displasia epitelial de forma progressiva pelo sistema binário. Pode-se, assim, sugerir uma possível relação destas proteínas da via de sinalização Wnt/?-catenina com o desenvolvimento e a progressão da QA e que o uso do sistema binário de classificação de gradação histopatológica em QA apresentou melhor correlação com as características histopatológicas e com os índices de marcação imunoistoquímica da via de sinalização Wnt/?-catenina do que o sistema de classificação da OMS / Abstract: Actinic cheilitis (AC) is a potentially malignant disorder of the lips, resulting from chronic and excessive exposure to ultraviolet radiation, which can develop into a lip squamous cell carcinoma. Wnt/?-catenin signaling pathway acts on genes related to cell cycle and proliferation and is involved in tumor development and progression, and some of its molecules have already been identified in AC. Thus, the aim of this study was to correlate the histopathological features of AC with two grading histopathological systems, the WHO and the binary system; and to evaluate Wnt/?-catenin signaling pathway involvement by means of immunohistochemistry reaction against Wnt1, Wnt5a, ?-catenin, axin, APC and cyclin D1 in AC, and to relate this expression with the two histopathological grading systems. The results showed a correlation between the histopathologic features with the increased epithelial dysplasia mainly by using the binary system than using the WHO classification; Wnt 1 positivity, a potent canonical pathway activator, in 96.7% of the cases; abnormal ?-catenin cytoplasmic staining with or without nuclear staining in 81.9% of cases; cyclin D1 positivity in 75.4% of cases; Wnt 5a negativity, which has a potential for an inhibiting the pathway and may indirectly contribute to the activation of canonical pathway; APC and axin positivity in 96.7% and 95% of AC. In addition, Wnt1, cyclin D1, APC and axin showed a progressive increased immunohistochemical staining index according to the increasing degree of epithelial dysplasia by the use of the binary system. Therefore, we were able to suggest a possible relationship of these Wnt/?-catenin signaling pathway proteins with the AC development and progression and that the use of binary grading system in the histopathological classification of AC showed a better correlation with the histopathological features and the immunohistochemical staining indexes of Wnt/?-catenin signaling pathway than the use of WHO grading system / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia

Au cours de gastrulation chez la Drosophile, deux vagues successives de constriction ont lieux au niveau des cellules ventrales menant à l'invagination du mésoderme. La première vague de constriction est stochastique et entraine la constriction de 40% des cellules mesodermales réparties aléatoirement et est contrôlée par le facteur de transcription Snail. La seconde vague de constriction arrive immédiatement après et implique également la constriction des 60% manquant de cellules mésodermales. Cette seconde vague est contrôlée par le facteur de transcription Twist et requière la présence de la protéine sécrétée Fog. L'invagination complète du mésoderme riquière la redistribution de la protéine moteur Myosine II au niveau de l'apex des cellules en cours de constriction. Il a été montré que la mutation de Snail mène à une perte des deux phases de constriction, mais qu'une indentation sur les cellules du mésoderme permet de rétablir la seconde phase de constriction Twist dépendante. Nous avons cherché à étudier les interaction entre les deux phases de constriction, la protéine sécrétée Fog et le moteur moléculaire Myosine II à l'aide d'une simulation numérique. Nous avons également chercher à étudier la corélation entre l'invagination globale du mésoderme et la phosphorylation de la Bêta-Cathenine qui est impliquée dans l'activation de Twist. Nous avons étudier l'invagination de l'endoderme postérieur qui présente de nombreuses similitude avec l'invagination de l'endoderme et leurs interactions. Enfin également à l'aide d'une simulation numérique, nous avons testé l'hypothèse de l'apparition d'une invagination dans un organisme primitif mécano-sensible ( la gastræ d'HAECKEL ) au contact avec le plancher océanique. / During Drosophila gastrulation, two waves of constriction occur in the apical ventral cells, leading to mesoderm invagination. The first constriction wave is a stochastic process mediated by the constriction of 40% of randomly positioned mesodermal cells and is controlled by the transcription factor Snail.The second constriction wave immediately follows and involves the other 60% of the mesodermal cells. The second wave is controlled by the transcription factor Twist and requires the secreted protein Fog. It is known that Snail mutation lead to the loss of the two constriction phases but a mechanical poking on the mesoderm cells can rescue de second phase of Twist dependent constriction. The interactions between the two constriction phases, la secreted protein Fog and the molecular motor Myosin II with a numerical simulation. The posterior endoderm invagination that presents similarities with mesoderm invagination have been study, as well as the interaction between them. Finally with an other numerical simulation, the hypothesis of an induced invagination on a primitive mechanosensible organism ( the HAECKEL grastrae ) on the contact with the oceanic floor has been tested.

No / The Rho family GTPases Cdc42 and Rac1 are critical regulators of the actin cytoskeleton and are essential for skin and hair function. Wiskott-Aldrich syndrome family proteins act downstream of these GTPases, controlling actin assembly and cytoskeletal reorganization, but their role in epithelial cells has not been characterized in vivo. Here, we used a conditional knockout approach to assess the role of neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP), the ubiquitously expressed Wiskott-Aldrich syndrome-like (WASL) protein, in mouse skin. We found that N-WASP deficiency in mouse skin led to severe alopecia, epidermal hyperproliferation, and ulceration, without obvious effects on epidermal differentiation and wound healing. Further analysis revealed that the observed alopecia was likely the result of a progressive and ultimately nearly complete block in hair follicle (HF) cycling by 5 months of age. N-WASP deficiency also led to abnormal proliferation of skin progenitor cells, resulting in their depletion over time. Furthermore, N-WASP deficiency in vitro and in vivo correlated with decreased GSK-3beta phosphorylation, decreased nuclear localization of beta-catenin in follicular keratinocytes, and decreased Wnt-dependent transcription. Our results indicate a critical role for N-WASP in skin function and HF cycling and identify a link between N-WASP and Wnt signaling. We therefore propose that N-WASP acts as a positive regulator of beta-catenin-dependent transcription, modulating differentiation of HF progenitor cells.

Kolorektale Karzinome (CRC) zeigen eine heterogene Ätiologie. Die Progression prämaligner Vorläufer zu CRC unterscheidet (U) sich in Morphologie, molekularen Veränderungen und Interaktion mit der Tumorumgebung. CRC weisen oft onkogene Mutationen in KRAS und BRAF auf. Diese steigern die MAPK Signalwegaktivität (Mpa). Obwohl sie im selben Signalweg wirken, sind KRAS und BRAF auf die CRC-Entitäten U verteilt. Dabei ist KRAS häufiger im sogenannten konventionellen und BRAF im serratierten Weg zu CRC mutiert. In dieser Studie nutzte ich murine intestinale Organoide (iO), die induzierbare (Ind) KRAS oder BRAF Onkogene exprimieren. Große U zwischen KRAS und BRAF zeigten sich sowohl in Signaltransduktion (ST) als auch im Phänotyp. Phosphoprotein-, ERK-Reporter-, scRNA-Seq und EM-Analysen ergaben eine starke Mpa durch BRAF, die zu hoher Expression von MAPK-Zielgenen und Verlust der epithelialen Integrität führte. iO nach KRAS-Ind blieben intakt, korrelierend mit moderater, zelltypspezifischer (ZS) Mpa in sekretorischen und undifferenzierten Zellen. Die meisten Enterozyten waren Mpa-negativ. ERK-Reporter zeigten: Das ZS Muster der Mpa ist nicht nur gegenüber KRAS, sondern auch dem Entzug von Wachstumsfaktoren stabil. Dies spricht für eine intrinsische, robuste Regulierung der Mpa. BRAF-Ind Mpa setzte die ZS Regulierung der MAPK außer Kraft und schädigte das Gewebe, im Einklang mit einer oberen Grenze tolerabler Mpa. Die ZS Mpa wurde in CRC-Zelllinien bestätigt, deren Mpa durch KRAS aber nicht BRAF U ausfiel. Ferner, nutzte ich iO mit bCatenin+KRAS-Ind, um den konventionellen Weg zu CRC zu modellieren. Die Kombination führte zu synergistischen Effekten, die sich in EGFR-unabhängigem Wachstum und der Aufhebung der ZS Mpa-Blockade äußerten, die durch eine Verschiebung der Differenzierung zu mehr Progenitorzellen bewirkt wurde. Zusammenfassend konnte ich U in der Mpa durch KRAS oder BRAF im Darmepithel feststellen, was dazu beiträgt, deren Rollen in der CRC-Genese zu bestimmen. / Colorectal cancer (CRC) is a disease with heterogeneous etiology. Premalignant lesions follow distinct routes of progression to carcinoma reflected by differences in morphology, molecular alterations and the tumor environment. Mutant KRAS and BRAF are frequent, leading to MAPK pathway activation (Mpa), which is relevant for CRC therapy. Despite acting in the same pathway, mutant KRAS and BRAF segregate to different entities, as KRAS is more frequent in the conventional- and BRAF being specific for the serrated route to CRC. I used murine intestinal organoids (iO) expressing inducible oncogenic KRAS or BRAF to study the impact of oncogenes in primary cells. I found marked differences in signal transduction and phenotype. Phospho-protein, ERK-reporter, scRNA-seq and EM data showed strong Mpa upon BRAF induction followed by ERK-target gene expression leading to tissue disruption. In contrast, KRAS left the tissue intact resulting in less and cell type-dependent Mpa limited to secretory cells, a subset of late-stage enterocytes and undifferentiated crypt cells. Most enterocytes were irresponsive to KRAS. The pattern of Mpa was robust towards KRAS or growth factor depletion arguing in favor of intrinsic, resilient MAPK regulation. In iO, BRAF-induced Mpa could break this cell type-specific regulation, indicating an upper limit of tolerable Mpa. I validated these findings in CRC cell lines that differed in Mpa in response to oncogenic KRAS but not BRAF. Finally, I used iO expressing an inducible form of stabilized bCatenin in combination with KRAS to mimic events frequently found in the conventional pathway to CRC. Expression of KRAS and bCatenin synergized in driving EGFR independent growth and breaking the villus-specific block of Mpa by altering differentiation towards progenitor cell types. In summary, this study emphasizes differences between Mpa induced by oncogenic KRAS or BRAF which helps clarifying their nature in different etiological routes to CRC genesis.

AB T mu hom dise β sign mu liga stab tran sign T the focu disc cate of t cell targ the inte con sec I sign BSTRACT The Wnt si lticellular o meostasis. A eases, most β-catenin is nalling). In ltiprotein c ands when t bilized and nscription f nalling is tig This thesis knowledge uses on seq cusses the enin signall the Wnt pa ls of intest geted mous thesis des eraction wit nditional Hi retory cell t In conclusi nalling path T ignalling pa organisms Accordingly notably can s a central m n unstimula complex and they engage d transloca factors and ghtly regula is based on e of the reg quential po positive ro ling outcom athway whic tinal epithe e strains th scribes unp th members ic1 deletion types and en ion, our fin hway in dev athway is o ensuring s y, mutations ncer. mediator of ated cells d degraded e their recep tes to the to drive th ated at vario n four origin gulation of sttranslation ole of nucle me. The third ch reduces lium. Final at enable st ublished da s of the Wn n in the inte nhanced tum ndings contr velopment an one of the m successful s in the pat f canonical W β-catenin d in the pro ptors, degrad nucleus t he transcrip ous levels b nal articles f the Wnt s nal process ear protein d study repo the levels o lly, the las tudying the ata on the nt pathway, estinal epith mourigenesi ributed to t...

INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro

Introdução: A incidência de tumores adrenocorticais em crianças é particularmente elevada nas regiões sudeste e sul do Brasil, correlacionandose com a ocorrência da mutação germinativa p.R337H do supressor tumoral p53, entretanto, o carcinoma adrenocortical é uma neoplasia endócrina maligna rara em todo o mundo com uma incidência aproximada de 0,5 - 2 casos por milhão por ano. Esta condição é uma doença heterogênea, apresentando frequentemente comportamento clínico agressivo e letal. A cascata de sinalização Wnt é uma via importante de transdução de sinal em cânceres humanos e tem sido implicada na tumorigênese adrenocortical. A atividade desta via de sinalização é dependente da quantidade de beta-catenina citoplasmática e nuclear. Mutações ativadoras no gene da beta-catenina (CTNNB1) foram relatadas em diversas neoplasias humanas. Estudos demonstraram que mutações no gene CTNNB1 são os defeitos genéticos mais frequentemente encontrados em adenomas e em carcinomas adrenocorticais. O estudo destas mutações demonstrou que as alterações no gene CTNNB1 localizam-se principalmente exon 3, que codifica a porção amino terminal da beta- catenina. Objetivos: determinar a ocorrência e a frequência das mutações somáticas no exon 3 do gene CTNNB1. Adicionalmente, determinar a imunorreatividade de beta-catenina e de p53 em tumores adrenocorticais benignos e malignos de crianças e adultos. Correlacionar os resultados da análise de mutações gênicas e os dados de imunorreatividade com as características hormonais, a mutação p.R337H do p53, o diagnóstico histológico e a evolução dos tumores adrenocorticais de crianças e adultos. Métodos: Neste estudo, a análise de imunohistoquímica para beta-catenina e p53 foi realizada em 103 tumores adrenocorticais benignos e malignos (40 crianças e 63 adultos), estando as amostras histológicas alocadas em micromatriz tecidual (TMA). A pesquisa de mutações no exon 3 do gene CTNNB1 foi determinada por seqüenciamento automático em 64 tumores adrenocorticais. Resultados: a imunorreatividade para beta-catenina em citoplasma e/ou núcleo foi evidenciada de maneira similar nos tumores adrenocorticais benignos e malignos de crianças e de adultos (15% e 23,8%, respectivamente). O percentual das células neoplásicas imunorreativas para beta-catenina em citoplasma e/ou núcleo não foi significativamente diferente entre os tumores clinicamente benignos e malignos pediátricos (15,6% vs. 12,5%, respectivamente; p=0,93) e entre adenomas e carcinomas adrenocorticais de adultos (28,5% vs. 17,8%, respectivamente; p=0,38). A síndrome endócrina causada pelo perfil de secreção hormonal foi similar entre os tumores adrenocorticais com presença ou ausência de acúmulo citoplasmático e/ou nuclear de beta-catenina em crianças e adultos. A associação entre acúmulo anormal de beta-catenina e diminuição de sobrevida foi avaliada nos pacientes adultos portadores de carcinomas adrenocorticais isoladamente (n=25), sendo observada na curva de Kaplan- Meier uma tendência de significância (log-rank p=0,07). A análise do gene CTNNB1 revelou mutações somáticas em heterozigose em 10 tumores adrenocorticais (4 crianças e 6 adultos). As mutações encontradas no gene CTNNB1 foram, sobretudo do tipo missense (p.Ser45Pro, p.Ser45Phe, p.Asp32Asn, p.Pro44Ala_Ser45Pro; p.His36Gln_Ser37Lys). Outras mutações encontradas compreenderam: a inserção de um único nucleotídeo (p.E9GfsX14), dando origem a uma desvio de leitura do exon 3; além da deleção dos três nucleotídeos do códon 45 (p.Ser45del). Todos os tumores com mutações somáticas no gene CTNNB1 mostraram acúmulo anormal para ?-catenina, com exceção de um caso. A presença de alterações no gene CTNNB1 não se associou ao tamanho do tumor (Teste de Mann-Whitney: p=0,75), desfecho desfavorável tanto no grupo pediátrico (log-rank p=0,29) como no grupo de pacientes adultos (log-rank p=0,77). Todos os pacientes portadores da mutação germinativa do gene TP53 apresentaram imunorreatividade nuclear de p53 nas células tumorais. Não foi encontrada correlação entre a presença de acúmulo anormal de beta-catenina e imunorreatividade nuclear de p53, considerando os grupos de crianças e de adultos portadores de tumores adrenocorticais. Adicionalmente, não foi observada correlação entre mutações no gene CTNNB1, bem como acúmulo anormal de beta-catenina, com a imunorreatividade nuclear de p53 no grupo de tumores adrenocorticais de pacientes adultos, porém, interessantemente, avaliando isoladamente o grupo de tumores adrenocorticais pediátricos, foi observada relação entre a presença de mutações no gene CTNNB1 e a presença de acúmulo nuclear de p53 (X2: p=0,009). Conclusões: Estes dados confirmam a participação da via Wnt na tumorigênese adrenocortical de crianças e de adultos, que apresenta uma prevalência de ativação semelhante entre crianças e adultos. O acúmulo citoplasmático e/ou nuclear de beta-catenina provavelmente é um marcador biológico de mau prognóstico do carcinoma de adrenocortical de adultos. Adicionalmente, observamos evidências de uma correlação positiva entre mutações no gene CTNNB1 e acúmulo nuclear de p53 em tumores adrenocorticais pediátricos, confirmando uma possível relação destas duas vias na tumorigênese do córtex da glândula suprarrenal / Introduction: The incidence of adrenocortical tumors in children is particularly high in the southeastern and southern regions of Brazil, correlating with the occurrence of p.R337H p53 tumor suppressor germline mutation. However, adrenocortical carcinoma is a worldwide rare endocrine malignancy with an approximate incidence of 0.5 to 2 cases per million per year. This condition is a heterogeneous disease and is often lethal. The Wnt signaling pathway is an important signal transduction pathway in human cancers and has been implicated in adrenocortical tumorigenesis. The activity of this signaling pathway is dependent on the amount of nuclear and cytoplasmic beta-catenin. Activating mutations of ?-catenin (CTNNB1) gene have been reported in several human malignancies. Studies have shown that CTNNB1 mutations are the most common genetic defect found in adrenocortical adenomas and carcinomas. The study of these mutations demonstrated that the changes in CTNNB1 gene are mainly located in exon 3, which encodes the amino terminal portion of the beta- catenin. Objectives: to determine the occurrence and frequency of CTNNB1 somatic mutations and the abnormal beta-catenin and p53 accumulation in benign and malignant adrenocortical tumors in both children and adults. We also evaluated the correlation of the gene mutations analysis and immunohistochemistry data with the hormonal characteristics, the p.R337H germline mutation, the histological diagnosis and the prognosis of adrenocortical tumors in children and adults. Methods: In this study, immunohistochemistry for beta-catenin and p53 was performed in 103 benign and malignant (40 children and 63 adults) adrenocortical tumors. The histological samples were allocated in a tissue microarray (TMA). The study of the CTNNB1 gene was performed by direct sequencing of 64 adrenocortical tumors. Results: The beta-catenin abnormal accumulation was similar in benign and malignant adrenocortical tumors of children and adults (15 % and 23.8 %, respectively). The percentage of cells with beta-catenin abnormal accumulation was not significantly different between benign and malignant pediatric adrenocortical tumors (15.6% vs. 12.5 %, respectively; P=0.93) and between adrenocortical adenomas and carcinomas in adults (28.5% vs 17.8 %, respectively; p=0.38). The endocrine syndrome caused by hormonal tumor secretion was similar in patients with and without beta-catenin abnormal accumulation both in pediatric and adult patients. The association between beta-catenin abnormal accumulation and decreased survival was evaluated in adult patients with adrenocortical carcinomas (n=25) and a trend toward significance was observed (log-rank p=0,07). The analysis of the CTNNB1 gene revealed heterozygous somatic mutations in 10 adrenocortical tumors (6 adults and 4 children). The mutations found in CTNNB1 gene were mainly missense (p.Ser45Pro, p.Ser45Phe, p.Asp32Asn, p.Pro44Ala_Ser45Pro; p.His36Gln_Ser37Lys). Other mutations found included: a single nucleotide insertion (p.E9GfsX14) and a deletion within codon 45 of exon 3 of CTNNB1 gene, (p.Ser45del). All tumors with somatic mutations in the CTNNB1 gene showed abnormal beta -catenin accumulation, except for one case. The mutations in CTNNB1 gene was not associated with tumor size (Mann - Whitney: p=0.75), unfavorable outcome in both pediatric (log -rank p=0.29) and adult group of patients (log-rank p=0.77). All patients with TP53 germline mutation showed p53 nuclear accumulation in the tumor cells. No correlation was found between the presence of beta-catenin abnormal accumulation and p53 nuclear accumulation in adrenocortical tumor cells of children and adults. In addition, no correlation was observed between CTNNB1 mutations, as well as beta-catenin abnormal accumulation, with p53 nuclear accumulation in adults adrenocortical tumors. Interestingly, the evaluation of pediatric adrenocortical tumors revealed a relationship between the occurrence of CTNNB1 mutations and the presence of p53 nuclear accumulation (X2: p=0.009). Conclusions: These data confirm the involvement of the Wnt pathway in adrenocortical tumorigenesis of children and adults, which has a prevalence similar activation between children and adults. We observed that abnormal beta-catenin accumulation in adults adrenocortical carcinoma is probably associated with a dismal prognosis. Additionally, we found evidence of a positive relationship between CTNNB1 mutations and p53 nuclear accumulation in pediatric adrenocortical tumors, confirming a possible connection of these two pathways in the pediatric adrenocortical tumorigenesis

Nos mamíferos, a determinação sexual é governada pelo equilíbrio entre duas vias de sinalização paralelas e antagônicas: a via masculina SOX9/FGF9 e a via feminina RSPO1/beta-catenina/WNT4. A R-spondina 1 é uma importante reguladora do processo de diferenciação ovariana e atua modulando a via de sinalização Wnt canônica (Wnt/beta-catenina). Em humanos, mutações em RSPO1 causam uma rara síndrome genética autossômica recessiva caracterizada por Distúrbios do Desenvolvimento Sexual (DDS) 46,XX Testicular ou Ovotesticular, hiperceratose palmoplantar (HPP) e predisposição para o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas (MIM 610644). Identificamos um paciente brasileiro, proveniente de uma grande família consanguínea, que apresentava a associação de HPP e DDS 46,XX Testicular SRY negativo. A avaliação da região codificadora do gene RSPO1 identificou a nova variante alélica c.305G>A (p.Cys102Tyr). O estudo de segregação realizado em 67 familiares demonstrou que a variante c.305G>A segrega em perfeita concordância com o fenótipo de HPP, exibindo um padrão de herança autossômico recessivo. Na família foram identificados 10 indivíduos afetados pelo fenótipo de HPP. As avaliações clínica e hormonal e os estudos molecular e citogenético nesses indivíduos resultou na caracterização de: (a) quatro indivíduos do sexo masculino 46,XX e/ou SRY negativo, com ambiguidade genital e perfil hormonal alterado; (b) cinco indivíduos do sexo masculino 46,XY e/ou SRY positivo, sem ambiguidade genital, com perfil hormonal normal e (c) uma mulher 46,XX, fértil. Experimentos de transfecção transitória in vitro demostraram que a proteína mutante tem menor capacidade de transativação do plasmídio reporter da via Wnt. As simulações de dinâmica molecular constataram que a troca p.Cys102Tyr aumenta a flexibilidade do backbone da R-spondina-1, diminuindo a energia de ligação da proteína ao complexo de receptores, LGR5 e RNF43. Em conjunto, nossos achados demonstram que a variante c.305G > A é patogênica, sendo responsável pela síndrome genética diagnosticada na família brasileira. As análises de expressão gênica e os estudos de imuno-histoquímica, por sua vez, detectaram um aumento da expressão do gene SOX9 e maior imonorreatividade para a proteína Sox9 no tecido testicular do caso índice. Esses resultados sugerem que o processo de reversão sexual nos indivíduos XX ocorra por uma hiperexpressão de SOX9 secundária à menor ativação da via Wnt/beta-catenina na gônada durante a embriogênese. No presente estudo também relatamos o primeiro caso de indivíduo de cariótipo 46,XX portador de mutação em homozigose no gene RSPO1 que não desenvolveu DDS. A variabilidade do fenótipo sexual não está associada com alterações no número de cópias dos genes WNT4 ou do SOX9 e região cis-regulatória. No entanto, a avaliação do exoma da família encontrou uma associação entre o polimorfismo do receptor LGR5 rs17109924 e a atenuação do fenótipo de DDS. Todavia, serão necessários estudos funcionais para esclarecer o impacto biológico da interação das variantes RSPO1 p.Cys102Tyr e LGR5 rs171099 / In mammals, sex determination is governed by the balance between two parallel and antagonic signaling pathways: the male SOX9/FGF9 and the female, RSPO1/beta-catenin/WNT4 pathways. R-spondin 1 regulates the ovarian differentiation process by its modulating action through the canonic Wnt pathway (Wnt/beta-catenin). In humans, patogenic mutations in RSPO1 cause a rare, autosomic recessive syndrome characterized by 46,XX Testicular or Ovotesticular disorders of sexual development (DSD), palmoplantar keratosis (PPK) and predisposition to squamous cell carcinoma (MIM 610644). We identified and studied a SRY-negative 46,XX DSD patient with PPK from a large, consaguineous, brazillian family. Through a \"candidate gene\" approach we identified in the proband a new allelic variant in the coding region of RSPO1, c.305G > A. This variant presented full concordance with the PPK phenotype by segregation analyses in 10 of 67 members of this family. Clinical, hormonal, cytogenetic and molecular genetic studies characterized three patterns in individuals with this variant: (a) four 46,XX and/or SRY-negative males with ambiguous genitalia and altered hormonal profile; (b) five 46,XY and/or SRY-positive males without ambiguous genitalia with normal hormonal profile; (c) one 46,XX fertile woman. In vitro experiments demonstrated that transient transfection of the mutant protein resulted in lower transactivation of the Wnt pathway-reporter plasmid. Moreover, molecular dinamic studies showed that p.Cys102Tyr increased the R-spondin-1 backbone flexibility, thus decreasing the interaction between this protein and its receptors, LGR5 and RNF43. Thus, both in vitro and in silico analysis demonstrate the pathogenicity of the RSPO1 variant c.305G > A. In addition, in the index case, a higher expression of SOX9, corroborated by a reactive immunohistochemistry in testicular tissue, suggested that the process of sexual reversal in the XX individual is driven by a higher SOX9 expression possibly due to a lower Wnt/beta-catenin signaling pathway activation during embriogenesis. In this study, we also reported the first 46,XX individual with RSPO1 mutation without DSD, in which no copy number abnormality was detected in WNT4, SOX9 and its cisregulatory regions. Whole exome sequencing of the affected individuals revealed, in turn, that the LGR5 rs17109924 polymorphism associates with a protacted DSD phenotype in the fertile woman with normal hormonal profile. Despite this evidence, future studies are nedded to address causality and biological impact between RSPO1 p.Cys102Tyr and LGR5 rs17109924 variants

INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro