- Introducció Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by early synaptic and late neuronal loss, affecting more than 26 million people worldwide. Among patients affected with dementia, more than half suffer from Alzheimer’s disease. The biggest risk factor for developing Alzheimer's disease is age. β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary p-Tau tangles accumulates in the brains of elderly patients playing a central role in the pathogenesis of AD. During the last years the fruit fly, Drosophila melanogaster has increasingly been used as a model for neurodegenerative disease. Although the adult fly has a simpler nervous system than those of vertebrates, it is capable of higher-order brain functions, including aversive and appetitive learning, and recalling learned information from prior experiences. - Contingut de la investigació This work has been focused on modeling Alzheimer's Disease in Drosophila by expressing two human genes associated with AD (Aβ42 and Tau) in the fly central nervous system. This model displays AD-like neuropathological as well as behavioral symptoms. The main goal of developing such a model is to analyse and study the effect of new synthetic fatty acids molecules in the pathogenesis of AD. Additionally, the model organisms established in this study could provide tools that help to understand disease-specific processes resulting in neuronal loss. This study argues that Drosophila can be used to study the behavioural basis of human neurodegenerative diseases and may provide a model to identify novel therapeutic avenues for neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease. In this work also was studied the effect of membrane lipid therapy on cognitive decline of a transgenic model of Drosophila. This model overexpresses the human amyloid peptide of 42 amino acids (Aβ42), and human Tau protein that play a key role in the development of this disease. - Conclusió The treatment has been based on the use of DHA and its hydroxylated derivate OHDHA, ARA and its hydroxylated form OHARA and EPA and its hydroxylated form OHEPA at 1, 3, 10, 30, 100 and 250 μg/ml of standard food. After testing the transgenes expression in the F1 generation by PCR analysis and Western blot it was evaluated the toxicity of the compounds, and it was demonstrated that food supplementation with OHDHA, OHARA, OHEPA partially restored the loss of locomotor activity and increased the life-span of the flies expressing the human transgenes whereas the DHA, ARA, EPA, form had not significant effects. It has been observed that the concentrations of 30 and 100 μg/ml of hydroxylated form, including the mixtures of (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA), and 30 μg/ml of TGMs, LP183A1, LP183A2, was used, have led to cognitive improvement and have maintained or increased the lifespan with respect to the control group. In addition it was analyzed the lipid content from Drosophila heads by using gas chromatography and it was found that the food supplementation with either hydroxylated or non-hydroxylated compounds induced changes in the fatty acid profile of Drosophila. Furthermore it was discovered that the amount of short chain fatty acids (SCFA), from the heads of F1 treated with ARA, EPA and DHA was less than that from untreated F1 flies. Concerning the hydroxylated fatty acids, the reduction in the levels of short chain fatty acid (SCFA) was similar to that of the non-hydroxylated fatty acids. All food supplement tested induced an increase of long chain fatty acids (≥ 18C). ARA, EPA and DHA were present in the fatty acid profile of flies treated with the respective non-hydroxylated food supplements. This fact proves the absorption and incorporation of dietary PUFAs into the Drosophila body tissues. / - Introducció La enfermedad de Alzheimer (AD, del inglés Alzheimer's disease) es una patología neurodegenerativa caracterizada por una pérdida temprana de conexiones sinápticas y, de manera tardía, de neuronas. Esta enfermedad afecta a unos 40 millones de personas en todo el mundo. Entre las personas con demencia, más de la mitad sufren AD. El mayor riesgo para desarrollar la enfermedad de Alzheimer es la edad. De hecho, las placas β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares de fosfo-Tau se acumulan en los cerebros de pacientes ancianos, jugando un papel central en la patogénesis de AD. Además, se han encontrado reducciones significativas en los niveles de los lípidos fosfatidiletanolamina y ácido docosahexaenoico (DHA) en el cerebro de pacientes con AD. Durante la última década, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) se ha utilizado como modelo para enfermedades neurodegenerativas, debido a que puede ser utilizada para el análisis de conductas como el aprendizaje aversivo y apetitivo, así como su capacidad de utilizar la información aprendida de previas experiencias, aunque la mosca adulta presenta un sistema nervioso mucho más simple que el de vertebrados. - Contingut de la investigació La presente investigación se centra en la utilización de Drosophila como modelo de AD mediante la sobreexpresión de los genes humanos asociados con AD (Aβ42 y Tau) en el sistema nervioso central de la mosca. El principal objetivo de desarrollar este modelo es analizar y estudiar el efecto de ácidos grasos sintéticos novedosos en la terapia de la AD. Conjuntamente, los organismos modelo establecidos en este trabajo pueden constituir un sistema que permita la comprensión de los procesos específicos de la enfermedad que desencadena la pérdida neuronal. Con todo ello, el presente trabajo demuestra que se puede usar Drosophila para estudiar las bases comportamentales de las enfermedades humanas neurodegenerativas y puede suponer un modelo para identificar nuevas terapias para dichas enfermedades, tales como AD. Además, se ha estudiado el efecto de la terapia lipídica de membrana en el declive cognitivo del modelo transgénico de AD de Drosophila. - Conclusió Los tratamientos empleados se basan en el uso de DHA y su derivado hidroxilado OHDHA, ARA y su forma hidroxilada OHARA y EPA y su forma hidroxilada OHEPA, así como derivados de triacilgliceroles (triacilglicerol miméticos, TGM) a dosis crecientes y añadidos en la comida. Tras confirmar la expresión de los transgenes en la generación F1 de las moscas por PCR y western blot, se analizó la toxicidad de los distintos compuestos y se demostró que la suplementación de comida con OHDHA, OHARA, OHEPA restauró la pérdida de actividad locomotora, parcialmente, además, aumentó la vida media de las moscas expresando los transgenes humanos, mientras que DHA, ARA, EPA no presentaron efectos significativos. Se observó que las concentraciones de 30 y 100 μg/ml de las formas hidroxiladas, incluyendo las mezclas de (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA) y 30 μg/ml de TGMs, LP183A1, LP183A2, mejoraron la capacidad cognitiva y aumentaron la vida media con respecto al grupo control no tratado. También se analizó el contenido lipídico en membranas de la cabeza de moscas mediante cromatografía de gases y se observó que la suplementación de la comida, tanto con los compuestos hidroxilados como los no-hidroxilados estudiados, indujo cambios en el perfil de ácidos grasos de Drosophila melanogaster. Entre ellos, se observó una menor cantidad de ácidos grasos de cadena corta en cabezas de moscas F1 tratadas con ARA, EPA and DHA en comparación con moscas no tratadas. En cuanto a los ácidos grasos hidroxilados, presentaron un nivel similar en la reducción de los niveles de ácidos grasos de cadena corta. Además, todos los suplementos añadidos a la comida indujeron un aumento de los ácidos grasos de cadena larga (≥ 18C). Finalmente, se observó la presencia de ARA, EPA y DHA en el perfil de ácidos grasos de las moscas tratadas con el correspondiente ácido graso no-hidroxilado. Este hecho prueba la absorción e incorporación de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la dieta en los tejidos de la Drosophila.

La identificació dels mecanismes moleculars que regulen la supervivència i mort de les motoneurones representa una informació important per a la comprensió funcional i l'establiment de potencials dianes terapèutiques per a les malalties que cursen amb degeneració i mort d'aquestes neurones. Per aquest motiu hem dedicat aquest treball a:a) L'estudi dels mecanismes intracel·lulars dependents de calci que modulen la supervivència de les motoneurones durant el desenvolupament.Com a efecte inductor de supervivència hem analitzat la participació de la proteïna quinasa dependent de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneurones embrionàries de pollastre, i demostrem que la seva activació calci dependent indueix la fosforilació d'Akt i la supervivència d'aquestes neurones. Per altra banda, com a efecte inductor de mort demostrem que els increments excessius de la concentració del calci intracel·lular induïts per la despolarització de la membrana, són responsables de l'activació de la proteasa Calpaïna i la conseqüent degeneració de les motoneurones de ratolí. Proposem la inhibició de Calpaïna com a mecanisme neuroprotector.b) La generació d'un model in vitro per a l'estudi dels mecanismes patològics que causen la degeneració específica de les motoneurones en Atròfia Muscular Espinal.En aquesta segona part del treball, amb la finalitat de contribuir a la comprensió de la fisiopatologia d'aquesta malaltia hem desenvolupat un model in vitro utilitzant tècniques d'interferència d'RNA. Reduïm l'expressió de la proteïna Survival Motoneuron (SMN) en les motoneurones fins a nivells representatius de la forma severa de la malaltia. L'estudi morfològic i de viabilitat en aquestes cèl·lules ens facilitarà la identificació dels mecanismes moleculars implicats en la malaltia.Els resultats presentats en aquesta tesi impliquen l'activació de CaMKIV en la regulació de la supervivència de les motoneurones; proporcionen nous coneixements sobre les vies de regulació que en provoquen la seva degeneració (nivells de potassi elevats al medi extracel·lular i Calpaïna), i demostren alteracions d'aquestes neurones en un models d'Atròfia Muscular Espinal (degeneració neurítica i mort). / La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y muerte de las motoneuronas representa una información importante de conocimiento básico y para el establecimiento de potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades que cursan con degeneración y muerte de estas neuronas. Por este motivo hemos dedicado este trabajo al estudio de:a) Mecanismos intracelulares básicos dependientes de calcio que modulan la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo.Como efecto inductor de supervivencia hemos analizado la participación de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneuronas embrionarias de pollo, y demostramos que su activación calcio dependiente, induce la fosforilación de Akt y supervivencia de estas neuronas. Por otro lado, como a efecto inductor de muerte demostramos que incrementos de la concentración del calcio intracelular inducidos por la despolarización de la membrana, son responsables de la activación de la proteasa Calpaína y la degeneración de las motoneuronas de ratón. Nuestros resultados apoyan el uso de inhibidores de Calpaína como estrategia neuroprotectora.b) Mecanismos patológicos que causan la degeneración específica de las motoneuronas en Atrofia Muscular Espinal.En esta segunda parte del trabajo, con la finalidad de contribuir a la comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad hemos desarrollado un modelo in Vitro utilizando técnicas de interferencia de RNA. Reducimos la expresión de la proteína Survival Motoneuron (SMN) en las motoneuronas hasta niveles representativos de la forma severa de la enfermedad. El estudio morfológico y de viabilidad en estas células nos facilitará la identificación de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad.Los resultados que presentamos en esta tesis implican la activación de CaMKIV en la regulación de la supervivencia de las motoneuronas; proporcionan nuevos conocimientos sobre las vías de regulación que provocan su degeneración (niveles de potasio elevados al medio extracelular y Calpaína), así como alteraciones específicas de estas neuronas en modelos de Atrofia Muscular Espinal (degeneración neurítica y muerte). / Identification of molecular mechanisms that regulate motoneuron survival and death represent valuable basic knowledge to elucidate potential therapeutic targets for those diseases that imply motoneuron degeneration and death. For this reason in the present work we studied:a) Basic calcium-dependent intracellular mechanisms which modulate motoneuron survival during development.As a pro-survival effect we analysed the role of the calcium/calmodulin dependent protein kinase IV (CaMKIV) in cultured chicken motoneurons. Results demonstrated that CaMKIV activation induces Akt phosphorylation and motoneuron survival. On the other hand, as a prodegenerative effect we demonstrate that in mouse motoneurons depolarization induced excessive calcium influx activates the protease Calpain and causes motoneurons death. Our results suggest that Calpain inhibitors may induce neuroprotective effects.b) Intrinsic motoneuron pathological mechanisms underlying Spinal Muscular Atrophy.In this second part, with the aim to facilitate the understanding of the physiopathology of SMA we developed an in vitro model using RNA interference techniques. We reduce Survival Motoneuron (SMN) protein expression in motoneurons to representative levels from severe Spinal Muscular Atrophy mouse models. Morphologic and survival analysis of these cultured neurons may contribute to the identification of pathologic molecular mechanisms implicated in the disease.Reported results, obtained from the morphological and molecular analysis of primary motoneuron cultures, provide new knowledge on motoneuron development and survival regulating pathways (implication of CaMKIV activation in motoneuron survival regulation), about regulation pathways involved in motoneuron degeneration (high potassium extracellular levels and Calpain activation), as well as motoneuron alterations in a severe SMA culture model (neurite degeneration and death).

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-05-14T20:39:01Z No. of bitstreams: 1 468555 - Texto Completo.pdf: 8199104 bytes, checksum: 8319f77be38697b0864185d6a700fdf3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-14T20:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 468555 - Texto Completo.pdf: 8199104 bytes, checksum: 8319f77be38697b0864185d6a700fdf3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Financiadora de Estudos e Projetos - Finep / Glioblastoma (grade IV) is among the most prevalent primary intracranial tumors and is considered a challenge in oncology and neurosurgery due to the highly aggressive nature, and the elevated mortality rates. The location of the tumor and its invasive nature avoid the standard-of-care therapy, which includes surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy. Nevertheless, the current gold standard treatment has not been effective to prevent tumor evolution, as indicated by the poor survival rates. In this context, we analyzed the GPCRs for kinin and the high-voltagegated calcium channels (VGCC) as feasible new therapeutic approaches in malignant gliomas. Thereby, the signaling triggered by bradykinin or the disruption of calcium signaling might contribute with pivotal mechanisms underlying glioma progression, such as cell proliferation. Therefore, the aim of this study was to further evaluate the relevance of B1 (B1R) and B2 (B2R) kinin receptors as well as the P/Q- and N-type VGCC in glioma development, by using in vitro and in vivo glioma model. Cell culture assay showed that the treatment with the selective B1R des-Arg9-BK (1-100 nM) and B2R BK (1-100 nM) agonists induced a marked enhancement of cell proliferation and viability through ERK1/2 and PI3K/Akt signaling, according to evaluation of U-138MG and U-251MG cell lines. Meanwhile, the incubation of either B1R SSR240612 (1-30 ?M) or B2R HOE-140 (1-100 ?M) antagonists induced a marked cell death with mixed apoptosis/necrosis characteristics. The in vivo mouse model of GL261-induced glioma of C57/BL6 or B1R and B2R knockout mice showed an uncontrolled tumor growing in KOB1R mice. Conversely, there was no significant change of the tumor development in KOB2R mice. Notably, the genetic ablation or the pharmacological combined antagonism of B1R and B2R (SSR240612; 25 nmol/site + HOE-140; 50 pmol/site) diminished the tumor progression as well as the mitotic index of the GL261-induced glioma. To understand the potential anti-tumor effects of the blockade of P/Q- and Ntype VGCC, we used animal-derived inhibitors namely PhTx3-3 (P/Q-type blocker) and Ph?1? (N-type blocker) from P. nigriventer, or MVIIC (P/Q-type blocker) and MVIIA (N-type blocker) from C. magus. The PhTx3-3 (0.3 - 100 pM), Ph?1? (0.3 - 100 pM) and MVIIA (0.3 - 100 pM) displayed a significant inhibitory effect on proliferation and viability of M059J, U-138MG and U-251MG glioma tested cell lines, and evoked cell death mainly with apoptosis characteristics. In the glioblastoma in vivo model, the Ntype VGCC blockade by either Ph?1? (50 pmol/site; i.c.v. and i.t.) or MVIIA (10pmol/site; i.c.v.) caused significant reductions of glioma growth and progression. Of note, the N-type inhibition by Ph?1? and MVIIA led to a marked increase of GFAPactivated astrocytes and Iba-1-positive microglia in the peritumoral area, which might be related to the inhibitory effects of immune system in tumor development. Using molecular and pharmacological approaches, our data provide clear evidence on the beneficial effects of the simultaneous inhibition of both B1R and B2R as well as the P/Q- and N-type blockade on glioma development. Thus, we propose that the combined selective antagonism of B1R and B2R, such as the P/Q-, and especially NP type high-VGCC inhibition could markedly modify the tumor progression, which might represent an attractive alternative for the treatment of malignant gliomas in the future. / O glioblastoma apresenta a maior incid?ncia entre todos os gliomas e se caracteriza como o mais agressivo e fatal (grau IV) dos tumores prim?rios do SNC. Atualmente o glioblastoma ? considerado uns dos grandes desafios da oncologia e da neurocirurgia, devido ao seu car?ter altamente agressivo. A sobrevida m?dia dos pacientes ? bastante baixa e o progn?stico ? desfavor?vel, j? que a grande maioria destes tumores apresenta um padr?o difuso e infiltrativo de crescimento, o que dificulta as abordagens atuais para a terapia tumoral. Neste estudo foram analisados os efeitos dos receptores da fam?lia dos GPCRs de cininas e dos canais de c?lcio voltagem dependentes (CCVD) como base para poss?veis alvos no tratamento dos gliomas malignos, a fim de caracterizar novas abordagens terap?uticas. O efeito da sinaliza??o desencadeada pela BK e da sinaliza??o Ca2+-dependente pode estar envolvida na regula??o do crescimento e progress?o dos gliomas e na migra??o das c?lulas tumorais. Neste sentido, este trabalho visou explorar o papel dos receptores B1 (B1R) e B2 (B2R) de cininas e da sinaliza??o de Ca2+ via CCVD tipo-P/Q e -N em modelo de glioma in vitro e in vivo. Ensaios em cultura celular utilizando as linhagens de glioma humano U-138MG e U-251MG demonstraram que a ativa??o dos B1R e B2R pelo uso dos agonistas desarg9-BK (1-100 nM) e BK (1-100 nM) aumentou a prolifera??o das linhagens celulares testadas, atrav?s da ativa??o das vias ERK1/2 e PI3K/Akt. Enquanto que a exposi??o aos antagonistas seletivos para estes receptores, SSR240612 (1-30 ?M) e HOE-140 (1-100 ?M), provocou intensa morte celular com caracter?sticas de necrose/apoptose. A parte in vivo compreendeu a t?cnica de implante das c?lulas GL261 de glioma (grau IV) em animais C57/BL6 e knockout para os B1R e B2R. A dele??o apenas do B1R provocou um importante crescimento tumoral nos animais knockout para este receptor, enquanto que os animais com dele??o de B2R n?o tiveram o desenvolvimento tumoral alterado. Notavelmente, tanto a dele??o g?nica como o antagonismo farmacol?gico combinado dos receptores B1 e B2 (SSR240612; 25 nmol/s?tio + HOE-140; 50 pmol/s?tio) diminuiu o crescimento tumoral e o ?ndice mit?tico dos gliomas implantados. Para compreender o envolvimento dos CCVD tipo-P/Q e -N na fisiopatologia dos gliomas foram utilizadas fra??es da toxina da aranha Phoneutria nigriventer (PhTx3-3 bloqueadora de canais do tipo-P/Q; Ph?1? bloqueadora de canais do tipo-N) e ?-conotoxinas provenientes do Conus magus (MVIIC bloqueadora de canais do tipo-P/Q; MVIIA bloqueadora de canais do tipo-N). Os experimentos in vitro evidenciaram que o bloqueio dos canais de Ca2+ tipo-P/Q e -N pelas toxinas PhTx3-3 (0.3 - 100 pM), Ph?1? (0.3 - 100 pM) e MVIIA (0.3 - 100 pM) inibiram a prolifera??o e a viabilidade das linhagens celulares M059J, U-138MG e U-251MG de glioma humano, com intensa caracter?stica de morte celular por apoptose. Os resultados utilizando o modelo de glioblastoma in vivo, demonstraram que ambas as toxinas bloqueadoras dos canais do tipo-N, Ph?1? (50 pmol/s?tio) e MVIIA (10 pmol/s?tio), foram efetivas em diminuir o crescimento e a progress?o tumoral nos animais tratados, com intensa ativa??o de astr?citos e micr?glia, destacando o poss?vel envolvimento do sistema imune na inibi??o do crescimento tumoral. Atrav?s do uso de ferramentas moleculares e farmacol?gicas, nossos resultados demonstraram o envolvimento importante tanto dos B1R e B2R de cininas, como dos CCVD tipo-P/Q e -N no desenvolvimento dos gliomas malignos. Desta maneira, podemos propor que o bloqueio farmacol?gico combinado de antagonistas seletivos para os receptores B1 e B2, assim como a inibi??o dos CCVD tipo-P/Q e -N surgem como potenciais alvos terap?uticos no manejo dos tumores cerebrais e podem representar alternativas promissoras no tratamento dos gliomas.

Orientador : Silvio Sanches Veiga / Co-orientador : Waldemiro Gremski / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular Molecular. Defesa: Curitiba, 14/09/2004 / Inclui bibliografia / Resumo: Estudando o extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, detectamos uma atividade lítica sobre moléculas de ácido hialurônico. O extrato de cerdas também foi capaz de degradar condroitim sulfato purificado, porém, incapaz de hidrolisar moléculas de heparam sulfato e dermatam sulfato. Além disso, por meio de ensaios de cinética de degradação de ácido hialurônico, observamos que esta atividade lítica é causada por uma enzima do tipo hidrolase e não do tipo liase. Baseando-se no método colorimétrico descrito por Reissig et al (1955), concluímos que esta hidrolase atua como uma enzima do tipo ß- endohexosaminidase originando resíduos terminais de açúcares Nacetilglucosamina após a lise do ácido hialurônico, ao invés de agir como uma enzima do tipo ß-endoglucuronidase que, por sua vez, gera resíduos de ácido glucurônico. Análises do extrato de cerdas por zimografia resultaram na identificação de moléculas com atividade lítica sobre o ácido hialurônico com mobilidade eletroforética difusa de 49kDa e 53kDa. Uma avaliação da atividade destas moléculas em função do pH mostrou que estas enzimas não apresentam atividade aparente em pH abaixo de 5,0 e acima de 8,0 e indica que a faixa de pH ótimo para a atividade enzimática está entre 6,0 e 7,0. Por fim, através de reação de fluorescência e análise em microscopia confocal, pudemos comprovar a ação de clivagem do extrato de cerdas sobre o ácido hialurônico organizado na matriz extracelular de derme de coelho. Estes dados nos fornecem evidências experimentais sobre a presença de hialuronidases no extrato de cerdas de L. obliqua, que possivelmente, podem estar envolvidos com os efeitos nocivos desencadeados no envenenamento. Inúmeros constituintes moleculares diferentes têm sido estudados a partir dos produtos de secreção da lagarta L. obliqua e entre eles se destacam as serinoproteases com atividade pró-coagulante e/ou fibrinogenolítica. Com base nestes dados, consideramos a hipótese de identificar e caracterizar um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta com possível função de proteção contra suas próprias toxinas, ou mesmo, com função tóxica durante os acidentes. Experimentos utilizando fibronectina como substrato protéico para diferentes proteases (tripsina, elastase, quimiotripsina, proteinase K, papaína, pepsina e colagenase V) foram realizados na presença de hemolinfa. O perfil de degradação da fibronectina foi avaliado por ensaios de Western Blotting utilizando anticorpos que reconhecem fibronectina. A atividade proteolítica da tripsina, elastase, quimiotripsina e proteinase K foi inibida pela hemolinfa da lagarta. Esta atividade inibitória detectada foi avaliada sob diferentes temperaturas de incubação, mostrando que o inibidor de protease presente na hemolinfa é funcional a 4, 20, e 37°C. Além disso, experimentos adicionais mostraram que esta atividade inibitória da hemolinfa também ocorre quando tripsina é incubada com diferentes substratos protéicos (fibrinogênio, laminina e vitronectina). Com o intuito de purificar a molécula do inibidor de protease, alíquotas de hemolinfa bruta de L. obliqua foram submetidas a ensaios de cromatografia de gel filtração utilizando resina Sephadex G-100 seguidos de ensaios de cromatografia de afinidade utilizando resina tripsinaagarose. As frações eluídas das cromatografias foram monitoradas para a presença de proteínas por absorbância em 280nm e submetidas à incubação com fibronectina e tripsina para detecção da atividade inibitória observada por SDS-PAGE 7,5%. Para fortalecer este resultado foi realizado um zimograma reverso, utilizando gelatina como substrato, em que as frações com atividade inibitória foram avaliadas. Sob estas condições, identificamos um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta L. obliqua com mobilidade eletroforética na região de 21kDa. Com o objetivo de avaliar o grau de reversibilidade da inibição da atividade proteolítica pela ação do inibidor de protease, alíquotas de tripsina pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia foram submetidas a experimentos de zimograma com gelatina impregnada. Com isso pudemos observar que a interação inibidor-protease é resistente ao SDS e à eletroforese gerando alteração na mobilidade da tripsina mas não inativando irreversivelmente a sua atividade. Especulando sobre uma futura aplicação biotecnológica deste inibidor, realizamos um experimento, para avaliarmos a possível inibição da ação da molécula de trombina quando na presença de fibrinogênio em solução, em que trombina foi pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia de gel filtração e depois adicionada à uma solução de fibrinogênio. Pudemos observar que, respeitando uma característica importante dos inibidores de protease que possuem aplicações no campo terapêutico, o inibidor de serinoprotease da hemolinfa da lagarta L. obliqua não foi capaz de inibir a atividade da trombina, uma importante enzima da cascata de coagulação / Abstract: By studying Lonomia obliqua (caterpillar) bristles extract we were able to detect a lytic activity on purified hyaluronic acid. Also, the bristle extract hydrolyses purified chondroitin sulphate, but was unable to degrade either heparan sulphate or dermatan sulphate. Moreover, through purified hyaluronic acid-degrading kinetic assays, we observed that this lytic activity was caused by a hydrolase instead a lyase enzyme. In addition, by using the colorimetric reaction of Reissig (1955), we detected this hyaluronic acid hydrolase action as a ß-endohexosaminidase enzyme originating terminal N-acetylglucosamine residues instead a â-endoglucuronidase that might originate glucuronic acid residues. Zymogram analysis of the bristle extract detected 49kDa and 53kDa molecules with hyaluronic acid lytic activity. An examination of these hyaluronic acid degrading activities as function of pH showed that these hydrolases had no apparent activities at pH below 5.0 and higher than 8.0 and displayed their optimal activities at pH ranging from 6.0 to 7.0. Finally, through a fluorescence reaction to hyaluronic acid and confocal microscopy, we further comproved this cleaving action upon hyaluronic acid organised on the extracellular matrix of the rabbit dermis. The data provide experimental evidence of the presence of hyaluronidases in the L. obliqua bristle extract, probably involved on the harmful effects of the venom. Several different molecular constituents have been described in L. obliqua secretion products and among them serineproteases with procoagulant and fibrinogenolytic activity were identified in its bristles. Based on these results, we have considered the hypothesis of identifying a serineprotease inhibitor in caterpillar haemolymph with possible self defense function against their own toxins or even deleterious activities during accidents. Experiments using fibronectin as a protein substrate for different proteases such as trypsin, elastase, chymotrypsin, proteinase K, papain, pepsin and collagenase V were performed in the presence and absence of haemolymph. Fibronectin degradation profile was evaluated by Western Blotting assays using antibodies that recognize fibronectin. The proteolytic activities of trypsin, elastase, chymotrypsin and proteinase K were inhibited by incubation with L. obliqua haemolymph. This inhibitory activity was also evaluated at different temperatures showing that the inhibitor is functional at 4, 20, and 37°C. In addition, experiments showed that this inhibitory activity also occurs when trypsin was incubated with different substrates such as fibrinogen, laminin and vitronectin molecules. With the goal of purify the inhibitor molecule, haemolymph was submitted to a Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by an affinity chromatography using trypsin-agarose. Eluted fractions were monitored for the presence of proteins by absorbance at 280nm and were submitted to incubation with fibronectin and trypsin for detection of inhibitory activity that was observed by SDS-PAGE 7,5%. To ensure this result, a reverse zymography of the fractions with activity was performed using gelatin as substrate. Under these conditions, we were able to identify a trypsin inhibitor with a diffuse eletrophoretic mobility apparently at 21kDa region in L. obliqua haemolymph. Next, we studied the mechanism by which haemolymph serine protease inhibitor inactivates proteases. Trypsin was incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and then electrophoresed by using a SDS-PAGE (experimental procedure that is able to separate protease from protease inhibitor in case of reversible inhibition), followed by a gelatin-zymogram. This assay suggest that protease inhibitor interaction with trypsin was resitent to SDS and electrophoretic separation conditions, altered trypsin mobility but did not inactivate its proteolytic activities in a unreversible manner. Then, speculating about the biotechnological applications of this protease inhibitor, we evaluated the ability of this molecule inhibit the thrombin activity upon fibrinogen. Aliquots of thrombin were pre-incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and, then, incubated with fibrinogen solution. This result showed that the haemolymph serine protease inhibitor is unable to block fibrinogen-thrombin dependent clotting in vitro, as well as waited for all protease inhibitors use.

Programa de Pós-Graduação em Ensino de Ciências. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2015-12-15T17:32:16Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ConstruçãoSignificativaConceitos.pdf: 2568670 bytes, checksum: ad24fd39dbdbcc85f795e5a2da8094dd (MD5) / Approved for entry into archive by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-12-15T18:06:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ConstruçãoSignificativaConceitos.pdf: 2568670 bytes, checksum: ad24fd39dbdbcc85f795e5a2da8094dd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-13T16:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ConstruçãoSignificativaConceitos.pdf: 2568670 bytes, checksum: ad24fd39dbdbcc85f795e5a2da8094dd (MD5) Previous issue date: 2015 / A proposta central deste trabalho foi introduzir o uso de mapas conceituais em sala de aula como recurso de aprendizagem para alunos do primeiro ano do ensino técnico em agroindústria integrado ao médio, em uma escola pública do município de Salinas/MG. Esse trabalho consistiu em uma pesquisa de campo que recorreu à observação participante com uma avaliação mediada por uma abordagem quali-quantitativa. As atividades foram desenvolvidas em sala de aula, seguindo o plano de aula do professor, e os mapas conceituais foram construídos conjuntamente em três momentos distintos: no início da proposta, durante e no final do conteúdo trabalhado. Foi proposto o conteúdo de respiração celular por ser um conteúdo que apresenta certa complexidade, e por ser um tema que exige do aluno um aprendizado significativo, colaborando, assim, com as propostas pedagógicas do curso técnico em questão. O trabalho de exposição, aplicação, construção e análise dos dados transcorreram em um período de quatro semanas, sendo duas aulas semanais de 50 minutos cada. Os dados foram coletados por meio dos mapas produzidos pelos alunos, testes para análise de conhecimento prévio, registros produzidos pelos participantes, diário de campo do pesquisador, com base em questionários semiestruturados, respondidos pelos alunos. A análise qualitativa dos dados foi feita através da análise de conteúdo dividida em blocos temáticos e categorias. Com a pesquisa foi possível analisar o potencial e as limitações em promover a participação do aluno no seu próprio aprendizado, a externalização do conhecimento prévio, o estímulo, a negociação, a construção, a relação e a aquisição de significados por meio da construção do mapa conceitual, durante a aprendizagem do conteúdo de respiração celular. Concluímos que mapas conceituais para a temática respiração celular podem ser caracterizados como uma ferramenta pedagógica capaz de favorecer um ensino significativo e prazeroso, dando suporte a uma participação mais ativa dos alunos na busca e aplicação do conhecimento. Finalmente esta pesquisa permitiu o desenvolvimento de um livreto de apoio pedagógico que orienta e estimula professores a fazerem uso de mapas conceituais envolvendo o tema respiração celular ou qualquer outra temática biológica relevante para o aprendizado dos alunos. _________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The central proposal of this study was to introduce the use of concept maps in classroom as a learning resource for first year students of technical education in agribusiness integrated into high school education, in a public school in the city of Salinas / MG. This work was consisted of a field research that appealed to participant observation with an assessment mediated by a quali-quantitative approach. The activities were developed in the classroom following the teacher's lesson plan and concept maps were built together in three different moments: at the beginning of the proposal, during it and at the end of worked content. Cellular respiration was proposed as content due to having a certain complexity and being a topic that requires a significant learning from student, thus contributing with their practical technical course. The exhibition work, application, construction and data gathering had a time of four weeks, being two classes per week for 50 minutes each. Data were collected through maps produced by students, tests for analysis of prior knowledge, records produced by participants, researcher's field diary based on semi-structured questionnaires answered by students. Qualitative data analysis was done through content analysis divided into thematic blocks and categories. Through research, it was possible to analyze the potential and limitations to promote student participation in their own learning, outsourcing of prior knowledge, stimulation, negotiation, construction, relationship and acquisition of meanings through construction of conceptual maps, during learning of cellular respiration content. We conclude that concept maps for the thematic cellular respiration can be characterized as an educational tool able to foster a meaningful and enjoyable teaching, given support to a more active participation of students in the pursuit and application of knowledge. Finally this research allowed the development of a pedagogical support booklet that guides and encourages teachers to make use of concept maps involving cellular respiration theme or any other relevant biological theme for student learning.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Educação. Programa de Pós-Graduação em Educação / Made available in DSpace on 2012-10-22T04:45:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T19:46:11Z : No. of bitstreams: 1 205538.pdf: 2098614 bytes, checksum: 754456e9c5d7c1b1d3e9030f9284e77e (MD5) / Esta tese analisa a produção acadêmica em Ensino de Biologia desenvolvida em programas nacionais de pós-graduação, no período entre 1972 a 2000. Inicialmente apresentam-se as características gerais de 130 textos de teses e dissertações identificados através do Catálogo Analítico de teses e dissertações, bem como por meio dos resumos avulsos, obtidos através do CEDOC-UNICAMP, com destaque para: ano de defesa, autor, orientador, instituição onde o estudo foi desenvolvido, titulação acadêmica e nível de ensino priorizado. Os dados apontam um crescimento surpreendente da área, principalmente na década de 90. Num segundo momento, o estudo considera de modo particular 77 pesquisas, com as quais se realizou uma análise histórico-epistemológica. Levaram-se em conta pesquisas que investigaram teses e dissertações em Educação, em Educação Matemática e em Ensino de Ciências, as quais forneceram subsídios para a construção de um referencial analítico para os trabalhos sobre Ensino de Biologia, fundamentado na epistemologia de Fleck (1986), mais especificamente nas categorias "estilo de pensamento", "coletivo de pensamento", "circulação intracoletiva e intercoletiva de pensamento". A explicitação do conteúdo das teses e dissertações, objeto desta tese, sobretudo dos problemas investigados, referenciais teóricos de apoio e procedimentos metodológicos adotados, permitiu apresentar e argumentar que ao longo do período estudado diferentes perspectivas, principalmente de ordem epistemológica e educacional, balizaram a produção acadêmica em Ensino de Biologia. A análise permitiu localizar e caracterizar transformações ocorridas em vários pressupostos que fundamentam as investigações realizadas ao longo das três décadas consideradas. Evidencia-se que a área transitou de uma pesquisa centrada em problemas que emergem exclusivamente das atividades organizadas a fim de subsidiar ações docentes e enfrentadas a partir de uma perspectiva empirista-positivista, para uma pesquisa cujos problemas levam em conta tanto as atividades docentes como as dos alunos, mas tendo como pressupostos epistemológicos concepções não-empiristas, das quais emerge uma concepção de sujeito # cientistas, professores, alunos e pesquisadores em Ensino de Biologia #, cuja característica mais marcante é a de ser não apenas ativo, mas sobretudo não-neutro. Argumenta-se, com base nas premissas fleckianas, que os grupos de pesquisadores em Ensino de Biologia podem ser compreendidos como constituindo coletivos de pensamento que compartilham premissas epistemológicas, educacionais e metodológicas que se transformaram à medida que a área de Ensino de Biologia vai se constituindo. Conclui-se que atualmente os problemas investigados pela área são definidos e enfrentados tendo como premissas basicamente as concepções compartilhadas por dois coletivos de pensamentos.

Orientador : Hermogenes de Freitas Leitão Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T13:39:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tamashiro_JorgeYoshio_M.pdf: 8636620 bytes, checksum: 21c10d72ed032e6ba8772407338fadda (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: O gênero Piptadeinia Benth. S. l. possui distribuição pantropical. BRENAN (1995) propôs a divisão deste gênero em outros 8 no Brasil ocorrem 6: Goldmania, Newtonia, Anadenanthera, Piptadenia, Parapiptadenia e Pseudopiptadenia e destes paneas o primeiro não foi constatado no presente trabalho. Foram estudadas 18 espécies na região Sul-Sudeste. O estudo da arquitetura foliar mostrou-se eficiente para as espécies observadas. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The genus Piptadenia Benth. S. l. has paantropical distribution. Brenan (1955) proposed division of this genera into others 8 and in Brazil occur 6: Goldmania, Newtonia, Anadenanthera, Piptadenia, Parapiptadenia and Pseudopiptadenia and of this only the first ween1t report in this work 18 species were studied from South-Southeast. The study of foliar architecture showed efficient for the species observed. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Estas enzimas, que são amplamente encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilham de estruturas similares. A presença de urease em várias bactérias patogênicas (Helicobacter pylori e Proteus mirabilis, p.e) está fortemente correlacionada com a patogênese em doenças humanas. Muitos fungos de importância médica possuem atividade ureásica, entre eles citamos Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, e espécies de Trichosporon e Aspergillus. C. neoformans é uma levedura que produz vários fatores de virulência conhecidos, como presença de cápsula polisacarídica, produção de melanina e capacidade de desenvolvimento a 37ºC. A maioria de isolados clínicos produz grandes quantidades de urease e muitos autores sugerem que a urease de Cryptococcus exerça uma função importante na patogênese, porém com mecanismos ainda não esclarecidos. Cryptococcus gattii – sorotipo B, tipo molecular VGII, linhagem R265, com capacidade de infectar pacientes imunocompetentes, causou uma epidemia na Ilha de Vancouver (Canadá) entre 1999 e 2003. Neste trabalho desenvolvemos um procedimento de purificação e apresentamos a caracterização físico-química e cinética da urease de C. gattii, cepa R265, após ter sido purificada na razão de 539 vezes. A massa molecular estimada foi de 120 kDa, Km 2,0 mM para uréia, pH ótimo 8,0. O ácido acetohidroxâmico demonstrou ser um bom inibidor em concentrações micromolares, enquanto ρ-hidroximercuriobenzoato causou inibição em concentrações mais altas, comparado a outras ureases. Espera-se que estudos adicionais com essa urease purificada permitam investigar propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica e estabelecer sua contribuição para a patogênese da criptococose. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These enzymes, which are found in fungi, bacteria, and plants show very similar structures. The presence of urease in many pathogenic bacteria (Helicobacter pylori and Proteus mirabilis) is strongly correlative with pathogenesis in human diseases. Many medically important fungi have urease activity, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, and species of Trichosporon and Aspergillus. C. neoformans is a heterothallic yeast with several known virulence factors, including a polysaccharide capsule, melanin production, and the ability to grow at 37°C.The majority of clinical isolates produce large amounts of urease and several authors suggest that Cryptococcal urease play an important role in pathogenesis but with unclear mechanisms but probably by different routes dependent and independent of ureolytic activity, althought many questions are unclear. We wanted to further investigate the role of urease in biological properties by using Cryptococcus gattii as a pathogen model. C. gatti – serotype B, molecular type VGII, R265 strain, which has capacity to infect immunocompetent individuals, caused an outbreak on Vancouver Island in Canada from 1999 to 2003. This work presents the physicochemical characterization of a urease from C. gatti strain R265 after a 539 fold purification. The estimated native molecular mass was 120 kDa, Km 2.0 mM urea, pH optimum 8.0. Aceto hydroxamic acid was a strong inhibitor at low concentration while ρ-hidroxy mercuribenzoate needed higher concentrations for inhibition compared to other ureases.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-03-20T14:23:49Z No. of bitstreams: 1 DIS_CATIELI_GOBETTI_LINDHOLZ_COMPLETO.pdf: 610881 bytes, checksum: 802c9e980339f9212a7fbe652acc4378 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T14:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_CATIELI_GOBETTI_LINDHOLZ_COMPLETO.pdf: 610881 bytes, checksum: 802c9e980339f9212a7fbe652acc4378 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / The Leishmaniasis is a complex of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania spp., observed in the promastigote forms (flagellated, extracellular) in invertebrate hosts, and amastigote forms (no scourge, intracellular required) in vertebrates. Nowadays, these diseases are distributed in 88 countries in the Americas, Africa, India, Asia and the Mediterranean. According to the World Health Organization, 500.000 and 1.5 million new cases, respectively of Visceral Leishmaniasis and Cutaneous Leishmaniasis occur annually, and considered one of the infectious and parasitic diseases of major global impact. Transmitted at the moment the blood feeding by the female sandflies (Diptera: Psychodidae), Leishmaniasis is the shown to expand in all regions of Brazil, placing the country among the five most affected in the world. In Brazil, many studies have been carried out to elucidate the species responsible for the transmission of Leishmania spp., and consequently, prescribe important areas of to public health. However, these approaches are uncommon in the Rio Grande do Sul state. This study aimed to investigate the sandfly species occurring in a rural area in Itapu? district, city of Viam?o, metropolitan region of Porto Alegre, and verify the presence of DNA of Leishmania spp. in captured females. The collections were carried out with CDC light traps in intradomicile, peridomicile and forest remnants to verify possible population or species differences among the sites. The captures occurred for three consecutive nights, from May 2013 to April 2014. The sandflies were identified and females were grouped in pools of five animals each, according to the species. A total of 516 phlebotomines were captured, pertaining belonging to the Lutzomyia neivai (37.2%), Lutzomyia migonei (34.5%), Lutzomyia fischeri (21.7%), and Lutzomyia lanei (6.5%). For DNA extraction, 245 females were used. Fragments of 120 bp of conserved region of Leishmania kinetoplast were amplified from samples of Lutzomyia neivai, L. fischeri and L. migonei. / As Leishmanioses s?o um complexo de doen?as causadas por protozo?rios do g?nero Leishmania spp., observados nas formas promastigota (flagelada, extracelular) nos hospedeiros invertebrados, e forma amastigota (aus?ncia de flagelo, intracelular obrigat?rio) nos vertebrados. Atualmente, estas doen?as encontram-se distribu?das em 88 pa?ses nas Am?ricas, ?frica, ?ndia, ?sia e Mediterr?neo. Segundo a Organiza??o Mundial da Sa?de (OMS), estima-se que 500 mil novos casos de Leishmaniose Visceral (LV) e 1,5 milh?es de novos casos de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) ocorram anualmente, sendo considerada uma das doen?as infecto-parasit?rias de maior incid?ncia mundial. Transmitidas no momento do repasto sangu?neo pelas f?meas de flebotom?neos (Diptera: Psychodidae), as Leishmanioses se mostram em expans?o em todas as regi?es brasileiras, colocando o pa?s entre os cinco mais afetados no mundo. No Brasil, muitas pesquisas t?m sido desenvolvidas no intuito de esclarecer as esp?cies respons?veis pela transmiss?o de Leishmania spp., e consequentemente, apontar ?reas de import?ncia ? sa?de p?blica. A LTA chegou a capital do RS em 2002 e ainda s?o escassos os estudos de esp?cies transmissoras neste Estado. Este estudo teve como objetivo investigar as esp?cies de flebotom?neos ocorrentes em uma localidade rural no distrito de Itapu?, munic?pio de Viam?o, regi?o metropolitana de Porto Alegre, e verificar, a presen?a de DNA de Leishmania spp. nas f?meas capturadas. As capturas foram realizadas com armadilhas luminosas tipo CDC (Center for Diseases Control) em ambiente intradomiciliar, peridomiciliar e mata, a fim de verificar poss?veis diferen?as populacionais e/ou espec?ficas entre os locais. As capturas ocorreram durante tr?s noites consecutivas, no per?odo de Maio de 2013 a Abril de 2014. Os flebotom?neos coletados foram identificados taxonomicamente e as f?meas foram agrupadas em pools de cinco indiv?duos cada, de acordo com esp?cie. Um total de 516 flebotom?neos foi capturado, pertencentes ?s esp?cies Lutzomyia neivai (37,2%), Lutzomyia migonei (34,5%), Lutzomyia fischeri (21,7%), e Lutzomyia lanei (6,5%). Para extra??o de DNA foram utilizadas 245 f?meas. Foram amplificados fragmentos de 120 pares de bases referentes ? regi?o conservada do kDNA de Leishmania em amostras de Lutzomyia neivai, Lutzomyia fischeri e Lutzomyia migonei.