Orientador : Jose Satiro de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-16T18:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Villafane_HugoHumbertoMontoya_M.pdf: 1327208 bytes, checksum: 47d688614cafb834501e55b0e532f370 (MD5) Previous issue date: 1975 / Resumo: A refrigeração e a forma universalmente aceita para controlar o crescimento dos microrganismos no leite e por isso, vem sendo cada vez mais adotada na fazenda, na indústria e no comércio para aumentar a conservação do leite e seus derivados. Em consequincia disto, o grupo de microrganismos capaz de se multiplicar sob refrigeração a temperaturas entre 0 a 10ºC,vem recebendo crescente atenção dos pesquisadores. Este grupo é", atualmente, denominado microrganismos psicrotroficos. Tendo em vista que o método padrão para contagem de psicrotroficos recomenda incubação a 79C por 10 dias, sendo, portanto, um método de pouca utilidade prática, este trabalho foi realizado a fim de estudar a aplicação de um método rápido desenvolvido recentemente. E para isto foram utilizadas amostras de leite cru e pasteurizado, coletadas na região de Campinas, SP. Os resultados demonstraram que o novo método rápido, que utiliza incubação a 21ºC por apenas 25 hr, funciona muito bem tanto para leite cru como pasteurizado, seja qual for o número de psicrotroficos existentes na amostra. Os resultados indicaram também que os microrganismos psicrotroficos são de considerável importância, apesar do em prego da refrigeração ainda não ser tão generalizado entre os produtores e laticínios brasileiros / Abstract: Refrigeration is universally accepted for controlling microbial growth in milk and because of this, it has been increasingly used on the farm, in the dairy plant and during marketing to prolong the storage life of milk and dairy products. Consequently, the group of microorganisms which is able to grow at temperatures between 0 and 109C has received increasing attention from microbiologists. This group of microorganisms is referred to as psychrotrophs. The standard method for enumerating psychrotrophs recommends an incubation at 79C for 10 days, which makes this method of very little practical use because of the time consumed. Therefore this work was undertaken to study the applicability of a rapide method developed recently. For this raw and pasteurized milk samples collected in the area of Campinas - SP, were used. The results demonstrated that the new rapid method, which uses an incubation at 21ºC for just 25 hr, is very reliable for enumerating in either raw or pasteurized milk samples. The results also indicated that the psychrotrophic microorganisms are of considerable importance in Brazil, even though the use of refrigeration is not generalized among the milk producers and dairy industries / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-28Bitstream added on 2014-06-13T20:26:20Z : No. of bitstreams: 1 elias_ao_dr_botfmvz.pdf: 234069 bytes, checksum: 9f58b2c5772696e2b614157eac0079ac (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Mastitis is the most common infectious disease affecting dairy cattle and remains the most economically important disease of dairy industries around the world. Streptococcus agalactiae is a contagious pathogen that can only survives in the mammary gland, often associated to subclinical mastitis and is highly infectious. The bacteria can cause an increase of bulk tank bacterial counts (BTBC) and somatic cell counts (BTSCC). The microbiological characterization of S.agalactiae in bulk tank samples is an auxiliary method to control contagious mastitis. Therefore there are some limitations with time consuming cultures or identification methods and additional concerns about the conservation and transport of samples. Molecular identification, based on polymerase chain reactions (PCR) can identify the pathogen even when it is not viable for culturing. Bulk tank samples of 247 dairy farms were cultured in 10% bovine blood agar, followed by BTBC and S.agalactiae isolation and biochemical characterization. This gold standard method was then compared to molecular identification. The DNA extraction was taken by cell lyses with proteinase K and a phenol/chloroform protocol. The selected specie specific primers of 16S rRNA genes were used to identify S.agalactiae. Mean values of BTBC were 1,08 x 106 UFC/mL and the bacteria was identified by microbiological methods in 98 (39,6%) and by PCR in 110 (44,5%) of the samples. The results showed a sensibility of 0,8571 l 0,0353 (CI95%=0,7719 - 0,9196) and specificity of 0,8255 l 0,0311 (CI95%=0,7549 - 0,8827). The lack of significant differences of both the microbiological and molecular results (k=0,6686 l 0,0477 and CI95% = 0,5752 - 0,7620) indicated substantial agreement with the methods. This suggests that PCR of bulk tank samples can be used to detect contagious mastitis caused by S.agalactiae.

Orientador: Hélio Langoni / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Banca: Paulo Eduardo Brondai / Banca: Aristeu Vieira da Silva / Banca: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Abstract: Mastitis is the most common infectious disease affecting dairy cattle and remains the most economically important disease of dairy industries around the world. Streptococcus agalactiae is a contagious pathogen that can only survives in the mammary gland, often associated to subclinical mastitis and is highly infectious. The bacteria can cause an increase of bulk tank bacterial counts (BTBC) and somatic cell counts (BTSCC). The microbiological characterization of S.agalactiae in bulk tank samples is an auxiliary method to control contagious mastitis. Therefore there are some limitations with time consuming cultures or identification methods and additional concerns about the conservation and transport of samples. Molecular identification, based on polymerase chain reactions (PCR) can identify the pathogen even when it is not viable for culturing. Bulk tank samples of 247 dairy farms were cultured in 10% bovine blood agar, followed by BTBC and S.agalactiae isolation and biochemical characterization. This gold standard method was then compared to molecular identification. The DNA extraction was taken by cell lyses with proteinase K and a phenol/chloroform protocol. The selected specie specific primers of 16S rRNA genes were used to identify S.agalactiae. Mean values of BTBC were 1,08 x 106 UFC/mL and the bacteria was identified by microbiological methods in 98 (39,6%) and by PCR in 110 (44,5%) of the samples. The results showed a sensibility of 0,8571 l 0,0353 (CI95%=0,7719 - 0,9196) and specificity of 0,8255 l 0,0311 (CI95%=0,7549 - 0,8827). The lack of significant differences of both the microbiological and molecular results (k=0,6686 l 0,0477 and CI95% = 0,5752 - 0,7620) indicated substantial agreement with the methods. This suggests that PCR of bulk tank samples can be used to detect contagious mastitis caused by S.agalactiae. / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-03-22T12:33:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 689463 bytes, checksum: 098829ca1f951d68d3ff291f28a4a066 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-22T12:33:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 689463 bytes, checksum: 098829ca1f951d68d3ff291f28a4a066 (MD5) Previous issue date: 2010-09-24 / Staphylococcus spp. tem sido frequentemente associado a surtos de origem alimentar, em virtude da capacidade de algumas espécies produzirem enterotoxinas, principalmente Staphylococcus aureus. A identificação laboratorial dessas espécies, bem como dos genes que codificam as enterotoxinas é um fator importante na elucidação de surtos de intoxicação estafilocócica. Dentre os alimentos envolvidos nessas intoxicações estão o leite e seus derivados, principalmente em decorrência da contaminação por patógenos causadores da mastite bovina, em especial Staphylococcus aureus. Assim, para avaliar o potencial toxigênico de isolados de leite, 264 estirpes de Staphylococcus spp., sendo 96 isolados de leite cru refrigerado e 168 isolados de leite de vacas com mastite foram usadas neste estudo. Dessas, 237 foram avaliadas também quanto às suas características morfológicas e à produção de hemolisina, 32 identificadas bioquimicamente por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux ® ) e 30 avaliadas quanto ao seu caráter de hidrofobicidade. Todas as estirpes foram analisadas pela técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a pesquisa do gene femA, específico de Staphylococcus aureus, para dez genes que codificam enterotoxinas estafilococicas (sea – sell) e para o gene tst-1 que codifica a Toxina da Síndrome do Choque Tóxico. A análise morfológica foi realizada em ágar Baird-Parker (BP) e observando-se os aspectos das colônias quanto à sua cor, ao tamanho, ao brilho e à formação de halo devido à produção de lecitinase. A produção de hemolisinas foi verificada em ágar sangue. A detecção de genes para exotoxinas, incluindo enterotoxinas e toxina da síndrome do choque tóxico foi realizada utilizando-se primers descritos na literatura, após extração do DNA bacteriano e sua quantificação em espectrofotômetro (GeneQuant Pro, Amersham Biosciences). A amplificação do DNA foi feita utilizando-se sete reações, sendo cinco com primers para dois genes (seg/femA, seh/sei, seb/sell, sea/sed e sec/see) e duas reações com primers para apenas um gene-alvo (selj e tst-1). As amplificações foram feitas em termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems). O cálculo de hidrofobicidade foi realizado pela medição do ângulo de contato entre a superfície bacteriana e três líquidos com diferentes polaridades, incluindo água, formamida e α-bromonaftaleno, sobre uma camada de células vegetativas usando-se o aparelho Goniômtero (Kruss, Germany) e pelo resultado da energia livre global de interação (∆G swsTOT ). A detecção do gene femA indicou que 14 e sete estirpes identificadas previamente como Staphylococcus Coagulase Negativa (SCN) e Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP), respectivamente, tratavam-se de S. aureus. Dentre os isolados avaliados morfologicamente em Agar Baird-Parker e identificados bioquímica e molecularmente como S. aureus, apenas 18,7% (38/203) apresentaram colônias típicas. Observou-se que 64,5% (153/237) produziram hemolisina. Quanto às análises realizadas por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux ® ), 15,6% (5/32) apresentaram identificação diferente daquela realizada por provas bioquímicas tradicionais. Dentre as 264 estirpes analisadas molecularmente, 2,27% eram portadoras do gene tst-1 e foram isoladas de leite de tanque refrigerado. Os genes que codificam a produção de enterotoxinas estafilocócicas, foram verificados em isolados de leite armazenados em tanque de refrigeração e leite de vacas com mastite, ressaltando-se a presença dos genes que codificam a produção das novas enterotoxinas (seg-sell) (96,3%). Todos os isolados (17 isolados de leite proveniente de tanque refrigerado e 13 de leite de vacas com mastite) foram considerados hidrofílicos, tanto em relação à analise quantitativa (∆G adesão > 0), quanto para a análise qualitativa (< 50o). A presença de genes codificadores das enterotoxinas estafilocócicas demonstra a possibilidade de intoxicações e ressalta a importância no controle da mastite bovina bem como no controle da qualidade do leite. / Staphylococcus spp. has been frequently associated with food-borne breakouts, due to the capacity some species have to produce enterotoxins, mainly Staphylococcus aureus. Laboratory identification of these species, as well as of the genes which codify the enterotoxins, is an important factor in elucidating staphylococcus intoxication breakouts. Milk and dairy products are among the foods involved in these intoxications, especially due to contamination by pathogens causing bovine mastitis, mainly Staphylococcus aureus. Thus, to evaluate the toxigenic potential of milk isolates, 264 strains of Staphylococcus spp. were used in this study, i.e., 96 isolates from refrigerated raw milk and 168 isolates from mastitis-infected cows’ milk. Out of these, 237 were also evaluated as to their morphological characteristics and hemolysine production, 32 were identified biochemically by means of the ID 32 Staph (bioMérieux ® ) system and 30 were evaluated as to their hydrophobicity character. All the strains were analyzed by the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique to research the gene femA, specific of Staphylococcus aureus, for ten genes that codify staphylococcal enterotoxins (sea – sell) and for the gene tst-1 that codifies the Toxic Shock Syndrome Toxin. Morphological analysis was carried out in Baird-Parker (BP) agar, and by observing the colonies’ aspect regarding color, size, shine and halo formation as a result of lecithinase production. Hemolysine production was verified in blood agar. Gene detection for the exotoxins, including enterotoxins and toxic shock syndrome toxin, was carried out using primers described in the literature, after extraction of the bacterial DNA and its quantification in spectrophotometer (GeneQuant Pro, Amersham Biosciences). DNA amplification was performed by using seven reactions, five with primers for two genes (seg/femA, seh/sei, seb/sell, sea/sed and sec/see) and two reactions with primers for only one target-gene (selj and tst-1). The amplifications were carried out in the GeneAmp ® PCR thermal cycler System 9700 (Applied Biosystems). Hydrophobicity was calculated by measuring the angle of contact between the bacterial surface and three liquids with different polarities, including water, phormamide and α-bromonafthalene, on a layer of vegetative cells, using the Goniometer apparatus (Kruss, Germany) and by the result of the global free interaction energy (∆G swsTOT ). Detection of the gene femA indicated that 14 and seven strains identified previously as Staphylococcus Coagulase Negative (SCN) and Staphylococcus Coagulase Positive (SCP), respectively, were identified as S. aureus. Among the isolates morphologically evaluated in Agar Baird-Parker and biochemically and molecularly identified as S. aureus, only 18.7% (38/203) presented typical colonies. It was verified that 64.5% (153/237) produced hemolysine. As for the analyses carried out by the ID 32 Staph (bioMérieux ® ) system, 15.6% (5/32) presented identification different from that using traditional biochemical tests. Among the 264 strains analyzed molecularly, 2.27% were carriers of gene tst-1 and were isolated from refrigerated tank milk. The genes that codify the production of staphylococcal enterotoxins were verified in milk isolates stored in refrigeration tanks and in milk from cows with mastitis, emphasizing the presence of genes that codify the production of the new enterotoxins (seg-sell) (96.3%). All isolates (17 isolates from refrigerated tank milk and 13 from mastitis- infected cows’ milk) were considered hydrophilic, both in relation to quantitative (∆G adhesion > 0), and qualitative (< 50o) analysis. The presence of the genes that codify the staphylococcal enterotoxins shows the likelihood of intoxications and emphasizes the importance of controlling bovine mastitis as well as milk quality.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-05Bitstream added on 2014-06-13T19:43:38Z : No. of bitstreams: 1 troncarelli_mz_dr_botfmvz.pdf: 4588450 bytes, checksum: a779f6cb9a1e51d0648806d5715dc5d8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Com o objetivo de normatizar a cadeia produtiva visando à melhoria da qualidade do leite no Brasil, o MAPA delineou a IN n° 51, em vigor desde julho de 2005. Em linha com estes parâmetros, objetivou-se, no presente estudo, padronizar o método de mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão, e avaliar esta técnica como possível recurso diagnóstico a ser empregado em programas de controle de qualidade do leite oferecido para consumo. Foram visitadas 20 propriedades leiteiras do Estado de São Paulo, com sistema de ordenha mecânica e tanque de expansão próprio, nas quais foram colhidas amostras de leite para a realização da mPCR, cultivo microbiológico, CCS e CBT. S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram isolados, em 30%; 10% e 40% das amostras de leite dos tanques de expansão, respectivamente, e detectados pela mPCR em 0; 10% e 35%, respectivamente. A mPCR apresentou acurácia de 78,3%; sensibilidade de 37,5% e especificidade de 93,2% e limiar de detecção de 100 picogramas. A CCS apresentou mediana de 395.000 células/mL, e 55% das amostras avaliadas resultou em valores de CBT satisfatórios para mesófilos. O índice de mastite subclínica nos rebanhos avaliados pelo CMT foi de 28,3%. Conclui-se que a mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foi padronizada com êxito no presente estudo, e pode ser indicada como método complementar aos utilizados na rotina diagnóstica de mastite bovina e qualidade do leite / Brazilian Ministry of Agriculture and Supply, objecting the improvement of milk quality in Brazil, published the Normative Instruction n. 51, a technical group of rules for milk business that has been attended since July 2005. In line with these parameters, the aim of the present study was to standardize the mPCR test for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection in bovine milk samples obtained from bulk tanks, in order to evaluate this method as a possible tool to be used in milk quality control programs. Twenty milk farms with milking machine system and individual bulk tank, of different regions of Sao Paulo state were sampled. Bulk milk samples were collected for mPCR, microbiological culture, Somatic Cell Count and Total Bacterial Count. S. aureus, S. agalactiae e E. coli were isolated in 30%; 10% and 40% samples, respectively, and detected by mPCR in 0; 10% and 35% samples, respectively. mPCR presented 78,3% accuracy; 37,5% sensitivity and 93,2% specitivity and detection lower of 100pg for each pathogen. CCCs presented medium of 395.000 cells/mL and 55% of evaluated samples resulted in TBC satisfactory values for mesophilus. Subclinical mastitis index in evaluated cattle, by CMT, was 28,3%. In conclusion, mPCR for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection was successfully standardized in the present study and can be indicated as a complementary diagnosis to the routine methods for bovine mastitis and milk quality’s monitoring

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-30Bitstream added on 2015-04-09T12:47:45Z : No. of bitstreams: 1 000817133_20160730.pdf: 68740 bytes, checksum: ee6dfc1a38a4409cdffa8e1a8e0577ff (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-01T11:29:58Z: 000817133_20160730.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-01T11:30:55Z : No. of bitstreams: 1 000817133.pdf: 364091 bytes, checksum: 520831e02a55b8316a3d4a841d22c7e5 (MD5) / Staphylococcus aureus é o microrganismo que mais prevalece em casos de mastite em rebanhos bovinos leiteiros e isto ocorre devido a produção de vários fatores de virulência, inclusive aqueles relacionados a sua capacidade de se instalar no parênquima mamário. Sendo assim, as condições microbiológicas do leite cru que é fornecido às indústrias pode refletir no seu produto final, determinando riscos à saúde do consumidor. Diante do exposto, objetivou-se realizar o isolamento e identificação das estirpes de S. aureus de amostras de leite bubalino da raça Murrah, dos insufladores, água das mangueiras da sala de ordenha e mãos dos ordenhadores em uma propriedade rural em Analândia – SP nos meses de abril, junho, outubro e novembro. Foi avaliada, a capacidade produtora de biofilme in vitro” pelo método de aderência em microplacas e pelo cultivo em Agar Vermelho Congo (CRA), o perfil de sensibilidade dos S. aureus frente a antimicrobianos pelo método da difusão em disco além de identificar os genes que participam na formação de biofilme por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Das 147 estirpes de Staphylococcus spp isoladas, 32 foram identificadas como S. aureus. Dos isolados, 28,1% foram positivas para o gene icaA, 21,8% para o gene icaD, 28,1% para clfA, 50% clfB, 53,1% sarA e 50% para o gene hla. Todas os isolados demonstraram habilidade de produção de slime em Agar Vermelho Congo (CRA) e formação de biofilme em microplaca. Embora a frequência de isolamento de S. aureus foi baixa, essas estirpes podem ser consideradas potenciais patógenos zoonóticos / Staphylococcus aureus is the most common cause of mastitis in dairy herds due to its production of several virulence factors, including those related to its ability to colonize the teat parenchyma. The microbiological status of raw milk supplied to manufacturers may reflect on the final product and the associated risks to consumer health. Accordingly, the aim of this study was to isolate and characterize S. aureus strains from samples of Murrah buffalo milk, milking machines, water hoses from milking room and from the hands of milkers on a dairy farm located in Analândia – SP during the months of April, July, October, and November. Biofilm-producing capacity was evaluated in vitro” using a microtiter method and cultivation on Congo Red Agar (CRA). Antibiotic sensitivity testing was performed by the disk diffusion method and the identification of the genes involved in biofilm formation by Polymerase Chain Reaction (PCR). One hundred and forty-seven Staphylococcus spp. were isolated and 32 were identified as S. aureus. Of those isolates, 28.1% were positive for the icaA gene, 21.8% for the icaD gene, 28.1% for the clfA, 50.0% for the clfB, 53.1% for sarA and 50.0% for hla. All isolates produced slime on Congo Red Agar (CRA) and formed biofilms in a microtiter assay. Although the frequency of S. aureus was low, the stains isolated can be considered as potential zoonotic agents

Dissertação composta por 02 artigos. / CNPq; Capes / O leite é uma das principais fontes de nutrientes da dieta humana e é um alimento que acompanha o ser humano durante toda a vida, tanto como leite de consumo como através de seus derivados. Entretanto, são inúmeras as formas e os tipos de contaminação que acometem o leite, destacando-se, dentre os contaminantes de ordem química, as aflatoxinas. Dentre os métodos de análise de aflatoxinas em leite e derivados, destaca-se a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), principalmente devido a sua versatilidade, rapidez e acuracidade das medidas quantitativas. Entretanto, trata-se de um sistema complexo em que as propriedades dos constituintes da fase móvel são afetadas por mudanças nas condições de processo nas quais são realizados os experimentos. Normalmente as condições de análise por CLAE são determinadas empiricamente, pelo método “tentativa e erro” em que inúmeras tentativas são realizadas sem um estudo mais detalhado do sistema. Diante disso, a primeira etapa deste estudo objetivou a otimização de multirrespostas em CLAE, por meio da seleção das condições ótimas como a composição da fase móvel, sua vazão no sistema cromatográfico e a temperatura da coluna, a fim de identificar, separar e quantificar simultaneamente a aflatoxina M1 (AFM1) e a aflatoxina B1 (AFB1). Para tanto, realizou-se planejamento experimental de misturas para três componentes com restrições combinado com um planejamento fatorial 22 para as variáveis de processo (temperatura da coluna e vazão). Após a definição dos modelos para as variáveis dependentes, foi realizada busca das condições ótimas usando o método simplex sequencial e as funções de desejabilidade de Derringer e Suich. As variáveis avaliadas foram: composição da fase móvel (acetonitrila, metanol e solução aquosa de ácido acético 1%), vazão da fase móvel e temperatura da coluna. Os parâmetros cromatográficos obtidos como respostas foram: tempo e fator de retenção para ambas as aflatoxinas, fator de separação, resolução da coluna e altura dos picos. Após a validação do planejamento, foi realizada a validação analítica do método otimizado através das figuras analíticas de mérito: linearidade, precisão, exatidão e limites de detecção e quantificação. O planejamento realizado foi capaz de produzir modelos confiáveis que possibilitaram a estimativa das melhores condições atendendo aos múltiplos objetivos. Na validação analítica do método cromatográfico, os parâmetros analíticos avaliados ficaram dentro dos intervalos de confiança, podendo o método ser considerado exato e preciso, apresentando limites de quantificação de 0,3 e 0,5 μg L-1 para AFM1 e AFB1, respectivamente e linearidade com R2 > 0,99 para ambas as aflatoxinas. A segunda etapa do estudo objetivou a avaliação da interação entre as AFM1 e AFB1 com proteínas lácteas, tendo em vista que estudos demonstram que aquelas, especialmente a AFM1, localizam-se predominantemente nas frações proteicas. Entretanto, esses estudos não avaliaram a interação entre aflatoxinas e as proteínas do leite, mas apenas baseiam-se na sua quantificação nas frações proteicas do leite. Portanto, buscou-se por meio deste estudo avaliar a possível interação entre as AFM1 e AFB1 com as frações proteicas do leite. Análises por Espectroscopia na região de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram realizadas para avaliação de possíveis modificações na estrutura secundária das proteínas lácteas quando fortificadas com as aflatoxinas e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). Para tanto, preliminarmente foram avaliados os espectros obtidos com padrões de caseína e β-lactoglobulina em solução tampão fosfato-salino (PBS) e em solução modelo, assim como no leite propriamente dito, integral e desnatado. Na segunda etapa, regiões espectrais específicas foram avaliadas por meio de técnicas de deconvolução e curve-fitting. Os resultados indicam que a solução PBS foi mais adequada para o estudo da interação entre as AFB1 e AFM1 e proteínas lácteas avaliadas, β-lactoglobulina e caseína. Foram observadas alterações nas estruturas secundárias e essas sugerem que, embora possivelmente ocorram interações de caráter hidrofílico entre β-lactoglobulina e as aflatoxinas (especialmente com AFM1), ocorram também interações de caráter hidrofóbico (especialmente de AFB1) com os pacotes hidrofóbicos da β-lactoglobulina. Já com a caseína, as alterações promovidas nas estruturas secundárias proteicas foram mais discretas, porém deslocamentos de picos foram observados indicando alterações estruturais da proteína, especialmente na presença de AFB1, o que sugere que ocorram interações químicas entre os componentes avaliados. As alterações espectrais, mais evidentes com a fração β-lactoglobulina, do que com a fração caseína sugerem que, embora a quantificação de aflatoxinas seja comumente superior na fração caseína, não se pode afirmar que por esse motivo ocorram interações mais tangíveis entre aflatoxinas e caseína do que entre aflatoxinas e β-lactoglobulina. Possivelmente a quantificação em maior percentual de aflatoxinas na fração caseína é atribuída ao fato dessa proteína encontrar-se, no leite, em percentual superior às proteínas do soro. Outra hipótese levantada pelo estudo é a possibilidade das aflatoxinas avaliadas encontrarem-se “mascaradas” por estarem conjugadas com a β-lactoglobulina e não sendo, portanto, detectadas pelos métodos analíticos convencionais ocasionando sua subestimação nessa fração. / Milk is one of the main sources of nutrients in the human diet and is a food that accompanies the human being throughout life, both as drinking milk as through its derivatives. However, there are countless forms and types of contamination that affect milk, especially among the contaminants of chemical order, aflatoxins. Among the methods of analysis of aflatoxins in milk and dairy products, the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) stands out mainly due to its versatility, speed and accuracy of quantitative measurements. However, it is a complex system in which the properties of the constituents of the mobile phase are affected by changes in process conditions under which the experiments are performed. Typically the HPLC analysis conditions are determined empirically, using the "trial and error" in which numerous attempts are made without a more detailed study of the system. Therefore, the first step of this aimed to optimize multiresponses in HPLC, by selecting the optimal conditions as the mobile phase composition, its flow into the chromatographic system and the column temperature in order to identify, separate and quantify aflatoxin M1 (AFM1) and aflatoxin B1 (AFB1) simultaneously. Therefore, it was carried out experimental a mixture design for three components with restrictions combined with a 22 factorial design to the process variables (flow and column temperature). After defining the models for the dependent variables, a search of the optimum conditions was made using the sequential simplex method and the Derringer and Suich desirability functions. The variables evaluated were: mobile phase composition (acetonitrile, methanol and aqueous solution of acetic acid 1%), the mobile phase flow rate and column temperature. The chromatographic parameters obtained as responses were time and factor of retention for both aflatoxins, separation factor, column resolution and height of the peaks. After the design validation, analytical validation was performed through the analytical figures of merit: linearity, precision, accuracy and limits of detection and quantification. The experimental design carried out was able to produce reliable models that allowed better conditions estimation regarding multiple objectives. In the analytical validation of the chromatographic method, the analytical parameters evaluated were within the confidence interval, the method can be considered accurate and precise showing quantitation limits of 0.3 and 0.5 μg L-1 for AFB1 and AFM1, respectively, and linearity with R2> 0.99 for both aflatoxins. The second stage of the study aimed to evaluate the interaction between the AFB1 and AFM1 with dairy proteins, considering that studies show that those, especially AFM1, are located predominantly in the protein fractions. However, these studies did not evaluate the possibility of interaction between aflatoxins and dairy proteins, but only based on its quantification in the dairy protein fractions. Therefore, we sought through this study to evaluate a possible interaction between AFM1 and AFB1 with dairy protein fractions. Analyzes were performed by Fourier transformation infrared spectroscopy (FTIR) to assess possible changes in the secondary structure of dairy proteins when spiked with aflatoxins and Differential Scanning Calorimetry (DSC). For this purpose, preliminarily the spectra obtained were evaluated with standard casein and β-lactoglobulin in phosphate buffer saline solution (PBS) and a bovine milk model solution as well as in actual milk, whole and skim. In the second step, specific spectra bands were assessed through deconvolution and curve-fitting techniques. The results show that PBS was more suitable for the interaction study between aflatoxins B1 and M1 and the dairy proteins evaluated, β-lactoglobulin and casein. Changes in secondary structures suggest that although possibly occurring interactions with hydrophilic characters between β-lactoglobulin and aflatoxins were observed (especially with AFM1) also occur interactions with hydrophobic character (especially AFB1) with the hydrophobic β-lactoglobulin packages. Already with the casein, the changes introduced in protein secondary structure were more discreet but peak shifts were observed indicating structural changes of the protein, especially in the presence of AFB1, which suggests that chemical interactions occur between the components evaluated. The spectral changes, more evident with the β-lactoglobulin fraction than the casein fraction, suggests that although the quantification of aflatoxins is commonly higher in the casein fraction, it’s not possible to ensure that for this reason occur more tangible interactions between aflatoxins and casein than between aflatoxins and whey proteins (β-lactoglobulin). The greater quantify percentage of aflatoxins in the casein fraction, apparently, is attributed to the fact that this protein is found, in milk, in superior percentage to the whey proteins. Another hypothesis is the possibility of the aflatoxins evaluated are "masked" by being combined with β-lactoglobulin and not, therefore, being detected by conventional analytical methods leading to their underestimation in this fraction. / 5000

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Oswaldo Durival Rossi Junior / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Poliana de Castro Melo / Resumo: Staphylococcus aureus é o microrganismo que mais prevalece em casos de mastite em rebanhos bovinos leiteiros e isto ocorre devido a produção de vários fatores de virulência, inclusive aqueles relacionados a sua capacidade de se instalar no parênquima mamário. Sendo assim, as condições microbiológicas do leite cru que é fornecido às indústrias pode refletir no seu produto final, determinando riscos à saúde do consumidor. Diante do exposto, objetivou-se realizar o isolamento e identificação das estirpes de S. aureus de amostras de leite bubalino da raça Murrah, dos insufladores, água das mangueiras da sala de ordenha e mãos dos ordenhadores em uma propriedade rural em Analândia - SP nos meses de abril, junho, outubro e novembro. Foi avaliada, a capacidade produtora de biofilme "in vitro" pelo método de aderência em microplacas e pelo cultivo em Agar Vermelho Congo (CRA), o perfil de sensibilidade dos S. aureus frente a antimicrobianos pelo método da difusão em disco além de identificar os genes que participam na formação de biofilme por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Das 147 estirpes de Staphylococcus spp isoladas, 32 foram identificadas como S. aureus. Dos isolados, 28,1% foram positivas para o gene icaA, 21,8% para o gene icaD, 28,1% para clfA, 50% clfB, 53,1% sarA e 50% para o gene hla. Todas os isolados demonstraram habilidade de produção de slime em Agar Vermelho Congo (CRA) e formação de biofilme em microplaca. Embora a frequência de isolamento de S. aureus foi baixa, essas estirpes podem ser consideradas potenciais patógenos zoonóticos / Abstract: Staphylococcus aureus is the most common cause of mastitis in dairy herds due to its production of several virulence factors, including those related to its ability to colonize the teat parenchyma. The microbiological status of raw milk supplied to manufacturers may reflect on the final product and the associated risks to consumer health. Accordingly, the aim of this study was to isolate and characterize S. aureus strains from samples of Murrah buffalo milk, milking machines, water hoses from milking room and from the hands of milkers on a dairy farm located in Analândia - SP during the months of April, July, October, and November. Biofilm-producing capacity was evaluated "in vitro" using a microtiter method and cultivation on Congo Red Agar (CRA). Antibiotic sensitivity testing was performed by the disk diffusion method and the identification of the genes involved in biofilm formation by Polymerase Chain Reaction (PCR). One hundred and forty-seven Staphylococcus spp. were isolated and 32 were identified as S. aureus. Of those isolates, 28.1% were positive for the icaA gene, 21.8% for the icaD gene, 28.1% for the clfA, 50.0% for the clfB, 53.1% for sarA and 50.0% for hla. All isolates produced slime on Congo Red Agar (CRA) and formed biofilms in a microtiter assay. Although the frequency of S. aureus was low, the stains isolated can be considered as potential zoonotic agents / Mestre

Orientador: Hélio Langoni / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Banca: Deolinda Maria Vieira Filha Carneiro / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Resumo: Com o objetivo de normatizar a cadeia produtiva visando à melhoria da qualidade do leite no Brasil, o MAPA delineou a IN n° 51, em vigor desde julho de 2005. Em linha com estes parâmetros, objetivou-se, no presente estudo, padronizar o método de mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão, e avaliar esta técnica como possível recurso diagnóstico a ser empregado em programas de controle de qualidade do leite oferecido para consumo. Foram visitadas 20 propriedades leiteiras do Estado de São Paulo, com sistema de ordenha mecânica e tanque de expansão próprio, nas quais foram colhidas amostras de leite para a realização da mPCR, cultivo microbiológico, CCS e CBT. S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram isolados, em 30%; 10% e 40% das amostras de leite dos tanques de expansão, respectivamente, e detectados pela mPCR em 0; 10% e 35%, respectivamente. A mPCR apresentou acurácia de 78,3%; sensibilidade de 37,5% e especificidade de 93,2% e limiar de detecção de 100 picogramas. A CCS apresentou mediana de 395.000 células/mL, e 55% das amostras avaliadas resultou em valores de CBT satisfatórios para mesófilos. O índice de mastite subclínica nos rebanhos avaliados pelo CMT foi de 28,3%. Conclui-se que a mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foi padronizada com êxito no presente estudo, e pode ser indicada como método complementar aos utilizados na rotina diagnóstica de mastite bovina e qualidade do leite / Abstract: Brazilian Ministry of Agriculture and Supply, objecting the improvement of milk quality in Brazil, published the Normative Instruction n. 51, a technical group of rules for milk business that has been attended since July 2005. In line with these parameters, the aim of the present study was to standardize the mPCR test for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection in bovine milk samples obtained from bulk tanks, in order to evaluate this method as a possible tool to be used in milk quality control programs. Twenty milk farms with milking machine system and individual bulk tank, of different regions of Sao Paulo state were sampled. Bulk milk samples were collected for mPCR, microbiological culture, Somatic Cell Count and Total Bacterial Count. S. aureus, S. agalactiae e E. coli were isolated in 30%; 10% and 40% samples, respectively, and detected by mPCR in 0; 10% and 35% samples, respectively. mPCR presented 78,3% accuracy; 37,5% sensitivity and 93,2% specitivity and detection lower of 100pg for each pathogen. CCCs presented medium of 395.000 cells/mL and 55% of evaluated samples resulted in TBC satisfactory values for mesophilus. Subclinical mastitis index in evaluated cattle, by CMT, was 28,3%. In conclusion, mPCR for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection was successfully standardized in the present study and can be indicated as a complementary diagnosis to the routine methods for bovine mastitis and milk quality's monitoring / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-07-07T19:08:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 867144 bytes, checksum: b1dfb9c08a4b085feda6d150ced1327c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T19:08:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 867144 bytes, checksum: b1dfb9c08a4b085feda6d150ced1327c (MD5) Previous issue date: 2017-03-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mycobacterium bovis e Brucella abortus são os agentes etiológicos da tuberculose e da brucelose bovinas, doenças infectocontagiosas de ocorrência mundial que geram grandes prejuízos econômicos e podem ser transmitidas aos humanos principalmente através do contato direto com animais contaminados e da ingestão de leite cru e derivados. No Brasil existe o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose, criado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que estabelece a realização do diagnóstico e normatiza as medidas de controle dessas zoonoses. Os métodos oficiais para diagnóstico de brucelose e tuberculose no animal vivo possuem sensibilidade e especificidade variáveis, são laboriosos e demandam tempo. Para aumentar a eficácia do controle destas doenças são necessários métodos rápidos e acurados, que atuem como ferramenta auxiliar no diagnóstico in vivo dessas enfermidades sem a necessidade de procedimentos invasivos. Para garantir a credibilidade e confiabilidade de novos métodos de diagnóstico é necessário que os mesmos sejam validados. No presente estudo foram realizados ensaios para a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a detecção do DNA de M. bovis e B. abortus em amostras de leite cru artificialmente contaminados, usando como critério o desempenho analítico (sensibilidade e especificidade analítica), repetibilidade, reprodutibilidade interna e robustez. Inicialmente cinco metodologias de extração de DNA foram testadas e as que apresentaram melhores resultados foram os kits comerciais DNeasy mericon Food Kit – Qiagen e Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega. Os limites de detecção obtidos na qPCR validada nesse estudo foram de 2,3 pg de DNA de M. bovis e 20,7 fg de DNA de B. abortus. As repetibilidades eviii reprodutibilidades aliadas à robustez apresentadas nesse trabalho indicam que os métodos avaliados podem ser utilizados de forma auxiliar ao diagnóstico in vivo oficial de tuberculose e brucelose bovinas, após ser testada em animais naturalmente infectados. / Mycobacterium bovis and Brucella abortus are the etiological agents of bovine tuberculosis and brucellosis, infectious diseases globally disseminated that cause substantial economic losses and can be transmitted to humans mainly through direct contact with contaminated animals and the intake of raw milk and milk products. In Brazil there is the National Program for the Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis, created by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply, which establishes the diagnosis and regulates the control measures of these zoonosis. The official methods for diagnosis of brucellosis and tuberculosis in the living animal have variable sensitivity and specificity, are laborious and time consuming. In order to increase the efficacy of brucellosis and tuberculosis control, rapid and accurate methods are necessary to act as an auxiliary tool in the in vivo diagnosis of these diseases without the need of invasive procedures. To ensure the credibility and reliability of new diagnostic methods, they must be validated. In the present study, the validation of a real-time polymerase chain reaction (qPCR) for the detection of M. bovis and B. abortus in artificially contaminated raw milk samples was performed using analytical performance (analytical sensitivity and specificity), repeatability, internal reproducibility and robustness. Initially five DNA extraction methodologies were tested and the ones that presented the best results were the commercial kits “DNeasy Mericon Food Kit – Qiagen” and “Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega”. The limits of detection obtained in the qPCR validated in this study were 2.3 pg of M. bovis DNA and 20.7 fg of B. abortus DNA. The repeatability and reproducibility associated with the robustness presented in this study indicate that the evaluated methods can be used as an auxiliaryx tool to the in vivo official diagnosis of bovine tuberculosis and brucellosis, after being tested in naturally infected animals. / Nos dois impressos faltaram as últimas 12 páginas com referência bibliográfica.