A terapia gênica consiste em introduzir uma sequência de nucleotídeos, codificante ou não-codificante, que tenha a capacidade de interferir na progressão de uma doença por ativação, inativação ou modulação da expressão de um gene alvo. Uma das rotas de transferência gênica é a ex vivo. Essa rota consiste em realizar a modificação gênica ex vivo de um tipo celular do organismo afetado, seguida do transplante celular no indivíduo para a correção do fenótipo. Dentre os vários vetores virais utilizados para transferência gênica, o sistema lentiviral é considerado um dos mais eficazes, visto que é capaz de manter altos níveis de expressão a longo prazo. Além disso, dentre os vetores virais que se integram no genoma, esse é considerado o mais seguro, tendo apresentado apenas um caso com relatado de efeito colateral sem reação adversa. Uma nova tecnologia utilizada para padronizar sistemas biológicos é a biologia sintética. Essa tecnologia pode ser utilizada como ferramenta para produzir e/ou otimizar sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse terapêutico. O objetivo desse trabalho é gerar um vetor lentiviral sintético, para terapia gênica ex vivo, para reposição enzimática. Foram geradas quatro linhagens celulares humanas com produção transiente das proteínas terapêuticas Prot_Ctr e Prot_Mut sob controle dos promotores CMV e HeF1a. Para padronização do ensaio de transfecção, foram geradas duas linhagens celulares humanas que expressão da proteína fluorescente verde (GFP) sob controle dos mesmos promotores citados acima. Como controle negativo das linhagens produtoras da proteína terapêutica, foi gerada uma linhagem como vetor plasmidial vazio pLV_GTW_Mock. O nível de expressão do mRNA relativo às proteínas terapêuticas variou de 3.581,95 ± 1.322 a 10.377,18 ± 2.562 URE, não havendo diferenças significativas entre as linhagens produzidas (p > 0,05). O nível de produção da proteínas terapêuticas variou de 30,98 UI/mL a 241,1 UI/mL. A linhagem com maior produção dessa proteína foi a 293T/HeF1a_Prot_Mut, e essa diferença é significativa (p < 0,05). A partir da transfecção dos plasmídeos auxiliares e plasmídeo portador do cDNA que codifica a Prot-Mut na linhagem celular 293-T foi obtido o vetor lentiviral com título de 1,68x107 pLV/mL. Em conclusão, é possível gerar um vetor lentiviral funcional portador da Prot_Mut para utilização em terapia gênica ex vivo. Espera-se que o produto desse projeto de pesquisa gere uma patente. Para evitar a quebra de novidade, atividade inventiva e suficiência descritiva, requisitos mínimos de patenteabilidade, os resultados foram apresentados sem mencionar a doença e o gene em estudo / Gene therapy involves introducing a nucleotide sequence, coding or non-coding that can to interfere with the progression of a disease by activating, inactivating or modulating the expression of a target gene. One of the gene transfer routes is the ex vivo. This route consists in producing a ex vivo gene modification of a cellular kind of the affected organismo, following the transplant of those cells to correct the fenotype. Among the various viral vectors used for gene transfer, the lentiviral system is considered one of the most effective, since it is able to maintain high levels of long-term expression. Between the viral vectors that integrate into the genome, the lentiviral system is considered the safest, and It has only filed a case with reported side effect without adverse reaction. A new technology used to standardize biological systems is the synthetic biology. This technology can be used as a tool to produce and/or optimize expression systems for production of proteins of therapeutic interest. The aim of this study is to generate a synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy, for enzyme replacement therapy. It were generated four human cell lines with transient production of therapeutic proteins Prot_Ctr and Prot_Mut under the control of CMV and HeF1a promoters. To standardize the transfection assay were generated two human cell lines expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the same promoters cited above. As a negative control of the producing cell lines, It was generated a human cell line with an empty plasmid vector pLV_GTW_Mock. The level of mRNA expression relative to the therapeutic proteins ranged from 3581,95 ± 1322 to 10377,18 ± 2562 REU, there were no significant differences among the produced cell lines ( p > 0.05 ). The production level of therapeutic proteins ranged from 30.98 IU/mL to 241.1 IU/mL. The cell line with the highest production of the therapeutic protein was 93T/HeF1a_Prot_Mut+, and this difference is significant (p < 0.05 ). From the transfection of the plasmid containing the cDNA encoding the Prot_Mut and packing plasmid It was obtained lentiviral vector with the titer 1,68x107 pLV/mL. In conclusion, it is possible to generate a functional lentiviral vector carrying the Prot_Mut for use in ex vivo gene therapy. It is expected that the product of this research project generates a patent. To avoid breaking novelty, inventive activity and descriptive sufficiency, minimum requirements for patentability, the results were presented without mentioning the disease and the gene under study

p. 1-65 / Submitted by Antonio Geraldo Couto Barreto (ppgms@ufba.br) on 2013-10-08T13:13:03Z No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso(pbarroso@ufba.br) on 2013-10-08T16:57:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-08T16:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) Previous issue date: 2013 / A Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica, endêmica em 62 países e representa um sério problema de saúde pública no Brasil. Os testes sorodiagnósticos convencionais empregam antígenos inteiros ou extratos solúveis que limitam a padronização do antígeno, e podem gerar reações cruzadas com outras doenças. Um método alternativo é o uso de peptídeos a partir de epitopos de célula B identificados através de ferramentas de bioinformática. Objetivou-se identificar epitopos lineares e conformacionais de célula B das proteínas de Leishmania infantum cisteína peptidase calpaina-like, redutase thiol dependente 1 (TDR1) e HSP70, bem como identificar sua estrutura secundária através de metodologia in silico; em seguida, buscou-se selecionar os epitopos lineares comuns aos diferentes métodos de predição para verificar a composição dos resíduos de aminoácidos dos mesmos. Metodologia: As ferramentas de bioinformática IEDB, BepiPred e BcePred foram usadas para predição de epitopos lineares de célula B e o programa CBtope para predição de epitopos conformacionais. A estrutura secundária das proteínas foi predita pelo servidor PHD. Resultados: As análises de predição produziram um total de 148 epitopos lineares e 164 epitopos conformacionais a partir das três proteínas, a maioria desses epitopos está localizada na mesma região. A estrutura secundária das proteínas é composta por -hélice, fita estendida e randômica. Nas proteínas TDR1 e HSP70, os epitopos preditos estão localizados principalmente em regiões de -hélice e randômica. Conclusões: Epitopos lineares e conformacionais de célula B de proteínas de L. infantum foram identificados in silico e poderão contribuir como novos antígenos com potencial aplicação no diagnóstico e controle da leishmaniose visceral. Sugere-se que vários métodos de predição de epitopos lineares sejam combinados a fim de se obter resultados mais confiáveis. / Salvador

p. 1-65 / Submitted by Antonio Geraldo Couto Barreto (ppgms@ufba.br) on 2013-10-04T11:30:48Z No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2013-10-30T19:39:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T19:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_Luciana_VERSÃO FINAL.pdf: 730192 bytes, checksum: 547f5cb7e2a72752f841739831892186 (MD5) Previous issue date: 2013 / A Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica, endêmica em 62 países e representa um sério problema de saúde pública no Brasil. Os testes sorodiagnósticos convencionais empregam antígenos inteiros ou extratos solúveis que limitam a padronização do antígeno, e podem gerar reações cruzadas com outras doenças. Um método alternativo é o uso de peptídeos a partir de epitopos de célula B identificados através de ferramentas de bioinformática. Objetivou-se identificar epitopos lineares e conformacionais de célula B das proteínas de Leishmania infantum cisteína peptidase calpaina-like, redutase thiol dependente 1 (TDR1) e HSP70, bem como identificar sua estrutura secundária através de metodologia in silico; em seguida, buscou-se selecionar os epitopos lineares comuns aos diferentes métodos de predição para verificar a composição dos resíduos de aminoácidos dos mesmos. Metodologia: As ferramentas de bioinformática IEDB, BepiPred e BcePred foram usadas para predição de epitopos lineares de célula B e o programa CBtope para predição de epitopos conformacionais. A estrutura secundária das proteínas foi predita pelo servidor PHD. Resultados: As análises de predição produziram um total de 148 epitopos lineares e 164 epitopos conformacionais a partir das três proteínas, a maioria desses epitopos está localizada na mesma região. A estrutura secundária das proteínas é composta por -hélice, fita estendida e randômica. Nas proteínas TDR1 e HSP70, os epitopos preditos estão localizados principalmente em regiões de -hélice e randômica. Conclusões: Epitopos lineares e conformacionais de célula B de proteínas de L. infantum foram identificados in silico e poderão contribuir como novos antígenos com potencial aplicação no diagnóstico e controle da leishmaniose visceral. Sugere-se que vários métodos de predição de epitopos lineares sejam combinados a fim de se obter resultados mais confiáveis. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2018-02-05T18:15:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T18:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / As abordagens de Biologia Sintética possuem potencial de aumentar a produção de ferramentas diagnósticas adequadas para utilização na prática, como os biossensores de DNA. O controle dos sistemas biológicos permite o aprimoramento de tecnologias em uso e surgimento de novas tecnologias, como o diagnóstico molecular através da identificação de sequências específicas de DNA. A maioria dos métodos moleculares de diagnóstico de DNA se baseiam em hibridização. Contudo, atualmente, as proteínas ligadoras de DNA tem tido destaque, devido às suas numerosas vantagens. As principais vantagens são a identificação de sequências em DNA dupla-fita, eliminando o passo de desnaturação, e a alta especificidade pelo alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína sintética quimérica para aplicação em sistema biossensor de DNA que permitirá rápida identificação de uma sequência específica de DNA de Corynebacterium striatum, um importante patógeno emergente. Foi construída, neste estudo, uma proteína quimérica biossensora composta por: (I) um domínio de ligação ao DNA derivado de proteínas TALEs (proteínas efetoras do tipo ativadores transcricionais) o qual reconhece especificamente uma sequência de 18 pb de um gene único de C.striatum codificador de uma permease para transporte de ferro; combinado a (II) uma cromoproteína tsPurple (Tinsel Purple) para permitir detecção visual da sequência alvo. Para construção do gene codificador da proteína TALE específica, o gene específico de C. striatum foi analisado com a ferramenta Tal Effector Nucleotide Targeter (Cornell University) e uma sequência-alvo de 18pb foi definida. A construção de domínios TAL foi realizada utilizando a ferramenta GeneArtTM Perfect Match TAL (Thermo Scientific); o gene sintético encontra-se clonado no plasmídeo pTALE. Para construir as sequências gênicas quiméricas, foram desenhados primers de PCR para isolamento da sequência da tsPurple com a adição de sítios artificiais de restrição para EcoRI e BamHI; os produtos de PCR digeridos foram clonados no plasmídeo pTALE, downstream à sequência da TALE específica. Essas sequências fusionadas foram então sub-clonadas em um vetor de expressão pDESTTM17, através de recombinação utilizando tecnologia Gateway para expressão das proteínas quiméricas. A expressão da proteína quimérica foi induzida pela adição de 1mM de IPTG. A expressão da proteína quimérica foi confirmada através de análises de SDS PAGE 10% , que demonstraram a superexpressão da proteína esperada de 151kDa; além disso, foi observada a forte coloração roxa no precipitado bacteriano, em razão da funcionalidade da cromoproteína TsPurple.

Orientador: Danielle Biscaro Pedrolli / Resumo: Os métodos de indução da expressão gênica disponíveis para linhagens bacterianas envolvem a adição de compostos indutores ao meio de cultura (por exemplo, isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo, xilose e arabinose), o que é indesejável para linhagens industriais, pois encarece o processo produtivo. Já a utilização da expressão constitutiva, alternativa à indução, pode ocasionar stress metabólico durante a fase lag de crescimento quando são utilizados promotores fortes. O objetivo do trabalho foi construir e padronizar um novo modelo de indução da expressão gênica para linhagens bacterianas industriais. O novo modelo de autoindução baseado no sistema de quorum-sensing bacteriano, permitindo que a célula se automonitore e induza a expressão gênica durante a fase exponencial de crescimento, eliminando assim não só a necessidade de adição de composto indutor como a necessidade de monitoramento da densidade celular pré-indução. Realizou-se amplificação e clonagem dos genes luxR e luxI, com e sem caudas de histidina, e suas respectivas sequências regulatórias de Aliivibrio fischeri, em plasmídeo contendo os genes responsáveis pela bioluminescência ou fluorescência com códons otimizados para Bacillus subtilis. Em seguida, foi realizada transformação e a integração do plasmídeo no cromossomo de B. subtilis. A funcionalidade do sistema foi avaliada em diferentes etapas de crescimento microbiano com o auxílio de um leitor de microplacas durante intervalos regulares. O sistema de autoind... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Current methods available for the autoinduction of gene expression in genetically engineered bacterial strains require addition of inducing compounds to the culture medium (e.g. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, xylose, and arabinose), which is undesirable for industrial strains due to additional costs to the production process. Alternatively, constitutive gene expression is employed. However, the later can possibly cause metabolic stress during the lag growth phase if strong promoters are employed. The objective of this work was to construct and to standardize a new model for induction of gene expression in industrial bacterial strains. The new model is based on an autoinduction process triggered by the bacterial quorum-sensing system. It allows the cell to monitor itself and induce its own gene expression during the exponential growth phase, thereby eliminating both the need for an external inducing compound and the need for monitoring pre-inducing cell density. Bacterial cultures were grown in rich media, supplemented or not with antibiotics. Amplification and cloning of luxR and luxI genes, with and without histidine tags, and their respective regulatory sequences of Aliivibrio fischeri, were performed on a plasmid containing the genes responsible for bioluminescence or fluorescence with codons optimized for Bacillus subtilis. Next, transformation and integration of the plasmid into the B. subtilis chromosome were performed. The functionality of the system was evalua... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Conforme novas tecnologias e metodologias estão surgindo, e pesquisadores estão sedentos por ferramentas moleculares mas rápidas, mais eficientes e fáceis de usar, dominar os princípios e tecnologias do design de vetores e padronização de partes biológicas tornaram-se desafios fundamentais. Isso está abrindo espaço para o surgimento de uma disciplina inteiramente nova chamada Biologia Sintética. Esta área de estudo inovadora combina partes e módulos biológicos para criar sistemas mais confiáveis e robustos. Linhagens fúngicas são comumente alvo desses estudos, não apenas porque muitos achados fundamentais em relação à clonagem molecular surgiram das lições dadas por elas, mas também devido a um imenso e inexplorado potencial desses organismos em uma ampla gama de aplicações - desde biocombustíveis e produção de químicos finos até terapias biomédicas. Neste contexto, a presente dissertação é dividida em duas partes: a primeira diz respeito ao design e construção de uma ferramenta modular e versátil para ser aplicada em várias linhagens de fungos. Essa ferramenta é um plasmídeo binário para transformação mediada pro Agrobacterium tumefaciens, que foi construído em quatro diferentes versões contendo GFP ou mCherry como proteínas repórter e um gene sintético de resistência à higromicina como marcador de seleção. O vetor foi validado em Paracoccidioides lutzii, um patógeno oportunista humano dimórfico que é muito importante para medicina, mas ainda carecia de ferramentas genéticas eficientes. A segunda parte consiste na criação de uma biblioteca de promotores para a levedura oleaginosa Rhodosporidium toruloides, um promissor hospedeiro para a produção de bioprodutos a partir de biomassa, uma vez que pode eficientemente consumir açúcares C5 e C6 e aromáticos derivados da lignina. Vinte e nove promotores foram testados em um cassete de duplo-repórter - compreendendo ambas as proteínas fluorescentes GFP e mRuby - utilizando citometria de fluxo para análise de células únicas. A coleção de promotores apresentados neste trabalho é a maior disponível para R. toruloides até o momento e foi um avanço indispensável para superar a10 escassez de ferramentas para este organismo. Notavelmente, também apresentamos os primeiros promotores bidirecionais descritos para essa levedura e otimizamos o protocolo de transformação. Portanto, a Biologia Sintética foi eficientemente aplicada para expandir a coleção de partes biológicas padronizadas e otimizar vetores para transformação e manipulação genética de fungos. Estas ferramentas são de valor imediato e são aplicáveis a desafios muito distintos, mas igualmente importantes: a busca de novas soluções para a saúde humana e para uma economia bio-sustentável. / As new technologies and methodologies are surfacing, and researchers are now eager for fast, enhanced and easy-to-use molecular tools, mastering the principles and technologies of vector design and standardization of biological parts have become fundamental challenges. This is making room for the rise of an entirely novel discipline called Synthetic Biology. This innovative field of study combines biological parts and modules to create more reliable and robust systems. Fungal strains are commonly the target of these studies, not only because several fundamental findings regarding molecular cloning arose from lessons given by them, but also due to an immense and much unexplored potential of those organisms in a wide range of applications - ranging from biofuels and fine chemicals production to biomedical therapies. In this context, the present dissertation is divided in two parts: the first one concerns the design and construction of a modular and versatile tool to be applied in several fungal strains. This tool is a plasmid binary vector for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, which was built in four different versions containing either GFP or mCherry as reporter proteins and a synthetic hygromycin resistance gene as selection marker. The vector was validated in Paracoccidioides lutzii, a dimorphic human opportunist pathogen that is very important for health care but was still lacking efficient genetic tools. The second part consists in the creation of a promoter library for the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides, a promising host for the production of bioproducts from biomass since it can efficiently consume C5 and C6 sugars and lignin-derived aromatics. Twenty-nine promoters were tested with a dual-reporter cassette - comprising both GFP and mRuby fluorescent proteins - using flow cytometer for single-cell analysis. The assortment of promoters presented in this work is the largest set available for R. toruloides until now and was an imperative advancement to overcome the scarcity of tools for this organism. Remarkably, we also presented the first bidirectional promoters described for this yeast and optimized the transformation protocol. Thus, we efficiently applied Synthetic Biology to expand the collection of standard biological parts and to12 optimize vectors for fungal transformation and genetic manipulation. These tools are of immediate value and are applicable for very distinct but equally important challenges: the pursuit of new solutions for human health and for a sustainable biobased economy