O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-05-10T20:18:37Z No. of bitstreams: 1 AdrianaLeal.pdf: 1605345 bytes, checksum: 700a558a6725b2db9159b45c403c2cbb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T20:18:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaLeal.pdf: 1605345 bytes, checksum: 700a558a6725b2db9159b45c403c2cbb (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Objectives: To evaluate the effect of airborne-particle abrasion with niobium phosphate bioglass (NbG) microparticles on the bond strength (µTBS) and longevity of an adhesive system to different dentin substrates. Methods and Materials: Caries-free molars were used in this study. The dentin surfaces were evaluated in three groups: (1) Control – Healthy Dentin; (2) Partial removal of carious tissue; (3) complete removal of carious tissue. Half the teeth in each group were submitted to airborne-particle abrasion with NbG microparticles (15s/1cm/5bar). After this, the adhesive Clearfil S3 was applied and composite buildups were constructed incrementally; and specimens were longitudinally sectioned to obtain bonded sticks (1.0 mm2) to be tested in tension (0.5 mm/min) immediately or after 6 months of storage in water. The fracture patterns were evaluated by stereomicroscope (40x) and then by scanning electron microscopy (SEM). The data were analyzed by the Kruskal-Wallis (post-hoc Dunn) and Mann-Whitney tests (α=0.05). Results: Healthy dentin showed the highest bond strength (µTBS). Airborne-particle abrasion with NbG increased the µTBS values in the complete caries removal group. The bond strength values in the 24-hr period were higher than those at 6 months. In the majority of the specimens the fracture mode was adhesive/ mixed. Conclusion: The authors concluded that airborne-particle abrasion on dentin with NbG particles increased the µTBS in the group in which carious dentin was completely removed. / Objetivo: Avaliar o efeito do jateamento de micropartículas de vidro niobofosfato (NbG) na resistência de união (RU) e na longevidade de um sistema adesivo em diferentes substratos dentinários. Dezoito molares extraídos livres de cárie foram usados. As superfícies de dentina foram avaliadas em três grupos: (1) Controle – Dentina Sadia; (2) Remoção parcial do tecido cariado; (3) Remoção total do tecido cariado. Metade dos dentes de cada grupo sofreu um jateamento com partículas de NbG (15s/1cm/5bar). Em seguida o adesivo Clearfil S3 Bond Plus foi aplicado e uma coroa de resina composta foi construída. Os dentes foram seccionados para obtenção dos espécimes (1,0 mm2) e submetidos ao teste de microtração (0,5 mm/min) imediatamente e após 6 meses de estocagem em água. Os padrões de fratura foram avaliados usando estereomicroscópio (40x) e levados ao microscópio eletrônico de varredura (SEM). Os dados foram analisados pelos testes Kruskal-Wallis (pos-hoc Dunn) e Mann-Whitney (α=0.05). Resultados: A dentina sadia apresentou os maiores valores de RU. O jateamento com NbG aumentou os valores de RU no grupo remoção total. Os valores de RU no período de 24h foram superiores ao de 6 meses. A maioria das fraturas dos espécimes foi adesiva/mista. Conclusão: Os autores concluíram que o jateamento à dentina com partículas NbG aumentou a RU no grupo onde a dentina cariada foi totalmente removida.

Foram desenvolvidos e manufaturados compósitos porosos com estrutura de gradiente funcional em Poli (metacrilato de metila) (PMMA) e Hidroxiapatita (HAp) aplicáveis como implantes ósseos. O PMMA é largamente utilizável e aceito como material de implante tem boas propriedades mecânicas, baixo custo, fácil manufatura, porém é considerado bioinerte. A HAp é uma cerâmica comprovadamente bioativa, porém de baixas propriedades mecânicas, alto custo e de difícil manufatura. O PMMA com estrutura funcional e HAp apresentou valores próximos a 50 MPa, mas com potencial de melhoria. O objetivo deste desenvolvimento é produzir um implante com a sua superfície porosa e bioativa, para que este possa ser osteointegrado em um tempo menor ao tecido hospedeiro, melhorando a relação: material implantado/leito receptor. O conceito é baseado em uma estrutura de núcleo denso em PMMA e camada superficial porosa com superfície bioativa. A camada de PMMA porosa foi desenvolvida utilizando-se o carboximetilcelulose (CMC) como agente porogênico e HAp como agente bioativador da matriz polimérica. Foram elaboradas análises de bicompatibilidade, resistência mecânica, macro e microestrutura. Para testar a biocompatibilidade foram realizados inicialmente testes in vitro com cultura de células VERO, visando investigar a toxicidade dos materiais constituintes, a influência do novo biomaterial em atividades celulares e o comportamento destes em condições próximas daquelas a serem encontradas no ambiente de implantação. Em seguida, os testes in vivo realizados em coelhos averiguaram a interação tecido-material (bioatividade), a biocompatibilidade do material, e a potencialidade do uso do material em aplicação à superfícies (osteointegração). Foi realizada análise histológica dos tecidos explantados, onde os resultados basearam-se na análise da morfologia geral dos componentes teciduais encontrados junto ao implante. A caracterização da superfície foi realizada por testes de rugosidade, por microscopia ótica e eletrônica de varredura. Foram realizados ensaios mecânicos de compressão para analisar a resistência mecânica do biomaterial. Os resultados in vitro mostraram que os materiais utilizados não apresentaram qualquer indício de toxicidade. Através das imagens realizadas em MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura) pode se observar o crescimento de células VERO na superfície do material e em direção aos poros da matriz. A análise macroestrutural dos poros também obtida por MEV demonstrou em uma caracterização inicial do material que este apresentou características biomiméticas como poros em formato oblongo e interconectados. A média obtida do tamanho dos poros foi de aproximadamente 250 \'mü\'m. Os resultados dos ensaios mecânicos de compressão mostraram que o PMMA denso é o que mais se aproximou do tecido ósseo cortical com 101 MPa. Por fim, os resultados histológicos apontam para a biocompatibilidade do compósito, tornando-o assim aplicável como camada superficial de implantes. / Were developed and manufactured porous composite with functional gradient structure in Polymethylmethacrylate (PMMA) and hydroxyapatite (HAp) applicable as bone implants. PMMA is widely used and accepted as implant material, has good mechanical properties, low cost, easy manufacturing and considered a bioinert biomaterial, the Hap is a demonstrably bioactive ceramic with poor mechanical properties, high cost and difficult to manufacture. The PMMA functional structure and HAp had values close to 50 MPa, but with potential for improvement. The objective of this development was produced an implant with a porous surface and bioactive to be osteointegrated in a less time, improving the relationship: implanted material/receiver bed. The concept is based on a dense structure core of PMMA and a porous bioactive surface layer. The porous PMMA was developed using the carboxymethylcellulose (CMC) as a porogenic agent and hap to bioactive the PMMA matrix. Biocompatibility tests, mechanical strength tests and macro and microstructure analisys were carried out. To evaluated the biocompatibility of this material were made primarily in vitro tests, the VERO cells were used in vitro analysis aimed investigate the toxicity of the constituent materials, the influence of the new biomaterial in cellular activities and behavior in these conditions close to those to be found in the environment of deployment. Then, in vivo tests conducted in rabbits evaluated the interaction with tissue-material (bioactivity), the biocompatibility of the material, and the potential use of the material in the application areas (osseointegration). Were performed histological analysis of tissues, where the results were based on the analysis of the general morphology of the tissue components found near the implant. The surface characterization was performed by roughness tests, optical microscopy and SEM. Mechanical tests were conducted to examine the compressive strength of biomaterial. Results in vitro showed that the materials did not present any evidence of toxicity. The samples were analyzed by SEM where the growth of cells can be observed in the surface of the material and towards to the pores. The macrostructural analysis also obtained by SEM showed in an initial characterization of the material that presented bone biomimetics characteristics with oblong pores with interconnected. The average pore size obtained was approximately 250 \'mü\'m. The results of mechanical tests showed that the compression of PMMA is the densest approached the cortical bone tissue near 101 MPa. Finally, the histological results point to the biocompatibility of the composite, thus making it applicable to the surface layers of implants.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-09-14T14:47:04Z No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:55:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:56:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T13:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Millions of bone fractures occur annually worldwide and the consequent bone repair process is complex, involving many biological events until it reaches the restoration of the tissue integrity. During that process some problems can occur due to delays in the bone healing, which does not allow the proper joining of the tissue. Thus, it is necessary to search for new technologies that work in restoring the integrity of the bone tissue and that promote the osteoconduction and the osteoinduction. In this sense, the use of bioactive materials in the bone repair process is a promising alternative. Following this, two studies (I and II) were developed in order to investigate a new fibrous glassy scaffold, and these studies were based in three lines of research: (i) the characterization of the new fibrous glassy scaffold; (ii) the biocompatibility evaluation of this bioactive material; (iii) the analysis of the biological performance of this new scaffold in the bone repair. More specifically, in the study I the developed scaffolds were characterized in terms of porosity, mineralization and morphological features. Additionally, fibroblast and osteoblast cells were seeded in contact with extracts of the scaffolds to assess cell proliferation and genotoxicity after 24, 72 and 144 h. Finally, scaffolds were placed subcutaneously in rats for 15, 30 and 60 days. In regards to study II, the morphological structure of the scaffolds upon incubation in phosphate buffered saline (PBS) (via scanning electron microscope) was assessed after 1, 7 and 14 days and, also, the in vivo tissue response to the new biomaterial was evaluated using implantation in rat tibial defects. The histopathological, immunohistochemistry and biomechanical analyzes after 15, 30 and 60 days of implantation were performed to investigate the effects of the material on bone repair. The scaffolds presented interconnected porous structures (porosity of ~75%), and the precursor bioglass could mineralize a hydroxycarbonate apatite (HCA) layer in SBF after only 12 h. The PBS incubation indicated that the fibers of the glassy scaffold degraded over time. With regards to the biological investigations, the biomaterial elicited increased fibroblast and osteoblast cell proliferation, and no DNA damage was observed. The in vivo experiment showed degradation of the biomaterial over time, with soft tissue ingrowth into the degraded area and the presence of multi-nucleated giant cells around the implant. At day 60, the scaffolds were almost completely degraded, and an organized granulation tissue filled the area. Additionally, the histological analysis of the implants in the bone defects revealed a progressive degradation of the material with increasing implantation time and also its substitution by granulation tissue and woven bone. Histomorphometry showed a higher amount of newly formed bone area in the control group (CG) compared to the biomaterial group (BG) 15 days post-surgery. After 30 and 60 days, CG and BG showed a similar amount of newly formed bone. The novel biomaterial enhanced the expression of RUNX-2 and RANK-L, and also improved the mechanical properties of the tibial callus at day 15 after surgery. These results indicate that the new fibrous glassy scaffold is bioactive, non-cytotoxic, biocompatible and promising for using in bone tissue engineering. / Milhões de fraturas ósseas ocorrem anualmente no mundo todo e o processo de reparo é complexo, envolvendo muitos eventos biológicos até que se atinja a restauração da integridade do tecido. Problemas nessa regeneração podem ocorrer, levando a não união óssea. Assim, faz-se necessária a busca por novas tecnologias que atuem na restauração da integridade do tecido ósseo e promovam a osteocondução e a osteoindução. Para tanto, uma alternativa promissora é a utilização de materiais bioativos para o reparo ósseo. Seguindo essa linha, foram realizados dois estudos (I e II) acerca de um novo scaffold vítreo fibroso, sendo estes estudos baseados em três linhas de investigação: (i) caracterização do novo scaffold vítreo fibroso; (ii) avaliação da biocompatibilidade desse material bioativo e (iii) análise do desempenho biológico desse novo scaffold no reparo ósseo. Mais especificamente, no estudo I foi feita a caracterização dos scaffolds em termos de porosidade, mineralização e características morfológicas. Adicionalmente, fibroblastos e osteoblastos foram cultivados em contato com extratos dos scaffolds para avaliação da proliferação celular e genotoxicidade após 24, 72 e 144 h. Finalmente, nesse mesmo estudo, os scaffolds foram implantados subcutaneamente em ratos por 15, 30 e 60 dias. No que se refere ao estudo II, foram feitas avaliações da estrutura morfológica dos scaffolds (via microscopia eletrônica de varredura) imersos em tampão fosfato salino (PBS) após 1, 7 e 14 dias, além de investigações do efeito no reparo ósseo do novo scaffold utilizando implantação do mesmo em defeitos ósseos tibiais em ratos. Análises histopatológicas, imunohistoquímicas e biomecânicas foram realizadas 15, 30 e 60 dias após a implantação. Os scaffolds apresentaram estruturas altamente porosas (porosidade de ~75%) e interconectadas, e o biovidro precursor mineralizou uma camada de hidroxicarbonatoapatita (HCA) em SBF (simulated body fluid) após o curto período de 12 h. A incubação em PBS indicou que as fibras do scaffold apresentaram sinais de degradação com o passar do tempo. Sobre os testes biológicos, o novo biomaterial levou a um aumento da proliferação de fibroblastos e osteoblastos, e nenhum dano ao DNA foi observado. Os experimentos de implantação do material no subcutâneo indicaram degradação do biomaterial acompanhada do crescimento interno de tecido mole e presença de células gigantes multinucleadas ao redor do implante. Após 60 dias, os scaffolds estavam quase completamente absorvidos e um tecido de granulação organizado preenchia a área de implantação. Adicionalmente, as análises histológicas dos scaffolds em defeitos ósseos revelaram uma degradação progressiva do biomaterial e substituição do mesmo por tecido de granulação e tecido ósseo neoformado. A histomorfometria mostrou uma maior quantidade de osso neoformado no grupo controle (CG) comparado ao grupo biomaterial (BG) 15 dias após a cirurgia. No entanto, depois de 30 e 60 dias, CG e BG apresentaram quantidades similares de osso neoformado. Além disso, o novo biomaterial aumentou a expressão de RUNX-2 e RANK-L, e também melhorou as propriedades mecânicas do calo tibial 15 dias após a cirurgia. Os resultados indicam que o novo scaffold vítreo fibroso é bioativo, não-citotóxico, biocompatível e promissor para utilização na engenharia do reparo ósseo.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-06T14:55:01Z No. of bitstreams: 1 Vilma Sobral Bezerra.pdf: 3241045 bytes, checksum: 1dbe7e33df34dacca3124c036d6370bd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T14:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilma Sobral Bezerra.pdf: 3241045 bytes, checksum: 1dbe7e33df34dacca3124c036d6370bd (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Dairy proteins have bioactive peptides production great potential, however, their bioactivity is achieved only after enzymatic hydrolysis, which produces substances beneficial to health when incorporated into food or pharmaceuticals. Among them, casein has been used for this purpose. This study aims to determine peptide profile and amino acid sequence of bioactive peptides derived from Moxotó goat milk casein hydrolysis, using proteolytic enzymes such as trypsin, pepsin, papain and a protease extracted from Penicillium aurantiogriseum URM 4622. Enzymatic hydrolysis was performed using a statistical experimental design, which independent variables were pH, enzyme substrate (E: S), temperature and reaction time in Moxotó goat milk casein hydrolysis. Hydrolysis products were visualized in SDS-PAGE electrophoresis. Hydrolysates subjected to ultrafiltration (cut off 3000Da) were used to determine biological properties. Antioxidant activity was evaluated by ABTS + [2,2 '-Azin-bis (3-ethylbenzothiazoline) 6-sulfonic acid] method, using the pool of peptides (permeate <3000Da; retentate >3000Da). Antimicrobial activity was determined by the Clinical and Laboratory Standards Institute. Binding through the zinc solubility of zinc in the sample by Mass Spectrometry Inductively Coupled Plasma. Peptide profile and amino acid sequences were determined by mass spectrometry MALDI-TOF-MS/MS. The best hydrolysis degree (38.27%) was obtained with pepsin enzyme pH 3.0, 1:100 E: S, temperature of 40°C and 5 hours time reaction. However, a high hydrolysis degree precluded the use of these hydrolysates for bioactive peptides obtention. Casein tryptic hydrolysates demonstrated antioxidant activity up to 3242.3 μmol.L-1TROLOX/mg peptide in retentate (> 3000Da). By papain use, we obtained an activity up to 2329.6 μmol.L-1TROLOX /mg of peptide in permeate (<3000Da). The peptides produced by P. auratiogriseum protease action showed activity from 843.17 to 2587.30 μmol.L-1of Trolox / mg of 10 and 29% peptides hydrolysates, respectively, which were compatible with natural antioxidants, such as C vitamin and α-tocopherol. Goat casein tryptic hydrolysates demonstrated antimicrobial activity against Enterococcus faecalis ATCC 6057, Escherichia coli ATCC 2508, Klebisiela pneumoniae ATCC 29665, Bacillus subtilis ATCC 6633. Casein hydrolysates showed IC50 of 4.46 mg/g for zinc binding. Mass spectrometry MALDI TOF MS\MS allowed the visualization of caprine casein peptides in permeate (<3000Da), ranging from 568 to 2923 Da. It also showed LLYQEPVLGPV and HPINHQGLSPEVPNENLLR amino acids sequences for αs1 and β-casein, respectively, from casein tryptic hydrolysates; LLYQEPVLGPV sequences of β-casein, the NPWDQVK αs2 NENLL-casein and-casein in the αS1 casein hydrolysates by papain use; LLYQEPVLGPVRGPFPI β-casein sequence from casein hydrolysates obtained by the use of P. aurantiogriseum URM 4622 protease. The casein hydrolysates bioactive properties are referent to the prevalence of hydrophobic amino acids, which possibility of their use as bioactive peptides. / Proteínas lácteas apresentam grande potencial na produção de peptídeos bioativos. A caseína se destaca na produção de bioativos. Entretanto, a sua bioatividade só é conseguida após hidrólise enzimática, ao qual se produz substâncias benéficas à saúde quando incorporados em alimentos ou produtos farmacêuticos. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar e a avaliar atividades biológicas e determinando o perfil peptídico e a sequência de aminoácidos dos peptídeos bioativos obtidos a partir de hidrólise da caseína do leite de cabra Moxotó, usando enzimas proteolíticas tripsina, pepsina, papaína e protease extraída de Penicillium aurantiogriseum URM 4622. A hidrólise enzimática foi realizada através de planejamento experimental estatístico, os quais as variáveis independentes foram pH, relação enzima substrato (E:S), temperatura e tempo de reação na hidrólise da caseína do leite de cabra Moxotó. Os produtos de hidrólise foram visualizados em eletroforese SDS‑PAGE. Os hidrolisados submetidos à ultrafiltração (Cut off 3000Da) foram utilizados para determição das propriedades biológicas. A atividade antioxidante foi avaliada no pool de peptídeos, permeado (<3000Da) e retentado (>3000Da) usando-se o método ABTS+ [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico]. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método do Clinical and Laboratory Standards Institute. O carreamento de zinco através da solubilidade do zinco na amostra através da Espectrometria de Massa em Plasma Indutivamente Acoplado. O perfil peptídico e as sequências de aminoácidos foram determinados por espectrometria de massa MALDI-TOF-MS/MS. O melhor grau de hidrólise (38,27%) foi obtido com a enzima pepsina usando pH 3,0, E:S de 1:100, 40ºC e 5 horas de reação. Entretanto, um alto grau de hidrólise impossibilitou o uso desses hidrolisados para obtenção de peptídeos bioativos. Os hidrolisados trípicos da caseína mostraram atividade antioxidante de até 3.242,3μmol.L-1TROLOX/mg de peptídeo no retentado (>3000Da). Com o uso da papaína, obteve-se uma atividade de até 2.329,6μmol.L-1TROLOX/mg de peptídeo no permeado (<3000Da). Os peptídeos produzidos pela ação da protease produzida por P. auratiogriseum apresentaram atividade de 843,17 a 2.587,30μmol.L-1de TROLOX/mg de peptídeos para os hidrolisados com 10 e 29% respectivamente, os quais foram compatíveis a antioxidantes naturais, como a vitamina C e α-tocoferol. Os hidrolisados trípticos da caseína caprina apresentaram atividade antimicrobiana frente a Enterococcus faecalis ATCC 6057, Escherichia coli ATCC 2508, Klebisiela pneumoniae ATCC 29665, Bacillus subtilis ATCC 6633. Os hidrolisados de caseína mostraram IC50 de 4,46mg/g para carreamento de zinco. A espectrometria de massa MALDI TOF MS permitiu visualizar os peptídeos no permeado (<3000Da) da caseína caprina, na faixa de 568 a 2.923 Da. Mostraram as sequências LLYQEPVLGPV e HPINHQGLSPEVPNENLLR e da β- e αs1-caseina para hidrolisados trípticos da caseína; as sequências LLYQEPVLGPV da β-caseína, NPWDQVK da αs2-caseina e NENLL da αS1-caseína nos hidrolisados da caseína com o uso da papaína e a sequência LLYQEPVLGPVRGPFPI da β-caseina no hidrolisado da caseína com o uso da protease produzida por P. aurantiogriseum URM 4622. As propriedades bioativas dos hidrolisados da caseína referem-se à prevalência de aminoácidos hidrofóbicos, o que possibilita o uso destes como peptídeos bioativos.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-26T11:49:42Z No. of bitstreams: 1 Ana Carla da Silva Caetano.pdf: 782522 bytes, checksum: f2c222ad97acdbff5efc95970a75c528 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T11:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Carla da Silva Caetano.pdf: 782522 bytes, checksum: f2c222ad97acdbff5efc95970a75c528 (MD5) Previous issue date: 2009-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The observation that the plants have biologically active substances, mainly polyphenols, that provide benefits to health, has driven studies on the antioxidant property. Thus, considering that the agri-industrial waste from acerola also contains phenolic compounds, this study was carried out to determine the procedure for extraction of polyphenols and the antioxidant activity of their extracts. Hyidroacetone, hydroethanolic, hydromethanolic and aqueous extracts, obtained by sequential extraction procedure, combining three extraction cycles (20 minutes each one) and two temperatures (25 ± 2ºC and 50 ± 2ºC), were submitted to the determination of total phenolic and screened for their free DPPH• (1,1-diphenyl-2-picrilhidrazil) and ABTS•+ (2,2 '-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina 6-sulfonic acid) scavenging activity and their effect on the linoleic acid peroxidation by the ferric thiocyanate method.Soybean oil with the addition of the extracts (200ppm) were submitted to anaccelerated storage test in an oven at 60°C for 28 days, where sample were taken at time intervals and analyzed for peroxide value and conjugated dienes. The extracts showed high content of total polyphenols; however, the hydroacetone extract exhibited the highest total phenolic content (5,954.2 μg catechin equivalent. mL-1). Hydroethanolic and hydromethanolic extracts exhibited good DPPH• scavenging activity (low value of EC50 and TEC50, high value of EA), good ABTS•+ scavenging capacity (1.445,1 e 1.145,5μMol TEAC/g, respectively), high percentage of inhibition of peroxidation of linoleic acid (96.12% and 91.84%, respectively). These extracts showed the ability to retard the formation of peroxides and conjugated dienes in soybean oil. The procedure involves aqueous-organic solvents, three cycles of extraction and temperature of 25°C is effective in the extraction of phenolic compounds. Although, the hydroacetone extract has exhibited the highest total phenolic content, the antioxidant action of this extract was less than shown by hydroethanolic and hydromethanolic extracts that, under the experimental conditions, exhibited the best antioxidant activity, both in model system and in soybean oil. Therefore, the agri-industrial waste from acerola can be considered as a source of natural antioxidants and can be useful in food applications in replace or in association with synthetic antioxidants. / A constatação de que os vegetais possuem substâncias biologicamente ativas, principalmente polifenóis, que trazem benefícios à saúde, tem impulsionado estudos sobre sua propriedade antioxidante. Assim, considerando que os resíduos gerados pela agroindústria de polpa de frutas, ainda, contém significante teores de compostos fenólicos, este trabalho teve como objetivo determinar o solvente e a temperatura mais eficiente para a extração destes fitoquímicos a partir de resíduos de acerola e avaliar o potencial antioxidante de seus extratos. Desta forma, extratos hidroacetônico,hidroetanólico, hidrometanólico e aquoso, obtidos por processo de extração seqüencial, em duas temperaturas (25 ± 2ºC e 50 ± 2ºC), foram avaliados quanto ao teor de compostos fenólicos, e a sua ação antioxidante em sistemas modelos, por meio do método da capacidade de seqüestro do radical DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), do radical ABTS•+ (2,2’-azino-bis- (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) e da inibição da peroxidação do ácido linoléico pelo método Tiocianato Férrico, bem como, em óleo de soja por meio do teste acelerado em estufa. Quanto ao teor de fenólicos, independente da temperatura usada no processo de extração, destacou-se o hidroacetônico por ter apresentado o mais elevado teor (5.954,2 μg em equivalente de catequina. mL-1). Os extratos hidroetanólicos e hidrometanólico exibiram forte capacidade de seqüestro do radical DPPH• (baixo valor de EC50 e de TEC50, alto valor de EA), elevada capacidade de seqüestro do radical ABTS•+ (1.445,1 e 1.145,5μMol TEAC/g, respectivamente), e forte proteção do ácido linoléico contra a peroxidação (96,12% e 91,84% respectivamente). Estes extratos, também, apresentaram boa capacidade em retardar formação de peróxidos e de dienos conjugados em óleo de soja. Os resultados obtidos permitem evidenciar que o procedimento envolvendo solventes orgânico-aquosos, três ciclos de extração e a temperatura de 25°C se mostrou eficaz na extração de fenólicos totais. O solvente hidroacetônico embora tenha propiciadoa extração de uma maior quantidade de fenólicos totais, a ação antioxidante deste extrato foi inferior a exibida pelos extratos hidroetanólico e hidrometanólico que, nas condições experimentais, exibiram a melhor ação antioxidante, tanto em sistema modelo como no teste acelerado em estufa. Desta forma, o resíduo agroindustrial de acerola apresenta-se como fonte de antioxidante natural, permitindo vislumbrar a sua utilização em alimentos em substituição ou em associação aos antioxidantes sintéticos.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

Foram desenvolvidos e manufaturados compósitos porosos com estrutura de gradiente funcional em Poli (metacrilato de metila) (PMMA) e Hidroxiapatita (HAp) aplicáveis como implantes ósseos. O PMMA é largamente utilizável e aceito como material de implante tem boas propriedades mecânicas, baixo custo, fácil manufatura, porém é considerado bioinerte. A HAp é uma cerâmica comprovadamente bioativa, porém de baixas propriedades mecânicas, alto custo e de difícil manufatura. O PMMA com estrutura funcional e HAp apresentou valores próximos a 50 MPa, mas com potencial de melhoria. O objetivo deste desenvolvimento é produzir um implante com a sua superfície porosa e bioativa, para que este possa ser osteointegrado em um tempo menor ao tecido hospedeiro, melhorando a relação: material implantado/leito receptor. O conceito é baseado em uma estrutura de núcleo denso em PMMA e camada superficial porosa com superfície bioativa. A camada de PMMA porosa foi desenvolvida utilizando-se o carboximetilcelulose (CMC) como agente porogênico e HAp como agente bioativador da matriz polimérica. Foram elaboradas análises de bicompatibilidade, resistência mecânica, macro e microestrutura. Para testar a biocompatibilidade foram realizados inicialmente testes in vitro com cultura de células VERO, visando investigar a toxicidade dos materiais constituintes, a influência do novo biomaterial em atividades celulares e o comportamento destes em condições próximas daquelas a serem encontradas no ambiente de implantação. Em seguida, os testes in vivo realizados em coelhos averiguaram a interação tecido-material (bioatividade), a biocompatibilidade do material, e a potencialidade do uso do material em aplicação à superfícies (osteointegração). Foi realizada análise histológica dos tecidos explantados, onde os resultados basearam-se na análise da morfologia geral dos componentes teciduais encontrados junto ao implante. A caracterização da superfície foi realizada por testes de rugosidade, por microscopia ótica e eletrônica de varredura. Foram realizados ensaios mecânicos de compressão para analisar a resistência mecânica do biomaterial. Os resultados in vitro mostraram que os materiais utilizados não apresentaram qualquer indício de toxicidade. Através das imagens realizadas em MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura) pode se observar o crescimento de células VERO na superfície do material e em direção aos poros da matriz. A análise macroestrutural dos poros também obtida por MEV demonstrou em uma caracterização inicial do material que este apresentou características biomiméticas como poros em formato oblongo e interconectados. A média obtida do tamanho dos poros foi de aproximadamente 250 \'mü\'m. Os resultados dos ensaios mecânicos de compressão mostraram que o PMMA denso é o que mais se aproximou do tecido ósseo cortical com 101 MPa. Por fim, os resultados histológicos apontam para a biocompatibilidade do compósito, tornando-o assim aplicável como camada superficial de implantes. / Were developed and manufactured porous composite with functional gradient structure in Polymethylmethacrylate (PMMA) and hydroxyapatite (HAp) applicable as bone implants. PMMA is widely used and accepted as implant material, has good mechanical properties, low cost, easy manufacturing and considered a bioinert biomaterial, the Hap is a demonstrably bioactive ceramic with poor mechanical properties, high cost and difficult to manufacture. The PMMA functional structure and HAp had values close to 50 MPa, but with potential for improvement. The objective of this development was produced an implant with a porous surface and bioactive to be osteointegrated in a less time, improving the relationship: implanted material/receiver bed. The concept is based on a dense structure core of PMMA and a porous bioactive surface layer. The porous PMMA was developed using the carboxymethylcellulose (CMC) as a porogenic agent and hap to bioactive the PMMA matrix. Biocompatibility tests, mechanical strength tests and macro and microstructure analisys were carried out. To evaluated the biocompatibility of this material were made primarily in vitro tests, the VERO cells were used in vitro analysis aimed investigate the toxicity of the constituent materials, the influence of the new biomaterial in cellular activities and behavior in these conditions close to those to be found in the environment of deployment. Then, in vivo tests conducted in rabbits evaluated the interaction with tissue-material (bioactivity), the biocompatibility of the material, and the potential use of the material in the application areas (osseointegration). Were performed histological analysis of tissues, where the results were based on the analysis of the general morphology of the tissue components found near the implant. The surface characterization was performed by roughness tests, optical microscopy and SEM. Mechanical tests were conducted to examine the compressive strength of biomaterial. Results in vitro showed that the materials did not present any evidence of toxicity. The samples were analyzed by SEM where the growth of cells can be observed in the surface of the material and towards to the pores. The macrostructural analysis also obtained by SEM showed in an initial characterization of the material that presented bone biomimetics characteristics with oblong pores with interconnected. The average pore size obtained was approximately 250 \'mü\'m. The results of mechanical tests showed that the compression of PMMA is the densest approached the cortical bone tissue near 101 MPa. Finally, the histological results point to the biocompatibility of the composite, thus making it applicable to the surface layers of implants.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2011

Dentre as opções de terapias dessensibilizantes, a proposta mais recente para o tratamento da Hipersensibilidade Dentinária é o uso do biovidro. Esse novo material apresenta a capacidade de promover a formação de hidroxiapatita na superfície da dentina, representando uma união química mais estável e duradoura sobre os túbulos dentinários. Este trabalho comparou o efeito de uma nova formulação de biovidro disperso em ácido fosfórico 30%, associado ao laser de Nd:YAG e ao laser de CO2 na obliteração de túbulos dentinários expostos. Foram obtidas 96 amostras de dentina humana que foram divididas em 6 grupos experimentais (n=16) e distribuídas como a seguir: G1 -­ controle negativo (nenhum tratamento adicional);? G2 -­ laser de Nd:YAG;? G3 -­ laser de CO2;? G4 -­ pasta de biovidro (biovidro + ácido fosfórico 30%);? G5 -­ pasta de biovidro + laser de Nd:YAG;? G6 -­ pasta de biovidro + laser de CO2. Os grupos G5 e G6 foram irradiados com laser de Nd:YAG e laser de CO2, respectivamente, após tratamento com a pasta de biovidro disperso em ácido fosfórico. Ao final do experimento, os grupos foram analisados qualitativamente por Espectroscopia de Infravermelho na Transformada de Fourier (FTIR), Difração de Raios X (DRX), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Dispersão de Energia de Raios X (EDS). As análises evidenciaram que a dipersão do biovidro em ácido fosfórico 30% é capaz de formar cristais de hidrogenofosfato de cálcio e, quando a pasta formulada é aplicada sobre a dentina, ocorrem reações químicas com a estrutura dental, formando cristais de monetita. Ao irradiar os cristais formados com laser de Nd:YAG e CO2, ocorreu a desidratação desses cristais, levando à formação de hidroxiapatita. As imagens de MEV demonstram a formação de precipitados cristalinos e amorfos de dimensões variadas sobre a superfície de dentina e na entrada dos túbulos dentinários em todos os grupos que receberam o tratamento com a formulação de biovidro. O laser de CO2 foi capaz de promover alterações na morfologia do material formado de maneira ainda mais evidente especialmente nas dimensões e disposição dos cristais de hidroxiapatita formado sobre a superfície. A análise de EDS evidenciou presença de silício, composto que não está presente naturalmente na estrutura dentária, mas somente na composição do biovidro. Dessa forma, pode-­se concluir que a associação do pó de biovidro com ácido fosfórico 30% permitiu a formação de uma camada de cristais na superfície e entrada dos túbulos dentinários, evidenciando que a pasta formulada viabiliza a aplicação e manutenção do biovidro sobre a superfície dentinária. Sua associação com o laser de Nd:YAG e CO2 parece melhorar a interação desses cristais com a dentina, formando cristais de hidroxiapatita. Nesse estudo, o laser de CO2 promoveu a melhor distribuição e conformação dos cristais sobre a dentina. / Among desensitizing therapies options, the most recent proposal for Dentin Hypersensitivity treatment is the use of bioglass. This new material presents the ability to promote the formation of hydroxyapatite on dentin surface, representing a more stable and lasting chemical bond on dentin tubules. This work compared the effect of a new formulation of bioglass dispersed in 30% phosphoric acid, associated with Nd: YAG laser and CO2 laser in the obliteration of exposed dentin tubules. 96 human dentin samples were obtained, divided into 6 experimental groups (n = 16) and distributed as follows: G1 -­ negative control (no additional treatment);? G2-­ Nd: YAG laser;? G3 - CO2 laser;? G4 -­ bioglass paste (bioglass + 30% phosphoric acid);? G5 -­ bioglass paste + Nd: YAG laser;? G6 -­ bioglass paste + CO2 laser. Groups G5 and G6 were irradiated with Nd:YAG laser and CO2 laser, respectively, after treatment with the slurry dispersed in phosphoric acid. At the end of the experiment, all groups were qualitatively analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-­ray Diffraction (XRD), Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-­ray Energy Dispersion Spectroscopy (EDS). The analysis showed that the dispersion of bioglass in 30% phosphoric acid forms calcium hydrogen phosphate crystals and when the formulated paste is applied on dentin surface, chemical reactions occur with the dental structure, forming monetite crystals. When irradiating these crystals with Nd: YAG and CO2 laser, dehydration of these crystals occurred leading to the formation of hydroxyapatite. MEV images demonstrate the formation of crystalline and amorphous precipitates of varying dimensions on the dentin surface and at the entrance of dentinal tubules in all groups receiving treatment with the bioglass formulation. The CO2 laser was able to promote changes in the morphology of the formed material even more evident especially in the dimension and arrangement of hydroxyapatite crystals formed on the surface. The analysis of EDS showed the presence of silicon, a compound that is not naturally present in the tooth structure, but only in the bioglass composition. Thus, it can be concluded that the association of bioglass powder with 30% phosphoric acid allowed the formation of a layer of crystals on the surface and its entrance of the dentinal tubules, evidencing that the formulated paste enables the application and maintenance of bioglass on dentin surface. Its association with the Nd:YAG and CO2 laser seems to improve the interaction of these crystals with dentin, forming hydroxyapatite crystals. In this study. CO2 laser promoted better crystals distribution and conformation on dentin surface.