Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Paulo César Gomes / Banca: Claudia Vianna Maurer Morelli / Banca: Valeria Valente / Resumo: A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica e oportunista, causada pelas leveduras capsuladas das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, afetando tanto pacientes imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Uma propriedade importante do gênero Cryptococcus é a capacidade de formação de biofilmes. A resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos traz a necessidade da busca de novas terapias. Desta forma, o nosso grupo vem trabalhando com moléculas antifúngicas derivadas de fontes naturais, como as chalconas, onde foi verificado que C. neoformans é sensível a algumas destas moléculas. Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a 3'- chalcona como antifúngico contra C. gattii em situação planctônica e biofilme, como também a eficiência e toxicidade em modelos animais alternativos como Danio rerio (Zebrafish) e Galleria mellonella, propondo uma nova alternativa para o tratamento. In vitro, os resultados para a forma planctônica do fungo mostraram que a 3'- chalcona foi mais eficaz para a cepa 118, com concentração inibitória mínima (CIM) de 0,96 µg/mL e para a cepa 56990 de C. gattii, a molécula mostrou ação potente com CIM entre 1,95 e 3,90 µg/mL. No ensaio de formação do biofilme com as duas cepas, observou-se uma atividade metabólica crescente até 72 horas e uma biomassa e matriz extracelular que alcançou seu máximo nas 48 horas. Em seguida, foi feita a avaliação da atividade da 3'- chalcona contra a formação do biofilme maduro após 48 horas, apresenta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Criptococose is a fungal, systemic and opportunistic infection mainly caused by capsulated yeast of the species Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, affecting immunocompetent and immunocompromised patients. An important property of the genus Cryptococcus is the biofilm formation, which can be considered a virulence factor and resistance. The resistance of biofilms to antifungal agents brings the need to search new therapies. Thus, our group has been working with antifungal molecules derived from natural sources such as chalcones, where it was found that C. neoformans is sensitive to some of these molecules. For this fact, the objective of this study was to test the 3'- chalcone as antifungal against C. gattii in planktonic and biofilm forms, as well as efficiency and toxicity in alternative animal models like Danio rerio (Zebrafish) and Galleria mellonella, proposing a new alternative for treatment. In vitro, the results for the planktonic form of the fungus showed that the 3'- chalcone was more effective for the 118 strain, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.96 µg/mL. For the strain 56990 of C. gattii the molecule showed potent activity with MIC values between 1.95 and 3.90 µg/mL. Biofilm formation assay for both strains had an increased metabolic activity within 72 hours and a biomass and extracellular matrix which reached its maximum in 48 hours. Then, the evaluation of the activity of the 3'-chalcone against the formation of mature biofilm was made after 48 hours, showing inhibition at a concentration of 62.5 µg/mL for ATCC strain and 31.2 µg/mL against the isolated 118. Also, the growth of biofilm against to amphotericin B (AmB) was evaluated, obtained as a result of inhibition at all concentrations for the two strains and against fluconazole were resistant. In vivo, the results of toxicity in zebrafish embryos revealed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Graziella Nuernberg Back Brito / Banca: Adolfo José da Mota / Banca: Ricardo Sérgio Couto de Almeida / Banca: Renata Falchete do Prado / Banca: Samira Esteves Afonso Camargo / Resumo: Candida albicans é um fungo oportunista capaz de causar infecções superficiais e até sistêmicas. A maioria das infecções é mediada pela formação de biofilme que confere resistência aos agentes antifúngicos e ao sistema imune, porém os mecanismos de desenvolvimento do biofilme e patogenicidade ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo foram selecionados 9 genes de C. albicans com função desconhecida, dentre 34 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilme. Os biofilmes foram formados em placas de 96 poços ou discos de poliestireno e avaliados em diferentes tempos de desenvolvimento. A seguir foram construídas 4 cepas complementadas que foram avaliadas quanto à susceptibilidade a agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes e testes de filamentação. A arquitetura dos biofilmes foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os biofilmes também foram avaliados quanto à quantidade de β-1,3-glucana e quitina. Para os modelos de infecção, células epiteliais bucais (TR-146) foram utilizadas para análise de aderência, invasão e dano. A patogenicidade das cepas foi avaliada em ovos embrionados de galinha durante 7 dias, após a inoculação das cepas. Células planctônicas e biofilmes foram submetidos a testes antifúngicos com os agentes fluconazol, anfotericina B e caspofungina. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada para verificar a expressão dos genes MRV8 e NDT80 em células fúngicas em interação com células epiteliais e MRV8, MRV1 e MRV6 em células crescidas em biofilme. Os resultados foram analisados por teste t de Student, ANOVA, Tukey e testes de Log-rank (Mantel-Cox) (p < 0,05). Foram construídas 4 cepas complementadas para os genes selecionados ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847 e MRV8. A função de ORF19.823 ainda permanece desconhecida, pois nãofoi observado fenótipo msignificativo para a cepa.... / Abstract: Candida albicans is an opportunistic fungi capable of causing superficial and systemic infections. Most of infections are mediated by biofilm formation which confers resistance to antifungal agents and immune system, but the mechanisms of biofilm development and pathogenicity were not thoroughly elucidated yet. In the presente study, 9 unknown function genes of C. albicans were selected among 34 mutant strains that presented altered phenotype for biofilm formation. The biofilms were formed on 96-well microtitle plates or on polystyrene disks and evaluated in different time intervals. Next, 4 complemented strains were constructed and evaluated for susceptibility to stressor agents, growth under nutrient limitation and filamentation tests. The biofilm architecture was analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The biofilms were also assessed as the quantity of β-1,3-glucan and chitin. For the infection models, buccal epithelial cells (TR-146) were used for adherence, invasion and damage assays. The pathogenicity of the strains was evaluated in embrionated chicken eggs for 7 days, after inoculation of the strains. Planktonic cells and biofilms were submitted to antifungal tests with fluconazole, amphotericin B, and caspofungin. Quantitative polymerase chain reaction was performed to verify the expression of MRV8 and NDT80 genes in fungal cells in interaction with epithelial cells and MRV8, MRV1, and MRV6 genes in cells grown in biofilm. The results were submitted to the Student t test, ANOVA, Tukey's test, and Log-rank test (Mantel-Cox) (p < 0.05). Four complemented strains were constructed for the selected genes ORF19.823, ORF19.7170, ORF19.6847, and MRV8. The function of the ORF19.823 is still unknown, because the mutant strain did not show any significative phenotype for the tests performed. The mutant strain for the ORF19.7170 caused less damage on epithelial cells, but the result was not significant and the gene was dispensable... / Doutor

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Coorientador: Ana Cláudia Pavarina / Banca: Livia Nordi Dovigo / Banca: Cristina Kurachi / Resumo: Nos últimos anos o aumento na incidência da candidose superficial ou invasiva causada por espécies emergentes e resistentes aos medicamentos tem sido atribuído a disseminação do uso de antibióticos e/ou agentes imunossupressores. A candidose é considerada uma doença oportunista de alta incidência em pacientes que utilizam medicamentos imunossupressores após transplante de órgãos, antibióticos de amplo espectro, terapias antineoplásicas e nos que possuem imunossupressão relacionada à síndrome da imunodeficiência adquirida. A Terapia Fotodinâmica (Photodynamic Therapy ou PDT) utiliza a combinação de luz (visível) e um composto fotossensível. A maior aplicação da PDT ocorre no tratamento de câncer, entretanto, a técnica está difundindo-se para o tratamento de outras doenças como infecções microbianas. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da PDT mediada pela Curcumina, na ausência e na presença do surfactante brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), com uma fonte de luz do tipo LED, sobre suspensões planctônicas de isolados clínicos das espécies C. albicans e C. glabrata fluconazol-resistentes, bem como de cepas ATCC. Após a PDT, foram obtidas diluições seriadas de cada amostra e alíquotas foram plaqueadas para a contagem das células viáveis (ufc/mL). O metabolismo celular para todas as condições experimentais também foi avaliado por meio do ensaio de redução do 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulphophenyl]2H-tetrazolium-carboxanilida (XTT). Também foi avaliada a capacidade de adesão/formação de biofilme dessas cepas após a PDT. Para isso, amostras obtidas da fase de adesão e da fase madura dos biofilmes foram monitoradas pela contagem de células viáveis (ufc/mL). Os resultados permitem observar que a utilização da PDT com curcumina em micelas de CTAB em suspensões planctônicas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In recent years the increase in the incidence of superficial or invasive candidiasis caused by species emerging drug-resistant and has been attributed to widespread use of antibiotics and/or immunosuppressive agents. Candidiasis is considered an opportunistic disease of high incidence in patients taking immunosuppressive drugs after organ transplantation, broad-spectrum antibiotics, anticancer therapies and who has immunosuppression related to acquired immunedeficiency syndrome. Photodynamic Therapy (PDT) uses a combination of (visible) light and a photosensitive compound. The largest application of PDT occurs in the treatment of cancer, however, the technique is diffusing in the treatment of other diseases such microbial infections. The aim of this study was to evaluate the effect of PDT mediated by Curcumin, in the absence and presence of surfactant cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) with a light source type LED on planktonic suspensions of clinical isolates of the species C. albicans and C. glabrata Fluconazole-resistant strains as well as strains ATCC. After PDT, serial dilutions were collected and aliquots of each sample were plated for viable cell count (cfu/ml). Cellular metabolism for all experimental conditions was also assessed by reduction assay of 2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulphophenyl]-2H-tetrazolium carboxanilide (XTT). It was also evaluated the ability of adhesion/biofilm formation of these strains after PDT. For this, samples of the accession and the mature phase biofilms were monitored by viable cell count (cfu/mL). The results allow to observe that the use of PDT with curcumin in CTAB micelles in planktonic suspensions was able to decrease metabolism (XTT) strains of C. albicans and C. glabrata susceptible and resistant to fluconazole, however, the reduction in viable cell count... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Banca: Ary Fernandes Junior / Banca: Maria Cecília de Arruda / Resumo: Os alimentos minimamente processados surgiram como uma interessante alternativa para o consumidor que procura por produtos de boa qualidade, saudáveis e de fácil preparo e consumo. No entanto, micro-organismos patogênicos podem estar presentes desde a produção ou serem introduzidos através de equipamentos e utensílios mal higienizados ou pela manipulação inadequada. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi a avaliação microbiológica de hortaliças, legumes e frutas minimamente processados, em relação aos parâmetros microbiológicos descritos na legislação brasileira, que permite até 102/g de coliformes termotolerantes para hortaliças e até 5 x 102/g, para frutas, na ausência de Salmonella em 25 gramas do produto. Entretanto, a legislação não contempla a pesquisa de Staphylococcus aureus, bactéria potencialmente produtora de enterotoxinas, cujo habitat é a mucosa nasal e que pode ser transmitida aos alimentos pela intensa manipulação. Dentro do mesmo gênero, existem as espécies de estafilococos coagulase negativa (ECN), que apresentam grande potencial patogênico, por possuírem os mesmos genes para a produção de enterotoxinas, encontrados em S. aureus. Assim, o trabalho também objetivou o isolamento dessas bactérias, a pesquisa dos genes que codificam a produção de enterotoxinas clássicas e biofilme e, a partir da presença dos genes, foi pesquisada a produção in vitro desses fatores. A produção de biofilme foi verificada em plástico, aço inoxidável e vidro. Foram analisadas 200 amostras, e nenhuma apresentou contaminação por Salmonella, mas 157 (78,5%) estavam fora dos limites aceitáveis em relação à quantidade de coliformes termotolerantes. Em relação aos estafilococos, 50 amostras (25%) apresentaram contaminação por ECN e 7 (3,5%), por estafilococos coagulase... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Minimally processed foods emerged as an interesting alternative for the consumer that seeks for products with good quality, which are healthy, easy to prepare and to consume. Nevertheless, pathogenic microorganisms may be present in these products since production, or may be introduced by badly sanitized equipment and utensils, or by improper manipulation. Therefore, the objective of this work was the microbiological evaluation of minimally processed vegetables and fruits, regarding the microbiological parameters described in the Brazilian law, which allows for up to 10² thermotolerant coliforms in vegetables and up to 5 x 10² in fruits, in the absence of Salmonella in 25 grams of the product. However, the law does not consider the research of Staphylococcus aureus, bacteria that is a potential producer of enterotoxins, whose habitat is the nasal mucosa and that may be transmitted to food by the intense manipulation they are subjected. In the same genus, there are the coagulase-negative staphylococci species (CoNS), which presents huge pathogenic potential, for having the same genes for enterotoxin production found on S. aureus. Thus, this work also aims the isolation of these bacteria, the research of genes that codify for the production of classical enterotoxins and biofilm and, as from the presence of these genes, the research of the production in vitro of enterotoxins and biofilm. The biofilm production was tested on plastic, stainless steel and glass, which are the most used materials in equipments and utensils. 200 samples were analyzed, and none presented contamination by Salmonella, although 157 (78.5%) were outside the acceptable limits regarding the quantity of thermotolerant coliforms. From these 200 samples of minimally processed products, 50 (25%) presented coagulase-negative staphylococci (CoNS) and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Oswaldo Durival Rossi Junior / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Poliana de Castro Melo / Resumo: Staphylococcus aureus é o microrganismo que mais prevalece em casos de mastite em rebanhos bovinos leiteiros e isto ocorre devido a produção de vários fatores de virulência, inclusive aqueles relacionados a sua capacidade de se instalar no parênquima mamário. Sendo assim, as condições microbiológicas do leite cru que é fornecido às indústrias pode refletir no seu produto final, determinando riscos à saúde do consumidor. Diante do exposto, objetivou-se realizar o isolamento e identificação das estirpes de S. aureus de amostras de leite bubalino da raça Murrah, dos insufladores, água das mangueiras da sala de ordenha e mãos dos ordenhadores em uma propriedade rural em Analândia - SP nos meses de abril, junho, outubro e novembro. Foi avaliada, a capacidade produtora de biofilme "in vitro" pelo método de aderência em microplacas e pelo cultivo em Agar Vermelho Congo (CRA), o perfil de sensibilidade dos S. aureus frente a antimicrobianos pelo método da difusão em disco além de identificar os genes que participam na formação de biofilme por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Das 147 estirpes de Staphylococcus spp isoladas, 32 foram identificadas como S. aureus. Dos isolados, 28,1% foram positivas para o gene icaA, 21,8% para o gene icaD, 28,1% para clfA, 50% clfB, 53,1% sarA e 50% para o gene hla. Todas os isolados demonstraram habilidade de produção de slime em Agar Vermelho Congo (CRA) e formação de biofilme em microplaca. Embora a frequência de isolamento de S. aureus foi baixa, essas estirpes podem ser consideradas potenciais patógenos zoonóticos / Abstract: Staphylococcus aureus is the most common cause of mastitis in dairy herds due to its production of several virulence factors, including those related to its ability to colonize the teat parenchyma. The microbiological status of raw milk supplied to manufacturers may reflect on the final product and the associated risks to consumer health. Accordingly, the aim of this study was to isolate and characterize S. aureus strains from samples of Murrah buffalo milk, milking machines, water hoses from milking room and from the hands of milkers on a dairy farm located in Analândia - SP during the months of April, July, October, and November. Biofilm-producing capacity was evaluated "in vitro" using a microtiter method and cultivation on Congo Red Agar (CRA). Antibiotic sensitivity testing was performed by the disk diffusion method and the identification of the genes involved in biofilm formation by Polymerase Chain Reaction (PCR). One hundred and forty-seven Staphylococcus spp. were isolated and 32 were identified as S. aureus. Of those isolates, 28.1% were positive for the icaA gene, 21.8% for the icaD gene, 28.1% for the clfA, 50.0% for the clfB, 53.1% for sarA and 50.0% for hla. All isolates produced slime on Congo Red Agar (CRA) and formed biofilms in a microtiter assay. Although the frequency of S. aureus was low, the stains isolated can be considered as potential zoonotic agents / Mestre

Orientadora: Debora de Barros Barbosa / Coorientador: Douglas Roberto Monteiro / Banca: Alessandra Marçal Agostinho / Banca: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da molécula de quorum sensing farnesol na formação de biofilmes simples e misto de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175. Inicialmente o farnesol foi diluído em metanol e posteriormente em saliva artificial (SA). Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) do farnesol contra as células de Candida albicans ATCC 10231 e Streptococcus mutans ATCC 25175 em suspensão foram baseados no método da microdiluição. O farnesol diluído nas concentrações de 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 70, 150 e 300 mM foi aplicado sobre os biofilmes de Candida albicans e Streptococcus mutans (formação) e após 48 horas de contato sua atividade antibiofilme foi determinada por meio da quantificação da biomassa total (coloração com violeta cristal (CV)), enumeração das unidades formadoras de colônias (UFCs) e atividade metabólica (XTT). Foi ainda realizada uma curva de tempo de morte celular para os dois microrganismos estudados. Após o tratamento com o farnesol, a matriz dos biofilmes foi extraída e analisada em termos de concentração de proteínas e carboidratos, além do teste de pH para S. mutans e verificação das atividades enzimáticas de proteinase, fosfolipase e hemolítica para Candida albicans, ainda a estrutura dos biofilmes foi analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura. Os resultados de CIM foram de 150 mM para C. albicans e de 6.25 mM para S. mutans. O farnesol diminuiu a formação de biofilmes simples e mistos, com reduções significativas de 37-90% e 64-96%, respectivamente para a biomassa total e atividade metabólica. Para os biofilmes simples, concentrações de farnesol iguais ou maiores que 3,125 mM promoveram reduções significativas (1,3-4,2 log10; p < 0,05) nas UFCs, enquanto que para os biofilmes mistos reduções... / Abstract: The aim of this study was to evaluate the activity of a quorum sensing molecule, farnesol, in biofilm formation of Candida albicans ATCC 10231 and Streptococcus mutans ATCC 25175. Initially farnesol was diluted in methanol and then in artificial saliva (AS). Minimum inhibitory concentration tests (MIC) of farnesol against Candida albicans ATCC 10231 cells and Streptococcus mutans ATCC 25175 suspension were based on the microdilution method. Farnesol was prepared at concentrations of 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 70, 150 and 300 mM, and placed in contact with biofilms in formation of Candida albicans and Streptococcus mutans for 48 hours. Its antibiofilm activity was determined by quantifying the total biomass (stained with crystal violet (CV)), enumeration of colony forming units (CFUs) and metabolic activity (XTT). It was further carried out a cell death time curve for both microorganisms studied. After the treatment with farnesol, the matrix of the biofilm was extracted and analyzed in terms of protein and carbohydrates, in addition to the pH test for S. mutans and examination of enzymatic activities of proteinase, fosfolipase and hemolytic for Candida albicans. The structure of biofilms was analyzed by scanning electron microscopy. The MIC values were 150 mM for C. albicans and 6.25 mM for S. mutans. Farnesol decreased the formation of single and mixed biofilms, with significant reductions of 37-90% and 64-96% respectively for the total biomass and metabolic activity. For single biofilms, farnesol concentrations equal to or higher than 3.125 mM promoted significant reductions (1,3-4,2log10; p <0.05) in the CFU for single biofilms, while in mixed biofilms the reductions (0,67-5,32log10; p <0.05) were noted at concentrations of 1.56 mM. For cell death curve after an hour in contact with those microorganisms, farnesol reduced 1 log10... / Mestre

Orientador: Marcelo Coelho Goiato / Co-orientador: Daniela Micheline dos Santos / Banca: Eduardo Piza Pellizzer / Banca: Humberto Gennari Filho / Banca: Simone Cecílio Hallak Regalo / Banca: Célia Regina Moreira Lanza / Resumo: As próteses oculares são responsáveis pela recuperação da estética e auto-estima do usuário. Assim, os materiais utilizados na confecção de prótese ocular devem possuir propriedades específicas para sua indicação e durabilidade principalmente aos procedimentos de desinfecção pelo paciente. Desse modo, este estudo teve como objetivo verificar a efetividade de diferentes soluções desinfetantes na remoção de biofilme de duas espécies de Staphylococcus spp., desenvolvidas na superfície de resina acrílica específica para prótese ocular e avaliar a alteração de cor de botões de íris artificiais confeccionadas por diferentes técnicas antes e após a polimerização e quando influenciadas pela desinfecção química. Para o teste de microbiologia, 396 amostras em resina acrílica para prótese ocular N1 foram confeccionadas (1,0 cm em diâmetro e 0,3 cm em espessura), sendo metade dessas amostras para formação de biofilme de S. epidermidis e a outra metade para formação de biofilme de S. aureus, ambos na superfície da amostra. Para cada cepa bacterina, 66 amostras foram submetidas a formação de biofilme em sua superfície durante três diferentes tempos: inicial (24h), intermediário (48h) e maduro (72h). Em seguida as amostras foram distribuídas aleatoriamente (unidade amostral n=6) para um dos tratamentos desinfetantes: água destilada durante 10, 15, 30 min e 6 h (controle-CTL); sabão neutro (NES) durante 30 min; Opti-Free durante 30 min e 6 h; Efferdent (EFF) durante 15 min; e gluconato de clorexidina (0,5%; 2% e 4%) (CHX) durante 10 min. Após o tratamento desinfetante, as amostras acrílicas foram imediatamente agitadas para desprendimento do biofilme. A contagem de colônias foi verificada por análise do número de UFC/mL. Para a análise de alteração de cor 300 amostras simulando próteses oculares foram confeccionadas, sendo metade... / Abstract: Considering that ocular prostheses restore esthetics and patient's self-esteem, the materials used for prosthesis fabrication should present appropriate properties regarding indication and reliability after the disinfection procedures. So, the aim of this study was to assess the effectiveness of different disinfectant solutions against two species of Staphylococcus spp. cultured on ocular prosthesis acrylic resin. In addition, the chromatic change of artificial iris buttons fabricated with different techniques was also evaluated before and after polymerization and disinfection. For the microbiology tests 396 acrylic specimens were fabricated (1.0 cm in diameter and 0.3 cm in thickness). Half of the samples were made for biofilm formation of S. epidermidis and half were made for biofilm formation of S. aureus, both on the sample surface. For each strain, 66 samples were underwent to biofilm formation on the liner surface for three different points: initial (24h), intermediate (48h) and mature (72h). Afterwards the specimens were randomly assigned (unit sample n = 6) to one of disinfectant treatments: distilled water for 10, 15, 30 min and 6 h (control-CTL); treated with neutral soap (NES) for 30 min; treated with Opti-Free (OPT) for 30 min and 6 h; treated with Efferdent (EFF) for 15 min; and treated with (0.5%, 2% and 4%) chlorhexidine gluconate (CHX) for 10 min. After the treatments, the specimens were vortexed to disrupt the biofilm, and residual cells were counted (cell/mL). For the color meansurations a total of 300 samples simulating ocular prosthesis were fabricated. Half of the samples were made with blue artificial irises, and half were made with brown artificial irises. For each color, 50 samples were fabricated according to one of the following techniques: PE - conventional technique, CA - prefabricated... / Doutor

Orientador: Josias Rodrigues / Resumo: Desequilíbrio na composição de espécies bacterianas (disbiose) do intestino é uma característica da doença de Crohn (DC), a mais grave das doenças inflamatórias intestinais (DII). Na disbiose da DII, há um aumento de certos grupos de bactérias, tais como as Proteobacteria, em alguns pacientes. Acredita-se que o aumento destas bactérias deve contribuir para as reações inflamatórias responsáveis pelas lesões observadas no intestino de portadores de DC e retocolite ulcerativa, ao estimular a produção de citocinas por células locais do sistema imune. Proteobacteria, um dos filos predominantes da microbiota intestinal compreende bacilos gram-negativos, dos quais Escherichia coli (E. coli) é o mais conhecido. Dada a importância de Proteobacteria como patógeno ou membro da microbiota intestinal residente humana, este trabalho teve dois objetivos: 1) Investigar a ocorrência de variação numérica na população de Proteobacteria na DC e 2) Caracterizar amostras de E. coli encontradas nesta população, em relação a propriedades de virulência. Visando o primeiro objetivo, DNA de culturas em caldo MacConkey de diferentes materiais clínicos (fezes e biópsias intestinais) de 8 controles e 9 pacientes com DC foram amplificados com primers para as regiões V6-V8 do gene que codifica a fração 16S do rRNA (16S V6-V8 rDNA) e, em seguida, sequências específicas (representando táxons bacterianos particulares) contidas nos amplicons foram separadas por temperature gradient gel electrophores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Imbalance in intestinal bacterial composition (dysbiosis) is a hallmark of Crohn’s disease (CD), the most severe of inflammatory bowel diseases (IBD). A characteristic of IBD dysbiosis is the elevation of certain groups of bacteria such as Proteobacteria in some patients. It is believed that the augmented bacteria may contribute for the inflammatory reactions underlying the typical lesions observed in the gut of CD and ulcerative colitis patients, by stimulating the production of cytokines by local cells of the immune system. Proteobacteria, one the most prevalent bacterial phyla of the gut microbiota are Gram negative rods of which Escherichia coli (E. coli) is the most well-known member. Given the significance of Proteobacteria as pathogens or member of resident gut microbiota, this work had two purposes: 1) to investigate the occurrence of numerical variation in the population of these bacteria in CD and 2) Characterizing E. coli isolates found in this population, in search for some virulence associated properties. For the first purpose, DNA from MacConkey broth cultures of distinct clinical materials (stools and gut mucosal biopsies) of 9 CD and 8 control patients were amplified with primers for the V6 and V8 regions of the 16S ribosomal RNA gene (16S V6-V8 rDNA) and distinct gene sequences (representing particular bacterial taxa) within the amplicons were resolved by temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), defining band profiles, which reflect the bact... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Samira Esteves Afonso Camargo / Co-orientador: Luciane Dias de Oliveira / Banca: Graziella Nuernberg Back Brito / Banca: Paula Elaine Cardoso / Resumo: Este estudo se propôs a avaliar a atividade antimicrobiana do princípio ativo Timol e de um enxaguatório bucal (LISTERINE® ZEROTM) sobre Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans e também sua citotoxicidade e genotoxicidade em culturas de macrófagos (RAW 264.7). Após determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Microbicida Mínima (CMM) pelo método de microdiluição em caldo do extrato foi avaliada a ação antimicrobiana do Timol e do LISTERINE® ZEROTM em biofilme. A citotoxicidade do Timol e do LISTERINE® ZEROTM foi avaliada sobre as células pelo método MTT e também pela quantificação de TNF-α pelo método imunoenzimático ELISA. Ainda, a genotoxicidade foi determinada pela formação de micronúcleos nas células após 24 h de exposição ao Timol e 1min ao LISTERINE® ZEROTM e ao etilmetano sulfanato (controle positivo). Os dados foram avaliados pelos testes estatísticos ANOVA e complementado pelo teste de Tukey e Kruskal Wallis (nível de significância de 5%). Obtivemos resultados favoráveis quanto a ação antimicrobiana do princípio ativo para os micro-organismos testados sendo a CMM de 160 μg mL-1 eficaz para S. mutans e S. aureus e de 80 μg mL-1 para C. albicans, para LISTERINE® ZEROTM foi eficaz na concentração de 0, 3125 μg mL-1, em biofilme apresentou média de 1,85 ± 0,14 para Timol em S. mutans, 1,90 ± 0,07 para S. aureus e 6,66 ± 0,17 para C. albicans. A citotoxicidade do Timol foi observada acima de 5 μg mL-1, e o LISTERINE® ZEROTM foi tóxico para as células; quanto a genotoxicidade não foi observado dano ao nível de DNA. Desta forma concluímos que o princípio ativo Timol, possui ação antimicrobiana em concentrações mais elevadas, no entanto que nestas concentrações possui alta toxicidade celular, e o LISTERINE® ZEROTM possui ação antimicrobiana na menor concentração testada e é citotóxico / Abstract: This study aimed to evaluate the antimicrobial activity of the active ingredient thymol and a mouthwash (LISTERINE® ZEROTM) on Candida albicans, Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans and also their cytotoxicity and genotoxicity in macrophage cultures (RAW 264.7). After determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum Concentration Microbicide (CMM) by microdilution broth method extract was evaluated the antimicrobial action of thymol and LISTERINE® ZEROTM n biofilm. The cytotoxicity of thymol and LISTERINE® ZEROTM on the cells was evaluated by MTT method and also by quantifying TNF-α by ELISA immunoenzymatic method. Further, genotoxicity is determined by the formation of micronuclei in cells after 24 h of exposure to thymol and the LISTERINE® ZEROTM 1min and ethylmethane sulfonate (positive control). Data were analyzed by ANOVA and Tukey complemented by test and Kruskal Wallis (5% significance level). We obtained favorable results regarding the antimicrobial action of the active ingredient for the microorganisms tested with the CMM 160 mg L-1 effective for S. mutans and S. aureus and 80 mg L-1 for C. albicans to LISTERINE® ZEROTM was effective at levels of 0, 3125 mg L-1, biofilm had a mean of 1.85 ± 0.14 for thymol in S. mutans, 1.90 ± 0.07 to 6.66 ± S. aureus and 0, 17 for C. albicans. The cytotoxicity of thymol was observed above 5 mg L-1, and LISTERINE® ZEROTM was toxic to cells; as genotoxic damage was not observed at the level of DNA. Thus we conclude that the active ingredient thymol, has antimicrobial action in higher concentrations, however that these concentrations has high cellular toxicity, and the LISTERINE® ZEROTM has antimicrobial action in the smallest concentration tested and is cytotoxic / Mestre

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / The reactive oxygen species (ROS) are generated during normal cellular metabolism and can produce several oxidative damage in the DNA, such as lesion nitrogen bases or apurinic/apirimidinic (AP) sites. These lesions may lead to the accumulation of mutations site, if such damages are not repaired. However, the bacteria have several mechanisms of protection against the ROS which play an important role in the maintenance of physiology. The objective of this study was to assess whether enzymatic systems, such as base excision repair (BER), SoxRS and SOS systems are capable to interfere with bacterial response to environmental signals such as susceptibility to antibiotics, and microbial adherence to biotic (HEp-2 cells) and abiotic surfaces (biofilm formation). The mutant strains used in this study were derivatives of Escherichia coli K-12. It was observed that the sole mutant presenting differences in antimicrobial susceptibility in relation to the parental wild type strain (AB1157) was BW9091 (xthA- -deficient in exonuclease III). Nevertheless, 11 strains with deficiency in different protective mechanisms to oxidative stress, presented differences in adherence patterns to HEp-2 cells, demonstrating an aggregative-like adherence in relation to the parental strain AB1157 (without a typical adherence pattern). Presence of mannose (a carbohydrate capable to block type I-mediated fimbriae adherence) was capable to interfere with both quantitative adherence and filamentation of bacterial cells. Filamentation is an important SOS response observed in genome repair during bacterial cell division. Furthermore, with respect to the formation of biofilms, 8 strains showed a strong biofilm formation where this response was not accompanied by increased in intensity of filamentation. Our results suggest the involvement of oxidative stress in the definition of parameters such as sensitivity to antimicrobials, pattern and intensity of adhesion, and filamentous formation of biofilms in the samples of E. coli K-12 assessed in this study. We suggest that adherence generates oxidative stress causing damage to the DNA, which leads to induction of the SOS system resulting in the filamentation. / As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vários danos oxidativos no DNA, tais como lesões nas bases nitrogenadas ou sítios apurínico/apirimidínico (AP). Essas lesões podem acarretar acúmulo de sítios de mutações, caso esses danos não sejam reparados. Entretanto, as bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimáticos, como o reparo por excisão de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibióticos, aderência das células bacterianas a superfícies bióticas ou abióticas e formação de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo são todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o único que apresentou diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relação à cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderência qualitativo realizado com linhagem de células HEp-2 (originária de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleção, apresentaram um padrão denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderência discreta sem padrão típico. A aderência manose-sensível via fímbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderência e filamentação nessas cepas estudas. A filamentação é uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas células filhas. Além disso, com relação à formação de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta não foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentação. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definição de parâmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padrão e intensidade de aderência, filamentação e formação de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderência gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a indução do sistema SOS resultando na resposta de filamentação observada.