Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Algas e Plantas, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:07:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334791.pdf: 8202573 bytes, checksum: c26f6b6d9ce3333a7e89a20a3af2f0e4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fimbristylis Vahl (Cyperaceae) compreende cerca de 300 espécies com distribuição pantropical e subtropical. O gênero é caracterizado por apresentar espiguetas com glumas arranjadas espiraladamente, flores bissexuadas, estilopódio engrossado e decíduo na maturidade, aquênio desprovido de cerdas perigoniais, as inflorescências podem ser corimbosas, anteliformes ou monocéfalas; o estilete pode ser bífido ou trífido. O presente estudo trata do estudo de Fimbristylis, resolução do  complexo F. dichotoma para a América do Sul austral e estudo taxonômico de Fimbristylis para Santa Catarina e foi desenvolvido através de métodos tradicionais de taxonomia. Os resultados obtidos são apresentados em três artigos: o primeiro apresenta a descrição de uma nova espécie e tratamento do  complexo F. dichotoma ; o segundo traz a descrição de duas espécies novas e a lectotipificação de uma espécie; o terceiro traz o estudo taxonômico do gênero para Santa Catarina.<br> / Abstract : Fimbristylis Vahl comprises about 300 species with pantropical and subtropical distribution. The genus is characterized by having spikelets with scales spirally arranged, bisexual flowers, thickened stylopodium and deciduous at maturity, achene without perigonial bristles, the inflorescences can be corymbiform, antheliform or monocephalous; the stylus can be bifid or trifid. The present study is a study of Fimbristylis, resolution of "F. dichotoma complex" for South America Southern and taxonomic study of Fimbristylis to Santa Catarina and was developed through traditional methods of taxonomy. The results are presented in three articles: the first presents the description of a new species and treatment "F. dichotoma complex"; the second brings the description of two new species and lectotipification of one species; the third brings the description of nine species to Santa Catarina.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Algas e Plantas, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-11T04:01:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341959.pdf: 3557670 bytes, checksum: f45b86fcd377d9c7907892dbe795ba72 (MD5) Previous issue date: 2016 / A exploração do carvão mineral, gera impactos severos ao ambiente, devido a grande quantidade de rejeitos, conhecidos como drenagem ácida de mina (DAM), com elevada acidez, baixo pH e altas concentrações de metais pesados dissolvidos. A DAM pode ser lixiviada pela água da chuva, atingindo rios e lagos, e dispersando assim, os contaminantes em solução ou em forma particulada. Eleocharis laeviglumis e Eleocharis elongata ocorrem em lagoa contaminada por DAM no município de Siderópolis, SC, e em ambiente livre de contaminação, em Florianópolis, SC. Essas espécies são rizomatosas, áfilas e apresentam o escapo como órgão fotossintetizante perene. O presente trabalho teve como objetivo estudar o desenvolvimento do sistema caulinar e radicular, analisando espécimes dos dois ambientes a fim de verificar possíveis alterações anatômicas relacionadas à ação dos metais pesados. Para o desenvolvimento meristemas apicais caulinares (MAC) e radiculares (MAR) foram fixados em FAA70%, desidratados e incluídos em parafina. Após seccionamento, as secções foram coradas com azul de astra e safranina e montadas com bálsamo-do-canadá. Para os testes histoquímicos as mesmas regiões foram incluídas em hitoresina, seccionadas e submetidas à distintos reagentes. As análises ultraestruturais de transmissão, bem como as análises de Espectrocospia de Energia Dispersiva (EDS) seguiram protocolos padrão. Os resultados demostram que o rizoma de E. leaviglumis e E. elongata, em ambos os ambientes, apresenta crescimento simpodial, desenvolvendo-se a partir de gemas laterais, localizadas nas axilas dos catafilos. Em secções longitudinais do meristema apical observam-se ápices meristemáticos vegetativos e reprodutivos, ambos protegidos por catafilos. No ápice vegetativo observa-se o promeristema com organização túnica-corpo, cordões procambiais, o meristema fundamental e o meristema de espessamento primário (MEP) formando raízes adventícias. Nos ápices reprodutivos observa-se a forma alongada destes, já evidenciando a formação da espigueta e a ocorrência do meristema intercalar. Em secções transversais, a partir do meristema apical observam-se o desenvolvimento das unidades simpodiais do rizoma e do escapo floral. No rizoma, observa-se a atividade do MEP com atividade apenas para fora, formando parte do córtex ,no escapo floral observa-se a ausência do MEP e a atividade do meristema intercalar, formando os tecidos que compõem o escapo floral. Em secções longitudinais do ápice radicular, em ambas as espécies, observa-se a coifa originada do caliptrogênio, o promeristema, a protoderme, o prôcambio e o meristema fundamental. Em secções transversais observa-se a atividade da endoderme meristemática originando parte do córtex interno o qual na maturidade se desenvolve em aerênquima. Os testes histoquímicos evidenciaram polissacarídeos ácido e neutros, proteínas e amiloplastos nas células do MAC e MAR. As análises ultraestruturas mostraram alterações em ambas as espécies em DAM (-) como, corpos eletrodensos e fusão de vesículas. As análises de EDS não mostraram acúmulo de metais nas geriões apicais. Os resultados do presente estudo condizem com o desenvolvimento anatômico do sistema subterrâneo já descrito para outras espécies de Cyperaceae e não mostram alterações anatômicas estruturaus e ultraestruturais no desenvolvimento dos referidos órgão nos indivíduos DAM (+) em relação aos indivíduos DAM(-).<br> / Abstract : The exploitation of coal, generates severe impacts on the environment, due to the large amount of waste, known as acid mine drainage (AMD), with high acidity, low pH and high concentrations of dissolved heavy metals. AMD can be leached by rainwater reaching rivers and lakes, dispersing and thus the contaminants in solution or in particulate form. Eleocharis laeviglumis and Eleocharis elongata occur in contaminated pond for AMD in the municipality of Siderópolis, SC, and pollution-free environment, in Florianópolis, SC. These species are rhizomatous, áfilas and present the escapement as perennial photosynthetic organ. This study aimed to study the development of stem and root system, analyzing specimens of both environments in order to verify possible anatomical changes related to the action of heavy metals. For apical meristem development stem (SAM) and root (RAM) were fixed in FAA70%, dehydrated and embedded in paraffin. After sectioning, the sections were stained with astra blue and safranin and mounted with balsam-canada. For histochemical tests the same regions were included in hitoresina, sectioned and subjected to different reagents. The ultrastructural analysis of transmission and analysis of spectroscopy Energy Dispersive (EDS) followed standard protocols. The results demonstrate that the rhizome E.laeviglumis and E.elongata in both environments presents sympodial, developing from lateral buds located in the axils of cataphylls. In longitudinal sections, apical meristem are observed vegetative and reproductive meristematic apexes, both protected by cataphylls. In the growing apex observed the promeristem with tunic-body organization, procambiais cords, the meristem and primary thickening meristem (PTM) forming adventitious roots. In reproductive apexes observed the elongated shape of these, already showing the formation of spikelets and the occurrence of interim meristem. In transverse sections from the apical meristem development are observed sympodial units rhizome and floral escapement. The rhizome, there is the activity of the PTM with activity just out, forming part of the cortex, floral escapement observed the absence of the PTM and the activity of the interim meristem, forming tissues that make up the floral scape. In longitudinal sections of the root apex, in both species, there is the originating hood of calyptrogen the promeristem the protoderm the procambium and meristem. In cross-sections observed the activity of meristematic endoderm causing part of the inner cortex which at maturity develops in aerenchyma. The histochemical tests showed acid and neutral polysaccharides, proteins and cells amiloplasts SAM and RAM. The ultrastructures analysis showed changes in both species in AMD (-) as electron-bodies and fusion of vesicles. EDS analyzes showed no accumulation of metals in the apical geriões. The results of this study are consistent with the anatomical development of the underground system already described for other species of Cyperaceae and show no estruturaus and ultrastructural changes in anatomical development of said body in AMD individuals (+) compared to individuals AMD (-).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal. / Made available in DSpace on 2012-10-21T09:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Orientador : Prof. Dr. Alexander Welker Biondo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/10/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: Micoplasmas hemotrópicos, também conhecidos como hemoplasmas, são bactérias pertencentes à classe Mollicutes, patógenos obrigatórios dos eritrócitos de uma diversidade de espécies animais. São responsáveis pelo desenvolvimento de quadro agudo caracterizado por anemia ou uma infecção crônica assintomática ou com variadas síndromes ainda pouco caracterizada podendo, inclusive, interferir em resultados de estudos experimentais em animais de pesquisa. Devido à incapacidade em cultivar estes organismos, técnicas moleculares tem sido utilizadas como padrão no seu diagnóstico e estudo, e novas espécies vem sendo descritas em todo o mundo, principalmente em animais silvestres e de vida livre. Mycoplasma coccoides e Mycoplasma haemomuris são os hemoplasmas mais comumente reconhecidos no sangue de roedores selvagens e de laboratório. Até o presente momento nenhum trabalho tratou de estudar a ocorrência, epidemiologia e caracterização clínica e molecular de hemoplasmas de roedores de vida livre no Brasil. Como a presença de animais selvagens em cativeiro em zoológicos inviabiliza a utilização de raticidas tóxicos ou anticoagulantes, a captura dos animais vivos tem sido utilizada como método de controle paliativo da infestação por roedores nestes locais. O objetivo deste estudo é investigar a ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em ratazanas (Rattus norvegicus) de vida livre capturados no Passeio Público e Zoológico de Curitiba e comparar com variáveis hematológicas. Quarenta e três ratazanas foram capturadas entre o Passeio Público e o Zoológico de Curitiba, e 20 outras foram amostradas do criatório do Passeio Público, onde são mantidas para a alimentação dos animais carnívoros do acervo. Mais de sessenta e três porcento das ratazanas foram positivas em triagem universal para micoplasmas hemotrópicos por PCR quantitativa através de técnica de SYBR® Green. Uma amostra de ao menos 50% de cada TM obtida foi submetida a sequenciamento e determinadas como M. haemomuris com exceção de uma amostra, 94% similar ao hemoplasma felino 'Candidatus M. turicensis'. Análise filogenética de um fragmento de aproximadamente 1300 pb do gene 16S rRNA revelou que esta amostra é homóloga a um micoplasma hemotrópico descrito infectando um rato de colheita europeu da espécie Micromys minutus. A relevância da presença de uma nova espécie de micoplasma hemotrópico infectando essas duas espécies diferentes de roedores de vida livre em continentes tão distantes é incerta. Não foram detectadas alterações estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos entre as ratazanas infectadas e não infectadas, o que corrobora o caráter de baixa patogenicidade e/ou infecção silenciosa destes microrganismos. Estes achados sugerem que hemoplasmas possivelmente são endêmicos na região de Curitiba, e a epidemiologia destes microrganismos precisa ser investigada, assim como seu impacto na fauna local, nos animais selvagens e de cativeiro dos parques, com especial atenção ao seu potencial zoonótico. Palavras-chave: ratazana, anemia, hemoplasmose. / Abstract: Hemotropic mycoplasmas, also known as hemoplasmas, are bacteria belonging to the class Mollicutes, obligatory pathogens of the red blood cells of a variety of animal species. There organisms are responsible for the development of anemia and disease with acute or chronic course and may occur silently interfering with results of experimental studies in animal research. Due to the inability to cultivate these organisms, molecular techniques have been used as standard diagnosis and study, and new species are being described worldwide, mainly in wild and free living animals. Mycoplasma coccoides and Mycoplasma haemomuris are the most commonly recognized hemoplasmas in the blood of wild and laboratory rodents. To date no work attempted to study the incidence, epidemiology, and clinical and molecular characterization of hemoplasmas in free-ranging rodents in Brazil. As the presence of wild animals in captivity in zoos hinders the use of toxic rodenticides or anticoagulants, capturing live animals has been used as a method of palliative control of rodent infestation in these locations. The aim of this study is to investigate the occurrence of hemotropic mycoplasmas in free-ranging rats (Rattus norvegicus) captured in the Passeio Público and the Curitiba Zoo and compare with hematological parameters. Fourty three rats were captured and 20 others were sampled from the nursery, where they are kept for feeding the carnivorous animals of the parks. 63.5% of rats were positive in universal screening for hemotropic mycoplasmas by quantitative PCR using the SYBR® Green technique. A sample of at least 50% of each TM was subjected to sequencing and determined as M. haemomuris except for one sample, 94% similar to the feline hemoplasma 'C M. turicensis'. Phylogenetic analysis of a fragment of approximately 1300 bp of the 16S rRNA gene showed that this sample was homologous to a hemotropic mycoplasma described infecting a European harvest mouse (Micromys minutus). The relevance of the presence of a new species of hemoplasma infecting two different free-ranging rodent species in such distant continents is uncertain. No statistically significant changes in hematological parameters between infected and uninfected rats were found, which confirms the low pathogenicity and/or silent infection character of these microorganisms. These findings suggest that possibly hemoplasmas are endemic in the region, and the epidemiology of these organisms need to be investigated as well as its impact on local wildlife, captivity animals, with special attention to its zoonotic potential. Key-words: rats, anemia, mycoplasmal disease.

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.

Orientadora : Drª. Lucélia Donatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 21/02/2014 / Inclui bibliografia / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: Peixes antárticos são espécies adaptadas ao frio, consideradas estenotérmicas, sendo seu metabolismo eficiente em baixas temperaturas. Estudos recentes sobre alterações climáticas relatam que a Península Antártica apresenta aquecimento acelerado, é extremamente importante entender a plasticidade metabólica e os mecanismos bioquímicos envolvidos na aclimatação a altas temperaturas de peixes antárticos para a conservação destas espécies e do ecossistema Antártico. O presente trabalho teve o objetivo de analisar o efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps, expostos durante 1, 3 e 6 dias a 8+0.5°C e a 0+0.5°C. Variações morfológicas nos eritrócitos e nos níveis de atividade de alguns constituintes enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx); superóxido dismutase (SOD); glutationa S-transferase (GST); catalase (CAT); glutationa redutase (GR) e quantificação do constituinte não enzimático, glutationa reduzida (GSH) e lipoperoxidação lipídica (LPO), por dosagem de malonaldeído (MDA) foram analisados. Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C não modulou os níveis de SOD e GPx. Mas modulou negativamente os níveis de CAT em 1 (87% menor em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (90% menor em 8°C quando comparado a 0°C). A GST foi modulada positivamente em 3 dias (57,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). A GR foi modulada positivamente em 1 dia ( 69,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (81% maior em 8°C quando comparado a 0°C). Em Notothenia rossii o aumento da temperatura não modulou os níveis de GPx e GR. Mas, a SOD foi modulada positivamente em 6 dias (68% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e a CAT foi modulada positivamente em 3 dias (97% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e negativamente em 6 dias (86% menores em 8°C quando comparados a 0°C). A GST também foi modulada negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). Os níveis de GSH não foram modulados pela temperatura em ambas as espécies. O níveis de MDA foram modulado negativamente em 3 dias a 8°C em ambas as espécies e houve modulação positiva em 1 dia para N. coriiceps pelo aumento da temperatura. Análises morfológicas dos eritrócitos indicaram que em N. coriiceps o aquecimento a 8°C determinou o aumento da frequência de alterações no formato celular, presença de vesículas na membrana plasmática, núcleo em Blebbed e fissura nuclear. Em N. rossii o estresse térmico influenciou o aumento da frequência de alterações no formato celular e a presença de núcleos em Blebbed. A proporção de eritrócitos maduros e imaturos, a frequência de micronúcleo, o deslocamento celular, volume celular e nuclear não foram influenciados pelo estresse térmico em ambas as espécies. Foi possível concluir que, nos nototenideos antárticos, N. rossii e N. coriiceps, espécies filogeneticamente muito próximas, os padrões de resposta frente ao aumento da temperatura ambiental foram diferentes. Palavras-chaves: eritrócitos, temperatura, estresse oxidativo, anormalidades celulares. / Abstract: Antarctic fish are cold-adapted species, considered stenothermal; the metabolism of this fishes is very efficient at low temperatures. Recent studies about climatic changes report accelerated warming in the Antartic Peninsula. For the conservation of Antartic ecosystem and species is extremely important to understand the metabolic plasticity and biochemical mechanisms involved in high temperatures acclimation of Antartic fishes. This study aimed to verify the effect of heat stress on the morphology and the antioxidant defense system in erythrocytes of Notothenia coriiceps and Notothenia rossii, exposed for 1, 3 and 6 days to 8 +0.5 +0.5 ° C and 0 ° C. Morphological changes in erythrocytes and activity levels of some enzymatic constituents like glutathione peroxidase ( GPx ), superoxide dismutase ( SOD ), glutathione S - transferase ( GST ), catalase ( CAT ), glutathione reductase ( GR ) and quantification of non-enzymatic constituent, reduced glutathione ( GSH ) and lipid peroxidation ( LPO ), by measurement of malondialdehyde (MDA) were analyzed. The temperature increase to 8ºC in N.coriiceps do not modulated levels of SOD and GPx, although, negatively modulates the levels of CAT 1 (87 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C) and 3 days (90 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was positively modulated in 3 days (57.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively within 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). The GR was positively modulated at 1 day ( 69.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and 3 days (81 % increase at 8 ° C as compared to 0 ° C). The temperature increase in N. rossii do not modulate GPx levels of GR . However, SOD was positively modulated in 6 days (68 % higher when compared to 8C 0 ° C) and CAT was positively modulated in 3 days (97% at 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively 6 days (86 % lower at 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was also negatively modulated in 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). Morphological analysis of erythrocytes indicated that in N. coriiceps heating at 8 °C determined the increase frequency of changes in cell format, presence of vesicles in plasma membrane and Blebbed nucleus. Heat stress at 6 days in N. rossii influenced an increase frequency of changes in cell shape and presence of Blebbed nucleus. The proportion of mature and immature erythrocytes, frequency of micronucleus and cell displacement, cell and nuclear volume were not affected by heat stress in both species. In conclusion, N. rossii and N. coriiceps, phylogenetically close Antarctic nototenideos, have different patterns of response due to increased environmental temperature. Keywords: erythrocytes, temperature, oxidative stress, cellular abnormalities.

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência / Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.

Orientador: Ricardo Ribeiro Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:38:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farah_FabianoTurini_M.pdf: 8149537 bytes, checksum: 073085b62f53e094229d5221c8e12c10 (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: Jose Mauro Granjeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viana_RenataIgarasi_M.pdf: 2873305 bytes, checksum: 8ad459dba7bf0a514834b21f1f7c39db (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado