Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Rondinelli Donizetti Herculano / Banca: Sergio Luiz de Souza Salvador / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Jean Leandro dos Santos / Banca: Janaina Habib Jorge / Resumo: O aumento na incidência de infecções fungicas tem progredido significativamente e dados epidemiológicos mostram que as leveduras do gênero Candida são as principais responsáveis pelas micoses em humanos. A terapêutica para o tratamento dos processos infecciosos causados por fungos tem encontrado uma série de problemas, como a crescente evolução da resistência aos antimicrobianos, o número restrito de fármacos disponíveis e os efeitos colaterais. Neste contexto, faz-se necessário o desenvolvimento de antifúngicos mais eficazes e menos tóxicos. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi o de realizar a síntese e verificar a atividade antifúngica de derivados nitrofuranos contra células planctônicas e biofilmes de cepas padrão de Candida spp., bem como analisar os efeitos tóxicos destes compostos em modelos alternativos ao uso de mamíferos. Realizou-se a síntese e caracterização físico-química de derivados nitrofuranos. Estes tiveram sua sensibilidade testada contra células planctônicas e biofilmes de Candida spp. nos tempos de 6, 24 e 48 horas. Além disso, foram realizados ensaios de citotoxicidade dos derivados nitrofuranos, bem como ensaios de toxicidade em Galleria mellonella, Danio rerio (zebrafish) e Caenorhabditis elegans. Os resultados obtidos mostraram que os compostos L7CF 113 e L7CF165 foram os que apresentaram melhor atividade antifúngica. Os biofilmes de C. albicans, C. krusei e C. glabrata formados em 6 horas apresentaram atividade metabólica reduzida quando em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increase in the incidence of fungal infections has progressed significantly and epidemiological data show that yeasts of the genus Candida are the main responsible for the mycoses in humans. Therapy for the treatment of infectious processes caused by fungi has encountered a number of problems, such as the increasing evolution of antimicrobial resistance, the limited number of drugs available and the side effects. In this context, the development of more effective and less toxic antifungal agents is necessary. The objective of the present study was to perform the synthesis and to verify the antifungal activity of nitrofuran derivatives against planktonic cells and biofilms of references strains of Candida spp., as well as to analyze the toxic effects of these compounds in alternative models to the use of mammals. The physicochemical synthesis and characterization of nitrofuran derivatives was carried out. These had their sensitivity tested against planktonic cells and biofilms of Candida spp. at times of 6, 24 and 48 hours. In addition, cytotoxicity assays of nitrofuran derivatives as well as toxicity assays were performed in Galleria mellonella, Danio rerio (zebrafish) and Caenorhabditis elegans. The results obtained showed that the compounds L7CF 113 and L7CF 165 showed the best antifungal activity. The biofilms of C. albicans, C. krusei and C. glabrata formed in 6 hours showed reduced metabolic activity when in contact with the compounds L7CF 113 and L7CF 165 in concentrations equal to or greater than 62.50 μg / mL. The biofilms of C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapasilosis and C.tropicalis, formed at 24 and 48 hours, presented reduced metabolic activity for compound L7CF 113 and L7CF 165 in concentrations equal to or greater than 125 μg / mL. The cytotoxicity assays... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Banca: Luciane Dias de Oliveira / Banca: Sandra Giacomin Schneider / Resumo: O objetivo neste estudo foi avaliar in vitro a influência da liga Ti-35Nb-7Zr e de seus elementos básicos, submetidos ou não ao processo de oxidação, na atividade de osteoblastos e na formação de biofilmes monotípicos. As amostras foram confeccionadas com diferentes materiais: a) titânio puro (Ti - controle); b) liga Ti-35Nb-7Zr (L); c) Nb (nióbio); d) Zr (zircônio); e) Ti oxidado (TiO); f) liga Ti-35Nb-7Zr oxidada (LO); g) Nb oxidado (NbO); h) Zr oxidado(ZrO). Previamente ao estudo in vitro, todas as amostras foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de dispersão de energia (EDS) para observar a topografia de superfície e a presença dos elementos básicos. Células mesenquimais obtidas de fêmures de rato, após diferenciação em osteoblastos foram cultivadas sobre as amostras. Após períodos pré-determinados, foram realizados os testes de citotoxicidade, atividade de fosfatase alcalina, produção de proteína total, formação e quantificação dos nódulos de mineralização adesão e proliferação celular. Para análise da formação dos biofilmes monotípicos, suspensões padronizadas (106 céls/mL) com micro-organismos de S. aureus, S. mutans, P. aeruginosa e C. albicans foram cultivados por 24 h sobre as amostras e submetidos ao teste de MTT. Todas as amostras permitiram o espraiamento celular. O Nb e Zr exibiram uma adesão celular mais madura com prolongamentos celulares evidenciados. O Ti e a L apresentaram maior viabilidade celular sendo estatísti... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate in vitro the influence of the Ti-35Nb- 7Zr alloy and its basic elements, whether or not subjected to the oxidation process, on the osteoblast activity and on the formation of monotypic biofilms. The samples were made with different materials: a) pure titanium (Ti - control); B) Ti-35Nb-7Zr (A) alloy; C) Nb (niobium); D) Zr (zirconium); E) Oxidized Ti (TiO); F) oxidized Ti-35Nb-7Zr (AO); G) Nb oxidized (NbO); H) Oxidized Zr (ZrO). Prior to the in vitro study, all samples were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) to observe the surface topography and the presence of the basic elements. Mesenchymal cells obtained from mouse femurs after differentiation into osteoblasts were cultured in the samples. After pre-determined periods, cytotoxicity tests, alkaline phosphatase activity, total protein production, formation and quantification of the mineralization nodules, adhesion and cell proliferation were performed. To analyze the formation of monotypic biofilms, standardized suspensions (106 cells / ml) with S. aureus, S. mutans, P. aeruginosa and C. albicans microorganisms were cultured for 24 h on the samples and submitted to the MTT test. All samples allowed for cell spreading. Nb and Zr exhibited more mature cell adhesion with evidenced cell extensions. The Ti and A presented greater cell viability being statistically different from the others (p <0.05). ZrO presented lower viability exhibiting statistical difference with Ti and A. The NbO expressed the highest amount of total protein with a statistical difference of L, Zr, and AO (p <0.05) while Zr showed the lowest result with a statistical difference of Ti, Nb, TiO, NbO, and ZrO. In the quantification of the alkaline phosphatase activity, the Zr presented the best result and was statistically different from all the others ..... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: A mastite é considerada um grande problema na pecuária leiteira e o uso frequente de antimicrobianos contribui para o aumento da pressão seletiva de micro-organismos resistentes aos principais fármacos. A Organização Mundial da Saúde Animal tem alertado para o risco da resistência antimicrobiana resultante do uso indevido de antimicrobianos no tratamento de animais doentes. O presente trabalho tem como objetivos identificar e caracterizar o perfil clonal, bem como os fatores de virulência e de resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus spp. isolados do leite de bovinos com mastite subclínica de várias regiões do Brasil. As amostras foram concedidas pela Embrapa Gado de Leite, provenientes de 6 estados brasileiros, incluindo Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco. Foram incluídas 181 amostras de Staphylococcus spp. no estudo. A identificação fenotípica revelou um total de 82 (45,3%) Staphylococcus aureus e 99 (54,7%) Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Destes, a espécie mais isolada foi S. chromogenes com 27 (14,9%) amostras, seguido de S. epidermidis com 26 (14,3%). Realizou-se a confirmação genotípica utilizando a técnica Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) de todas as amostras, demonstrando um total de 98% de concordância com o teste fenotípico. Quanto à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), S. aureus revelou 99% de sensibilidade à oxacilina, enquanto os CoNS apresentaram 32% de resistência à esse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastitis is considered a major problem in dairy farming and the frequent use of antimicrobials contributes to increased selection pressure of resistant micro-organisms to the main drugs. The World Organisation for Animal Health are aimed at the protection of animal and human health against the risk of antimicrobial resistance resulting from the treatment of sick animals. This study aims to identify and characterize the clonal profile and the virulence as well as the virulence factors and the antimicrobial resistance to Staphylococcus spp. isolated from bovine milk with subclinical mastitis from several regions of Brazil. The samples were provided by Embrapa Gado de Leite (Embrapa Dairy Cattle), from 6 Brazilian states, including Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo and Pernambuco. A total of 181 samples of Staphylococcus spp. were included in the study. Phenotypic identification revealed a total of 82 (45.3%) Staphylococcus aureus and 99 (54.7%) Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) and, of these, the most isolated species was S. chromogenes with 27 (14.9%) samples, followed by S. epidermidis with 26 (14.3%). We realized the genotypic confirmation by using the technique Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) of all samples, demonstrating a total of 98% of concordance with the phenotypic test. As for the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), S. aureus showed 99% of susceptibility to oxacillin, while CoNS showed 32% resist... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Célia Maria Landi Franco / Coorientador: Maria Victória Eiras Grossmann / Banca: Thaís de Souza Rocha / Banca: Magali Leonel / Banca: Ivo Mottin Demiate / Banca: José Francisco Lopes Filho / Resumo: O efeito do padrão cristalino do amido na obtenção e na morfologia, características estruturais, moleculares e físico-químicas de nanocristais de amido (NCA) e sua aplicação em biofilmes foram estudados. Amidos de mandioca, milho e batata foram isolados e caracterizados. Suspensões de amido (14,7% p/v) em 3,16 M H2SO4 foram hidrolisadas durante 1, 3, 5 e 7 dias a 40 °C. As amilodextrinas obtidas foram caracterizadas quanto ao teor de amilose (titulação potenciométrica), espectroscopia vibracional por refletância total atenuada (FTIR-ATR), padrão cristalino e cristalinidade relativa (difração de raios-X), propriedades térmicas (DSC), análise termogravimétrica, distribuição das cadeias de amilodextrinas por cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD), morfologia (MEV e MET) e tamanho (zetasizer). O amido de mandioca foi o mais suscetível à hidrólise devido às imperfeições na sua estrutura cristalina. Os padrões cristalinos das amilodextrinas mantiveram-se inalterados e a cristalinidade e as temperaturas de pico aumentaram com o tempo de hidrólise, enquanto a temperatura de degradação térmica diminuiu, independentemente do tempo de tratamento e da fonte de amido. As amilodextrinas (amidos de mandioca e milho) com padrão tipo A foram estrutural e termicamente mais estáveis que aquelas com padrão B (amido de batata), mas suas partículas tiveram maior tendência para aglomeração. NCA foram observados em MET a partir do terceiro... / Abstract: The effect of the crystalline pattern of starch on the obtainment and on the morphology, structural, molecular and physicochemical characteristics of starch nanocrystals (SNC) and their application in biofilms have been studied. The cassava, corn and potato starches were isolated and characterized. Suspensions of starch (14.7% w/v) in 3.16 M H2SO4 were hydrolyzed for 1, 3, 5 and 7 days at 40 °C. The amylodextrins obtained were characterized regarding amylose content (potentiometric titration), attenuated total reflectance vibration spectroscopy (FTIR-ATR), crystalline pattern and relative crystallinity (X-ray diffraction), thermal properties (DSC), thermogravimetric analysis, distribution of amylodextrins chains in high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD), morphology (SEM and TEM) and size (zetasizer). Cassava starch was the most susceptible to hydrolysis due to imperfections in its crystalline structure. The crystalline patterns of amylodextrins kept unchanged and crystallinity and peak temperature increased with hydrolysis time, while thermal degradation temperature decreased, independently of treatment time and starch source. A-type amylodextrins (cassava and corn starches) were structurally and thermally more stable than B-amylodextrins (potato starch), but their particles had a greater tendency to agglomeration. SNC were observed by TEM from the third day of hydrolysis in cassava amylodextrins, while corn and potato ... / Doutor

Orientador: Marcelle Danelon / Coorientador: Alberto Carlos Botazzo Delbem / Banca: Francisco Nunes Souza Neto / Banca: Robson Frederico Cunha / Resumo: Objetivo: Avaliar o efeito de um dentifrício fluoretado contendo trimetafosfato de sódio de tamanho nanométrico (TMPnano) na desmineralização do esmalte in situ e composição do biofilme. Métodos: Este estudo foi duplo-cego cruzado consistindo em quatro fases experimentais (7 dias cada) com 12 voluntários que utilizavam dispositivos orais contendo quatro blocos de esmalte bovino. O desafio cariogênico foi realizado por solução de sacarose 30% (6x/dia). Os tratamentos com dentífricos (3x/dia) foram os seguintes: sem F/TMP/TMPnano (Placebo), 1100 ppm F (1100F), 1100F mais 3% de TMP micrométrico ou nanométrico (1100F/TMP; 1100F/TMPnano). A porcentagem de perda de dureza da superfície (%SH) e a perda integrada de dureza de subsuperfície (ΔKHN), bem como o cálcio (Ca), o fósforo (P) e o fluoreto (F) foram determinados. Além disso, o biofilme formado nos blocos foi analisado quanto às concentrações de polissacarídeos extracelulares (EPS), F, Ca, P. Os dados foram analisados utilizando ANOVA 1-critério de medidas repetidas seguidas pelo teste Fisher LSD (p < 0,001). Resultados: 1100F/TMPnano promoveu menor %SH e ΔKHN entre todos os grupos (p < 0,001). A adição de TMPnano a 1100F não aumentou a absorção de F no esmalte, mas aumentou significativamente as concentrações de Ca do esmalte (p <0,001). 1100F/TMPnano apresentou valores mais baixos de concentração de EPS quando comparados com 1100F (~ 80%) (p < 0,001). Quanto os graus de saturação, os grupos 1100F/TMP e 1100F/TMPnano mostrar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objective: To evaluate the effect of a fluoride toothpaste containing nano-sized sodium trimetaphosphate (TMPnano) on enamel demineralization in situ and composition of the biofilm. Methods: This crossover double-blind study consisted of four phases (7 days each) and 12 volunteers who wore oral appliances containing four enamel bovine blocks. The cariogenic challenge was performed by 30% sucrose solution (6x/day). The toothpaste treatments (3x/day) were as follows: no F/TMP/TMPnano (Placebo), 1,100 ppm F (1100F), 1100F plus 3% micrometric or nano-sized TMP (1100F/TMP; 1100F/TMPnano). Percentage of surface hardness loss (%SH), and integrated loss of subsurface hardness (ΔKHN), as well as enamel calcium (Ca), phosphorus (P), and fluoride (F) were determined. Moreover, biofilm formed on the blocks were analyzed for F, Ca, P, and insoluble extracellular polysaccharide (EPS) concentrations. Data were analyzed using one-way ANOVA, repeated measures followed by Fisher LSD test (p < 0.001). Results: 1100F/TMPnano promoted the lowest %SH and ΔKHN among all groups (p < 0.001). The addition of TMPnano to 1100F did not enhance enamel F uptake, but significantly increased enamel Ca concentrations (p < 0.001). 1100F/TMPnano showed lower values of EPS concentration when compared with 1100F (~80%) (p < 0.001). As for phase saturation, the 1100F/TMP and 1100F/TMPnano groups showed the highest supersaturation with respect to HA and similar to each other for CaF2 (p > 0.001). The ionic activity of CaF+ and HF0 for the 1100F/TMP and 1100F/TMPnano groups were similar (p > 0.001). Conclusion: 1100F/TMPnano promoted a greater protective effect against enamel demineralization and significantly affected the composition of biofilm formed in situ when compared to 1100F toothpaste. Clinical Significance: This toothpaste could be a viable alternative to patients at high risk of caries / Mestre

Orientador: Daniela Micheline dos Santos / Banca: Marcela Filie Haddad / Banca: Cristiane Duque / Banca: Valentim Adelino Ricardo Barão / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: O controle da formação de biofilme é essencial para manter a saúde da cavidade anoftálmica dos portadores de prótese ocular. As propriedades físicas da resina acrílica, como a sua rugosidade, podem interferir na adesão de microrganismos nas próteses e na formação de biofilmes. Sendo assim, é necessário utilizar soluções de limpeza eficazes e que não causem irritação tecidual na conjuntiva ocular. O objetivo desse trabalho foi verificar a influência da rugosidade de superfície da resina acrílica utilizada na confecção de próteses oculares na formação de biofilme bacteriano, bem como avaliar a eficácia antimicrobiana e citotoxicidade de diferentes soluções para desinfecção de próteses oculares. Para a análise da rugosidade, corpos de prova de resina acrílica foram confeccionados e divididos em 5 grupos de acordo com a granulação de lixa de polimento utilizada: 120, 400, 800, 1200 e 1200S (lixa + sílica). A rugosidade dos corpos de prova foi mensurada por meio de perfilômetro e imagens de Microscopia de Força Atômica foram obtidas para cada grupo. O crescimento das espécies Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sobre os corpos de prova foi avaliado após 4 e 24h, por meio da contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/mL. O efeito dos seguintes tratamentos: soro fisiológico, sabão neutro, clorexidina 4%, pastilhas efervescentes Efferdent®, triclosan 1% e citronela sobre biofilme formado sobre os corpos de prova de resina acrílica também foi avaliado por meio da... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The control of biofilm formation is essential to maintain the health of anophthalmic cavity of ocular prosthesis wearers. The physical properties of the acrylic resin, such as surface roughness, may interfere with the adhesion of microorganisms to the prostheses. Therefore, it is necessary to use cleaning solutions that are effective and do not cause tissue irritation in ocular conjunctiva. The aim of this study was to verify the influence of surface roughness of the acrylic resin used in the preparation of ocular prosthesis in the formation of bacterial biofilm, as well as to evaluate the antimicrobial efficacy and cytotoxicity of different disinfectants in ocular prostheses. For roughness analysis, acrylic resin samples were prepared and divided into 5 groups according to the granulation of polishing sandpaper used: 120, 400, 800, 1200 and 1200S (sandpaper + silica). The roughness of the samples was measured using a profilometer and Atomic Force Microscopy images were obtained for each group. The microbial growth for Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis on the samples was evaluated after 4 and 24 h by counting the Colony Forming Units (CFU)/mL. The effect of the following solutions was also evaluated by CFU/mL: non treated group (immersed in saline solution), neutral soap, 4% chlorhexidine, Efferdent® effervescent tablets, 1% triclosan and citronella. The cytotoxicity of the solutions was evaluated by MTT and Neutral Red after treating the samples daily for ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Alberto Carlos Botazzo Delbem / Coorientador: Juliano Pelim Pessan / Coorientador: Douglas Roberto Monteiro / Banca: Rogerio de Castilho Jacinto / Banca: Thiago Cruvinel da Silva / Resumo: O presente estudo teve por objetivo verificar o efeito do trimetafosfato de sódio (TMP), associado ou não ao fluoreto (F), sobre células cultiváveis, biomassa total, atividade metabólica e composição da matriz extracelular de biofilmes mistos de S. mutans e C. albicans, bem como sobre as concentrações de F, cálcio (Ca) e fósforo (P) (biofilme total e fluido do biofilme) e no pH destes biofilmes formados in vitro. Para ambos os estudos, os biofilmes foram formados em poços de placas de microtitulação, colocando uma suspenção (1x107 células/mL C. albicans + 1x108 células/mL S. mutans) em saliva artificial suplementada com sacarose (0,4%), a qual tinha metade de seu conteúdo renovada a cada 24 horas. Os biofilmes foram tratados três vezes (72, 78 e 96 horas de formação), por um minuto, com soluções contendo TMP (0,25, 0,5 ou 1%) com ou sem 500 ppm F, além de soluções contendo 500 e 1100 ppm F, adotadas como controles positivos. A saliva artificial foi utilizada como tratamento e considerada como controle negativo. Para o estudo mircrobiológico, após o terceiro tratamento foram realizados os testes de quantificação de células cultiváveis (CFU), biomassa total (teste colorimétrico de cristal violeta - CV), atividade metabólica (redução de XTT) e quantificação dos componentes da matriz extracelular (proteína, carboidrato e DNA). Todos os ensaios foram realizados em triplicata, em três ocasiões diferentes. Os resultados foram submetidos à análise de variância a um critério, seguida ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of the present study was to verify the effect of sodium trimetaphosphate (TMP), associated or not to fluoride (F), on cultivable cells, total biomass, metabolic activity and composition of the extracellular matrix of mixed biofilms of S. mutans and C. albicans, as well as on the concentrations of F, calcium (Ca) and phosphorus (P) (total biofilm and biofilm fluid) and pH of these biofilms formed in vitro. For both studies, the biofilms were formed in wells of microtiter plates by placing a suspension (1 x 107 cells/mL C. albicans + 1x108 cells/mL S. mutans) in artificial saliva supplemented with sucrose (0,4%), which had half of its content renewed every 24 hours. Biofilms were treated three times (72, 78 and 96 hours of formation), for one minute, with solutions containing TMP (0.25, 0.5 or 1%) with or without 500 ppm F, as well as solutions containing 500 and 1100 ppm F, adopted as positive controls. Artificial saliva was used as treatment and considered as the negative control. For the microbiological study, the following tests were performed: quantification of cultivable cells (CFU), total biomass (colorimetric crystal violet test - CV), metabolic activity (XTT reduction) and quantification of matrix components (protein, carbohydrate and DNA). All assays were performed in triplicate on three different occasions. The results were submitted to one-way analysis of variance, followed by the Fisher LSD‟s test (p<0.05). TMP showed a reducing effect mainly on the metabol... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

Staphylococcus aureus é uma bactéria que pode ser encontrada colonizando diversas partes do corpo humano, entretanto os diversos fatores de virulência que a bactéria possui, ancorados a sua superfície ou excretados para o meio extracelular, tornam essa bactéria um potencial patógeno, causando infecções de pele e tecidos moles, osteomielite, infecções respiratórias, infecções relacionadas a cateteres e outros dispositivos e bacteremia. Um dos fatores de virulência da bactéria, é a habilidade em formar biofilmes. Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilme, pois nestas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. A habilidade de S. aureus em formar biofilme é importante pois o torna uma das principais bactérias que infecta dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam esse tipo de infecção. Os medicamentos da classe dos β-lactâmicos eram a principal escolha para o tratamento de S. aureus, entretanto nos últimos anos essa bactéria adquiriu resistência a esses antimicrobianos, através da aquisição do gene mecA, tornando escassa as opções terapêuticas. Como se não bastasse, os biofilmes bacterianos são particularmente mais resistentes a tratamentos com antibióticos, não só devido ao aumento da transmissão de mecanismos de resistência dentro da comunidade, mas também por causa das limitações de difusão da droga colocados pela matriz extracelular, inativação de antibióticos pela alta concentração de íons de metal e baixo pH, entre outros fatores. Combinados, esses atributos tornam o biofilme bacteriano em torno de 1000 vezes mais tolerante e/ou resistente aos antimicrobianos comparado às células planctônicas. A investigação de estudos epidemiológicos para prevenção dessas infecções, bom como de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes, especialmente em isolados clínicos sabidamente multirresistentes, é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, 8 os sistemas de bombas de efluxo e inibidores de bombas de efluxo representam uma fonte promissora de erradicação do biofilme formado. O principal objetivo deste estudo é investigar características clínico-epidemiológicas em isolados clínicos que estejam associadas a formação de biofilme, bem como investigar o papel de bombas de efluxo, inibidores dessas bombas e novos genes envolvidos na habilidade de isolados clínicos de S. aureus em formar biofilme. O capítulo 1 associa características clínicas e epidemiológicas com a habilidade de formação de biofilme. O capítulo 2 mostra o papel da adição de antimicrobianos na inibição e erradicação de biofilmes, a associação com inibidores de bomba de efluxo para melhor entender os sistemas de bomba de efluxo na capacidade desses isolados em formar biofilme e por último, novos genes que participam desse processo, em isolados clínicos de MRSA. Este estudo permite planejar ações preventivas para essas infecções relacionadas a biofilmes. Além disso, demonstra que os sistemas de bombas de efluxo parecem ser alvos promissores para erradicar infecções associadas a biofilmes bacterianos. / Staphylococcus aureus can be found colonizing the human body, however its virulence factors anchored to its surface or secreted into the extracellular medium, makes this bacteria as a potential pathogenic, causing skin and soft tissue infections, osteomyelitis, respiratory infections, catheter-related and other devices infections and bacteremia. One of the virulence factors that bacteria produce is the ability to form biofilms. Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities, living organized and attached on a biotic or abiotic surface, embedded in a matrix exopolimérica. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotic and the host immune response. The ability of S. aureus to form biofilms is important because it makes it one of the main bacteria that infects medical devices and implants, increasing patient morbidity and mortality. The class of β-lactam drugs used to be main choice for the treatment of S. aureus infections, however in recent years the bacteria acquired resistance to these antibiotics by acquiring mecA gene, so therapeutic options becoming scarce. Besides that, bacterial biofilms are particularly resistant to antibiotic treatments, not only due to increased transmission resistance mechanisms within the community, but also because limitations in drug diffusion by extracellular matrix, inactivation of antibiotics due to high concentration of metal ions and low pH, and other factors. Combined, these attributes make the bacterial biofilm around 1000 times more tolerant and / or resistant to antimicrobial compared to planktonic cells. Investigation of epidemiological studies to prevent such infections, as well as new strategies for prevention and treatment of biofilm infections, especially in known multidrug-resistant clinical isolates, is urgently needed. Among these strategies we could list the different search engines or substances capable of causing or inhibiting the formation of biofilm eradication. In this context, system efflux pumps and efflux pump inhibitors represent a promising source of biofilm eradication. The aim of this study is to investigate the clinical and epidemiological characteristics in clinical isolates that are associated with biofilm formation and investigate the role of efflux pumps and inhibitors of these pumps in the ability of S. 10 aureus clinical isoltes to form biofilms. The chapter 1 associates clinical and epidemiological characteristics with biofilm formation ability. Chapter 2 shows the role of the addition of antimicrobials in inhibition and eradication of biofilms, the association with efflux pump inhibitors to better understand the efflux pump systems in the ability of these isolates to form biofilm and, finally, new genes important in MRSA clincal isolates biofilm formation. This study allows planning preventive actions for these biofilm-related infections. In addition, it demonstrates that efflux pump systems appear to be promising targets for eradicating infections associated with bacterial biofilms.

Apesar de ser principalmente um colonizador da pele e mucosas, Staphylococcus epidermidis, juntamente com outros estafilococos coagulase negativos, tornou-se um importante patógeno oportunista, responsável por infecções nosocomiais associadas ao uso de dispositivos implantáveis. O fator mais importante na patogênese de infecções estafilocócicas associadas a estes dispositivos é a habilidade do patógeno de formar um biofilme bacteriano, sendo que a presença dos genes ica, aap e atlE é considerada importante para a sua formação. Este estudo compara diferentes métodos para a detecção de formação de biofilme em S. epidermidis isolado de cateter venoso central (CVC). Dois métodos fenotípicos foram realizados: o teste da microplaca, considerado o padrão ouro e o teste com ágar Congo Red (ACR). No método genotípico, através da técnica de PCR, foi verificada a presença dos genes icaA, icaD, aap e atlE. Das 166 amostras analisadas, 107(64%) produziram biofilme pelo teste da microplaca, sendo 17 fortes, 23 moderadas e 67 fracas produtoras, enquanto 90(54%) produziram biofilme pelo teste com ACR. Foi verificada a presença dos genes icaA e icaD em 97% (104/107) das amostras produtoras de biofilme pela microplaca; em 77% foi identificado o gene aap e em 92% o gene atlE. Os genes icaA e icaD foram considerados os marcadores mais confiáveis na identificação molecular de biofilme porque apresentaram maior sensibilidade (97%) quando comparados com os demais genes. A ausência de genes icaA e icaD em três isolados produtores de biofilme através do teste da microplaca, chamados de “ica-independente”, sugerem a presença de um mecanismo alternativo de formação de biofilme, como a proteína Aap, que pode substituir funcionalmente PIA como uma adesina intercelular. A alta prevalência do gene atlE entre os isolados deste estudo pode ser explicada pelo fato de a proteína AtlE ser um importante fator para a aderência em superfícies plásticas como CVC. Porém a sua presença nem sempre implica em formação de biofilme. Este estudo confirma a importância do operon ica na formação do biofilme e nas infecções relacionadas a cateter, uma vez que a maioria das amostras produtoras de biofilme isoladas de CVC carreavam tal gene. / Although Staphylococcus epidermidis is essentially a colonizer of skin and mucous membranes, it has become an important opportunistic pathogen among other coagulasenegative staphylococci, and it is responsible for nosocomial infections associated to indwelling medical devices. The most important factor in the pathogenesis of staphylococcal device-related infections is the pathogen ability to produce a biofilm, and it has been demonstrated that ica, aap and atle genes are important to its production. The present study compares different detection methods of biofilm formation in isolates of S. epidermidis from central venous catheter (CVC). Two phenotypic methods were performed: the microtiter plate test, considered a golden standard, and Congo red agar test. Through a genotypic method, using the PCR technique, it was verified the presence of icaA, icaD, aap and atlE genes. Using the microtiter plate assay, biofilm formation was observed in 107 of 166 analyzed samples (64%, including 17 strong, 23 moderate and 67 weak producers) while the Congo Red agar (CRA) plate assay reveled 90 (54%) biofilm producers. The presence of icaA and icaD genes was verified in 104 of the 107 biofilm producers samples identified through the microtiter assay (97%), while 77% presented aap gene and 92% presented atlE gene. Compared to other genes, icaA and icaD presented the higher sensibility (97%) and were considered the most reliable markers for molecular identification of biofilm producers. The absence of icaA and icaD genes in three biofilm-producing isolates identified through the microtiter assay (the “ica-independent”) suggests the existence of an alternative mechanism for biofilm formation, such as the Aap protein, that can be a functionally substitute for PIA as an intercellular adhesin. The high occurrence of atlE gene among the isolates in this study may be due to AtlE protein being an important factor for adherence to plastic surfaces, such as CVC, but the presence of this gene does not always results in biofilm formation. The present study corroborate the importance of ica operon in biofilm formation and in catheter-related infections, since most of the biofilm-producing sample isolates from CVC presented these genes.