SUMMARYThe diversity of cancer molecular origins associated with the genetic variability of patients has encouraged the development of chemotherapeutic treatments adapted not only to the target tumor, but also to a specific patient. This personalized strategy is based on cancer biomarkers allowing a better identification and characterization of each tumor where predictive biomarkers provide the distinction between various factors indicative of the response to the treatment. In this context, several studies highlighted the role of the solute carrier transporter family 22 (solute carriers 22 or SLC22) in the uptake of platinum anticancer drugs. This mechanism being not well understood, our work intends to establish the potential role of SLC22 member A18 (SLC22A18) as predictive biomarker in the aim to help to a better targeted chemotherapeutic strategy for each patient. We optimized a system overexpressing SLC22A18 stably or transiently in HeLa cancer cell line. SLC22A18 expression was confirmed by qRT-PCR, western blotting, microscopy and flow cytometry. The cell lines were treated with taxane, anthracyclin, vinca alkaloid and nitrosoureas anticancer drug families. We showed that doxorubicin, camptothecin, chloroquine, tetracycline and carmustin had no effect on the cell viability assays suggesting that they are not substrates of SLC22A18. Interestingly, the cell line was sensitized in the presence of antimitotic drug with a sensitivity factor of 2.7 in the presence of paclitaxel, 1.4 with docetaxel, 1.8 with vinblastin and 2.2 in the presence of vincristine. To confirm these results, we elaborated a SLC22A18 knockdown cell line in HS683 cells using siRNA technology. The downexpression of SLC22A18 was correlated to a tendency to resist to the accumulation of paclitaxel thereby confirming the previous results. Simultaneously, a knockout cell line was established using the transcription activator-like effectors nuclease (TALEN) technology in U373 cell line. Our studies constitute a robust base of knowledge for further investigation on SLC22A18 transporter as a predictive biomarker promoting antimitotic treatment in tumors where this transporter is detected. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tumeurs sont, au moins en partie, des maladies de la régulation du cycle cellulaire. Le point de restriction (R) est un point fondamental du cycle cellulaire où les cascades de signalisation mitogéniques (y compris leurs perversions oncogènes) et l'état métabolique des cellules sont intégrés pour engager le cycle de division cellulaire. Les CDK4 et CDK6 sont les premières CDKs à être activées en réponse aux signaux de prolifération cellulaire.En initiant la phosphorylation inactivatrice de l'oncosuppresseur central pRb, les CDK4 / 6 liées aux cyclines D jouent un rôle essentiel dans le passage du point R et donc dans la décision de multiplication cellulaire, en particulier dans la plupart des cellules cancéreuses dans lesquelles l'activité de CDK4 est fortement dérégulée. Les médicaments inhibiteurs de CDK4 / 6 sont maintenant évalués dans la plupart des cancers dans de nombreux essais cliniques. Le plus avancé (Palbociclib-PD0332991) a été approuvé en 2015 par la FDA pour le traitement des cancers métastatiques du sein. Notre groupe a identifié la phosphorylation activatrice sur la Thr172 comme l'étape hautement régulée qui détermine l'activation de CDK4. La question de savoir si les phosphorylations de CDK4 et de CDK6 sont catalysées par la seule « CDK-activating kinase » (CAK, cycline H-CDK4-Mat1) reste incertaine. En utilisant des cellules de cancer colorectal (HCT116) exprimant une version de CDK7 spécifiquement inhibable (dite « analog sensitive »), nous avons participé à une étude qui démontre, d’une part, une implication cruciale de la CDK7 dans la phosphorylation / activation de CDK4 et CDK6 et, d’autre part, l'existence de kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 différente(s) de la CDK7. De plus, cette étude a démontré que l'activité de la CDK7 était conditionnée, au moins en partie, par la liaison de p21 à la CDK4, laquelle augmentait en réponse à l'inhibition de CDK7. L’augmentation de cette liaison coïncidait avec la disparition de la phosphorylation la plus abondante de p21, que nous avons localisée (par des analyses d'électrophorèse bidimensionnelle) sur la Ser130 et que nous avons montré être catalysée par la CDK4 et la CDK2. De manière surprenante, la phosphorylation sur Ser130 de p21 était inhibée non seulement par l'inhibition de CDK7, mais également par la Roscovitine et le CR8 (inhibiteurs de CDK2) et le Palbociclib. Ensemble, ces observations suggèraient que l'inactivation de pRb et le passage de R sont contrôlés par des mécanismes de rétroaction positive dépendants de la CDK7 médiés par la phosphorylation de la p21 par la CDK4 et la CDK2 pour faciliter et maintenir l'activation de la CDK4. De plus, nos résultats confirmaient l’hypothèse de l'existence kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 autre(s) que la CDK7. Notre groupe avait démontré précédemment que la régulation de la phosphorylation de la CDK4 ne s'applique pas à son homologue CDK6, ce qui s'expliquait par l'absence d'une proline critique dans le domaine phosphoaccepteur (QMALTPVVVT dans CDK4 vs QMALTSVVVT dans CDK6). Ces données iniquaient que la ou les kinase (s) responsable(s) de la phosphorylation sur Thr172 de CDK4 devrai(en)t être dirigée(s) par la proline 173 uniquement présente dans la CDK4 (« proline-directed kinase(s) »).L'objectif principal de cette thèse est l'identification de kinase(s) impliquée(s) dans cette phosphorylation. Nous avons donc sélectionné une liste restreinte de « proline-directed kinases » (PDK) requises pour la prolifération cellulaire. Parmi celles-ci, les JNK, qui sont des PDKs, sont des interacteurs de p21 et CDK4 et peuvent avoir un rôle oncogène. De manière importante, nous avons observé que les JNKs, mais pas la CAK / CDK7, phosphorylaient in vitro la p21 et la CDK4 liée aux cyclines D. Les JNKs phosphorylaient également p21 sur ses trois sites P-T/S (Thr57, Ser130, Ser98). En mutant ces sites (T57A, S130A, S98A, T57A / S130A), nous avons montré que la phosphorylation de p21 par les JNKs n'est pas nécessaire pour la phosphorylation et l'activation de la CDK4 liée à p21. Par conséquent, in vitro les JNKs peuvent activer les complexes CDK4 liés à la p21, en agissant d’une part comme des kinases phosphorylant directement la CDK4 dans les complexes de cycline D-CDK4 stabilisés par la liaison de p21 et d’autre part en phosphorylant indépendamment des résidus de p21 impliqués dans l'activation de CDK4 dépendante de la CAK. Pour démontrer la relevance in vivo du rôle des JNKs comme kinases activatrices de la CDK4, nous avons analysé l'effet de leur inhibition dans les lignées de cellules tumorales T98G et MCF-7, les cellules MEF et des cellules CHO transfectées: dans tous ces cas, l'inhibition des JNKs, y compris l'inhibition spécifique de l'activité de JNK2 par une approche de génétique chimique en collaboration avec le groupe de Roger Davis, a réduit l'entrée du cycle cellulaire, et la phosphorylation et l'activation des complexes de cycline D1-CDK4. De manière intéressante, l’activation des complexes de cycline D3-CDK4 n’était pas affectée par l’inhibition des JNKs, apparemment parce que ces complexes étaient principalement associés à la p27 plutôt qu’à la p21. Mis ensemble, ces différents résultats nous amènent à proposer un nouveau modèle dans lequel différentes kinases activatrices de la CDK4, y compris les JNKs (indépendamment des phosphorylations de p21) et la CAK/CDK7 (de manière dépendante des phosphorylations de p21), coopèrent pour initier et maintenir l'activation de la CDK4 et générer la décision du cycle cellulaire. Cette nouvelle compréhension pourrait révéler de nouveaux mécanismes ciblables dans une perspective thérapeutique anti-cancéreuse. / Tumors are, at least in part, diseases of cell cycle regulation. The restriction (R) point is a fundamental point of the cell cycle in which mitogenic signaling cascades (including their oncogenic perversions) and cell metabolic status are integrated to commit the cell division cycle. CDK4 and CDK6 are the first CDKs to be activated in response to cell proliferation signals. By initiating the inactivating phosphorylation of the central oncosuppressor pRb, cyclin D-bound CDK4/6 play an essential role at the passage through R and thus in the cell multiplication decision, especially in most cancer cells in which CDK4 activity is highly deregulated. CDK4/6 inhibitory drugs are now evaluated in many clinical trials against most cancers, and the most advanced (Palbociclib-PD0332991) was approved in 2015 by FDA for treatment of metastatic breast cancers. Our group has identified the activating Thr172 phosphorylation as the highly regulated step that determines CDK4 activation. Whether CDK4 and CDK6 phosphorylations are catalyzed by the sole CAK (cyclin H-CDK7-Mat1) remains unclear. In analogue-sensitive CDK7 (as/as) mutant HCT116 cells in which CDK7 can be specifically inhibited, we participated to a study demonstrating a crucial CDK7 involvement in phosphorylation/activation of CDK4 and CDK6 and existence of non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Moreover, this study demonstrated that CDK7 activity was conditioned, at least in part, by p21 binding to CDK4, which increased in response to CDK7 inhibition. This coincided with disappearance of the most abundant phosphorylation of p21, which was localized (by 2D-gel electrophoresis analyses) at Ser130 and found to be catalyzed by both CDK4 and CDK2. Surprisingly, Ser130 p21 phosphorylation was not inhibited only by CDK7 inhibition, but also by Roscovitine and CR8 (CDK2 inhibitors) and Palbociclib. All together, these observations suggested that pRb inactivation and R passage are controlled by CDK7-dependent positive feedbacks mediated by p21 phosphorylation by CDK4 and CDK2 to sustain CDK4 activation. Importantly, these results confirm the hypothesis of a non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Our group has previously demonstrated that the regulation of CDK4 phosphorylation does not apply to its homologue CDK6, which was explained by the lack of a critical proline in the phospho-acceptor domain (QMALTPVVVT in CDK4 vs QMALTSVVVT in CDK6). These data have indicated that the activity of kinase(s) responsible for Thr172 phosphorylation of CDK4 should be directed by the unique proline 173 of CDK4 (proline-directed kinase(s)). The primary objective of this thesis is the identification of kinase(s) involved in this phosphorylation. We thus selected a shortlist of proline-directed kinases (PDKs) required for cell proliferation. Among them JNKs, which are PDKs, are interactors of p21 and CDK4 and can have an oncogenic role. Importantly, we observed that JNKs, but not CAK/CDK7, did phosphorylate CDK4 in vitro in their complexes with cyclins D stabilized by p21 binding. JNKs also phosphorylated p21 in the three P-T/S phosphorylation sites (Thr57, Ser130, Ser98). Mutating p21 phosphorylation sites (T57A,S130A,S98A,T57A/S130A) we also demonstrated that in vitro, the phosphorylation of p21 by JNKs is not required for the phosphorylation and activation of p21-bound CDK4. Therefore, in vitro JNKs might activate p21-bound CDK4 complexes by acting as a direct CDK4-activating kinases for cyclin D-CDK4 complexes stabilized by p21 binding and also by independently phosphorylating p21 residues involved in CAK-dependent activation of CDK4. To demonstrate the relevance of the role of JNKs as possible CDK4-activating kinases in vivo we analyzed the effect of their inhibition in T98G and MCF-7 tumor cell lines, MEFs and transfected CHO cells: in all these cases, inhibition of JNKs, including specific inhibition of JNK2 activity by a chemical genetic approach in collaboration with Roger Davis group, reduced the cell cycle entry and phosphorylation and activation of cyclin D1-CDK4 complexes. Interestingly, the activation of cyclin D3-CDK4 complexes was not affected by the JNK inhibition, apparently because these complexes were mainly associated with p27 instead of p21. Putting together all these results, we propose a new model in which different CDK4-activating kinases, including JNKs (independently of p21 phosphorylation) and CAK/CDK7 (dependently on p21 phosphorylation), cooperate to initiate and maintain the activation of CDK4 and generate the cell cycle decision. This new understanding may reveal new druggable mechanisms and anti-cancer therapeutic targets. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez les eucaryotes, le complexe kinase TORC1 (Target Of Rapamycin Complex 1) joue un rôle central dans le contrôle de la croissance cellulaire. Il intègre de nombreux signaux et agit en modulant l’état de phosphorylation de différents effecteurs, principalement des protéines impliquées dans des processus anaboliques ou cataboliques. Parmi ces signaux, on distingue notamment les acides aminés. Ces derniers agissent sur TORC1 via l’action de protéines de la famille des GTPases Rag, elles-mêmes régulées par des facteurs GEF et GAP. Des études récentes sur des cellules mammifères ont mis en évidence l’existence de senseurs d'acides aminés, capables de moduler l'activité des facteurs GEF et GAP. Chez la levure, ces senseurs restent toutefois inconnus. Chez la levure, TORC1 contrôle la fonction de plusieurs protéines y compris des transporteurs d'acides aminés de la membrane plasmique, comme la perméase générale des acides aminés, Gap1. C’est via sa branche de signalisation Tap2-PP2A/Npr1 que TORC1 contrôle l'ubiquitylation et le trafic intracellulaire de ces transporteurs, et ceci, en modulant l’activité d’adaptateurs de type α-arrestine de l'ubiquitine-ligase Rsp5.Dans ce travail, nous avons combiné des approches de génétique et de biochimie chez la levure afin d’étudier la régulation de TORC1 et son rôle dans l'endocytose en réponse au substrat de Gap1, la perméase générale des acide aminés, et de Can1, la perméase spécifique de l'arginine.Dans la première et la deuxième partie de ce travail, je décris ma contribution à l'étude qui visait à élucider le mécanisme d'ubiquitylation de Gap1 et de Can1 induite par le transport de leurs substrats. Le modèle déduit de ce travail propose que cette régulation négative n'est pas due à l'accumulation intracellulaire des acides aminés transportés, mais à un changement conformationnel des perméases, couplé à la réaction de transport et qui fait apparaitre un état ouvert vers l'intérieur, entraînant ainsi le remodelage de la queue cytoplasmique N-terminale et en conséquence l’exposition d'un site de liaison caché pour des adaptateurs de Rsp5 de type α-arrestine. Dans le cas de Can1, l'α-arrestine principale impliquée est Art1 et doit être stimulée via TORC1. Cependant, les α-arrestines Bul1/2, impliquées dans la régulation négative de Gap1, sont capables de promouvoir son ubiquitylation induite par le transport de substrat, qu'elles aient ou non été stimulées via TORC1. Nous fournissons également des preuves que d'autres perméases d'acides aminés spécifiques (Mup1, Lyp1) sont régulées par leurs propres substrats d'une manière similaire à Can1.Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié le mécanisme par lequel le transport des acides aminés chez la levure stimule l'activité de TORC1 via les GTPases Rag, Gtr1 et Gtr2. En analysant en Western Blot l’état de phosphorylation de Npr1 et Sch9, deux kinases effectrices de TORC1, nous avons révélé que le signal général qui déclenche l'activation Gtr-dépendante de TORC1 est le flux de H+ couplé au transport des acides aminés généré par des symporteurs H+/acide-aminés. Dans ce contexte, nous avons identifié la pompe à H+ de la membrane plasmique, Pma1, comme étant un régulateur essentiel de l'activité de TORC1. L'activité de transport de Pma1 étant elle-même stimulée par une augmentation des protons cytosoliques, nous suggérons que Pma1 module TORC1 par un effet de signalisation.Collectivement, nos résultats fournissent de nouvelles perspectives sur le rôle central de TORC1 dans le contrôle des transporteurs de nutriments chez la levure. / The Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1) plays a pivotal role in controlling cell growth in probably all eukaryotic organisms. It operates by integrating upstream signals like growth factors and nutrients to modulate by phosphorylation multiple downstream effectors, mostly proteins involved in anabolic or catabolic processes. Among the various signals that impinge on TORC1, nitrogen sources, in particular amino acids are primordial input signals modulating TORC1 activity through the conserved Rag family of GTPases. Recent studies in mammals have shed the light on the existence of various sensor systems of internal amino acids that modulate the activity of the GEF and GAP factors acting on the Rag GTPases. Yet, in yeast the amino acid sensing events acting upstream of the Rag GTPase (named Gtr1 and Gtr2) regulators remain poorly known. Yeast TORC1 controls the function of many proteins including several plasma membrane amino acid transporters, e.g. Gap1, the general amino acid permease. It does so via the Tap2-PP2A/Npr1-signaling branch that controls the ubiquitylation and intracellular trafficking of these proteins through regulation of α-arrestin-type adaptors of the ubiquitin-ligase Rsp5. In this work, we combined yeast genetics and biochemical assays to study TORC1 regulation by amino acids and to illustrate the role of TORC1 in substrate-transport mediated endocytosis of Gap1 and of the arginine specific permease, Can1. In the first and second part of this work, I describe my contribution to the study that aimed at elucidating the mechanism of substrate-transport-mediated ubiquitylation and endocytosis of Gap1 and Can1. The model deduced from this work states that this down-regulation is not due to intracellular accumulation of the transported amino acids, but to substrate-transport-induced conformational transition of the transporters to an inward-facing state, resulting in remodeling of their N-terminal cytoplasmic tail and subsequent exposure of a hidden binding site for α-arrestin-like adaptors of Rsp5. In the case of Can1, the main α-arrestin involved is Art1 and needs be stimulated via TORC1. The Bul1/2 α-arrestins involved in Gap1 down-regulation, however, are able to promote its substrate-transport-elicited ubiquitylation regardless of whether they have been stimulated via TORC1 or not. We also provide evidence that other specific amino acid permeases (Mup1, Lyp1) are regulated by their own substrates in a manner similar to Can1. In the last part of this work, we investigated how amino acid uptake by yeast cells triggers Rag/Gtr-dependent activation of TORC1. By assaying the phosphorylation on western blot of two TORC1-downstream effectors, the Npr1 and Sch9 kinases, we showed that uptake by Gap1 of ß-alanine, which cannot be used as a nitrogen source, unexpectedly stimulates TORC1 activity. Further analysis of this response allowed us to show that the general signal triggering Gtr-dependent activation of TORC1 in response to amino acid uptake is the influx of H+ coupled to transport via H+/amino-acid symporters. Furthermore, we identified Pma1, the H+-ATPase establishing the H+ gradient at the plasma membrane, as a central player of this control of TORC1 activity. As the transport activity of Pma1 itself is known to be stimulated by an increase of cytosolic protons, we suggest that Pma1 modulates TORC1 via signaling. Altogether, our results provide new insights on the central role of TORC1 in control of nutrient permeases in yeast. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’altération des marques épigénétiques est de plus en plus reconnue comme une caractéristique fondamentale des cancers. Dans cette thèse, nous avons utilisé des profils de méthylation de l’ADN en vue d’améliorer la classification des patients atteints du cancer du sein grâce à une approche basée sur l’apprentissage automatique. L’objectif à long terme est le développement d’outils cliniques de médecine personnalisée. Les données de méthylation de l’ADN furent acquises à l’aide d’une puce à ADN dédiée à la méthylation, appelée Infinium. Cette technologie est récente comparée, par exemple, aux puces d’expression génique et son prétraitement n’est pas encore standardisé. La première partie de cette thèse fut donc consacrée à l’évaluation des méthodes de normalisation par comparaison des données normalisées avec d’autres technologies (pyroséquençage et RRBS) pour les deux technologies Infinium les plus récentes (450k et 850k). Nous avons également évalué la couverture de régions biologiquement relevantes (promoteurs et amplificateurs) par les deux technologies. Ensuite, nous avons utilisé les données Infinium (correctement prétraitées) pour développer un score, appelé MeTIL score, qui présente une valeur pronostique et prédictive dans les cancers du sein. Nous avons profité de la capacité de la méthylation de l’ADN à refléter la composition cellulaire pour extraire une signature de méthylation (c’est-à-dire un ensemble de positions de l’ADN où la méthylation varie) qui reflète la présence de lymphocytes dans l’échantillon tumoral. Après une sélection de sites présentant une méthylation spécifique aux lymphocytes, nous avons développé une approche basée sur l’apprentissage automatique pour obtenir une signature d’une tailleoptimale réduite à cinq sites permettant potentiellement une utilisation en clinique. Après conversion de cette signature en un score, nous avons montré sa spécificité pour les lymphocytes à l’aide de données externes et de simulations informatiques. Puis, nous avons montré la capacité du MeTIL score à prédire la réponse à la chimiothérapie ainsi que son pouvoir pronostique dans des cohortes indépendantes de cancer du sein et, même, dans d’autres cancers. / Epigenetic alterations are increasingly recognised as an hallmark of cancers. In this thesis, we used a machine-learning-based approach to improve breast cancer patients’ classification using DNA methylation profiling with the long term aim to make treatment more personalised. The DNA methylation data were acquired using a high density DNA methylation array called Infinium. This technology is recent compared to expression arrays and its preprocessing is not yet standardised. So, the first part of this thesis was to evaluate the normalisation methods by comparing normalised data against other technologies (pyrosequencing and RRBS) for the two most recent Infinium arrays (450k and 850k).We also went deeper into the evaluation of these arrays by assessing their coverage of biologically relevant regions like promoters and enhancers. Then, we used accurately preprocessed Infinium data to develop a score, called MeTIL score, which shows prognostic and predictive value in breast cancers. We took advantage that DNA methylation can mirror the cell composition to extract a DNA methylation signature (i.e. a set of DNA methylation sites) that reflects presence of lymphocytes within the tumour. After an initial selection of lymphocyte-specific sites we developed a machine-learning-based framework which reduced the predictive set to an optimal size of five methylation sites making it potentially suitable to use in clinics. After conversion of this signature to a score, we showed its specificity to lymphocytes using external datasets and simulations. Then, we showed its ability predict response to chemotherapy and, finally, its prognostic value in independent breast cancer cohorts and even in other cancers. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La vacuole de la levure joue un rôle dans le stockage de nutriments, la dégradation des macromolécules et le recyclage de métabolites. En accord avec ces fonctions, des protéines se trouvant à la membrane vacuolaire catalysent le transport de divers composés à travers la membrane. Ceci permet par exemple à la vacuole d’accumuler un grand stock d’arginine et d’autres acides aminés cationiques ainsi que de mobiliser des acides aminés durant une carence en azote. Par ailleurs, les scientifiques soupçonnent l’existence d’un transporteur de cystéine, essentiel au contrôle redox de la vacuole et à la protéolyse. Afin d’étudier plus en détail le transport d’acides aminés dans la vacuole, nous avons mis au point un protocole d’isolement de vacuoles intactes suivi de tests d’entrée d’acides aminés. Dans un premier temps, cela nous a permis de caractériser pour la première fois un transport de cystéine dans les vacuoles intactes. En combinant des analyses bioinformatiques avec un screening d’une collection de souches mutantes pour une sensibilité à la cystéine ou la cystine (un dimère de cystéine), nous avons pu proposer une liste de gènes candidats codant pour un transporteur de cystéine à la membrane vacuolaire. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la protéine Ypq2 comme un facilitateur de haute affinité catalysant l’export d’arginine hors de la vacuole en condition de carence en azote. En outre, nous avons identifié un nouveau transporteur, Vat1, nécessaire à l’établissement du stock d’arginine vacuolaire. Nos résultats sont conciliables avec l’existence d’un couplage fonctionnel entre les voies de sortie et d’import d’arginine dans la vacuole. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’ARN génomique du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l’hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l’ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l’ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d’une coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN, et grâce à deux sites d’initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5’ UTR, dont l’activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d’initiation eIF3, et permet l’initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d’une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l’étude de l’influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j’ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée « SHAPE », développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l’effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d’étudier la structure secondaire de la 5’ UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l’activité de l’IRES de la 5’ UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l’étude de l’IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l’IRES, à partir des extrémités 5’ et 3’ ont mis en évidence l’existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d’initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L’ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d’initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l’ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l’efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif. / Primate lentiviruses genomic RNA can serve both as an mRNA that encodes for Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. We previously reported the presence of an IRES activity embedded within Gag coding region itself that drives the production of several isoforms of the Gag polyprotein and that is conserved in HIV-1, HIV-2 and SIVmac. In addition, in vitro reconstitution experiments revealed that the initial step of initiation complex formation is the recruitment of the 40S ribosomal subunit and eIF3. The structural and functional conservation amongst lentiviruses indicates that those properties are important for the virus cycle. In order to define the RNA structural determinants responsible for the formation of IRES/eIF3/40S ternary complex, we have been following functional and biochemical approaches in parallel. Our results indicate that 2 distinct binding sites for the ribosome are present close to the 2 AUG codons used as initiation site for the translation. Further biochemical analyses have shown that 2 ribosomes can be recruited by the same RNA molecule. In order to determine the functional role of the IRES activity on gag translation, we assayed in vitro the translation efficiency of mutants unable to recruit the ribosome. In parallel, we have been following a drug screening strategy to identify small molecules that would inhibit the ribosome recruitment. This approach could pave the way to the definition of the IRESgag as a new therapeutic target, and to the identification of new drugs.

Bien que présentes dans tous les écosystèmes lacustres, la composition ainsi que l'abondance des communautés bactériennes peut varier à l'échelle régionale mais également à l'échelle locale. Une meilleure compréhension des facteurs responsables de ces patrons biogéographiques permettrait d'améliorer la connaissance des fonctionnements de ces systèmes aquatiques et donc de leur réponse potentielle face aux pressions anthropiques. Dans ce contexte, cette thèse a visé à étudier la biogéographie du compartiment bactérien dans un ensemble de lacs peu profonds. Les objectifs principaux de cette étude ont été d'évaluer aux échelles régionale et locale les facteurs responsables des patrons biogéographiques pour (i) l'ensemble de la communauté bactérienne et (ii) pour un groupe bactérien spécifique, i.e. les mycobactéries non-tuberculeuses. Pour atteindre ces objectifs deux approches complémentaires ont été entreprises. Tout d'abord, la variabilité spatiale à l'échelle régionale a été évaluée par l'échantillonnage en Ile-de-France de 49 lacs pendant trois étés. Couplé à cette approche, une étude plus fine a été entreprise pour caractériser la dynamique spatiotemporelle du compartiment bactérien par le suivi mensuel pendant deux ans et de six évènements pluvieux importants au sein du lac de Créteil (Val de Marne).À l'échelle régionale, la variabilité spatiale de la structure de la communauté bactérienne pour les trois années de suivi (caractérisé par T-RFLP) a été prédite à hauteur de 76% (r carré moyen) par les processus stochastiques et moins de 14% par les facteurs déterministes incluant les paramètres environnementaux (statut trophique) et les processus de dispersion (connexion du lac à une rivière et les axes PCNM). L'analyse de la composition de la communauté bactérienne par séquençage à haut débit (MiSeq Illumina) a mis en évidence des résultats similaires à ceux acquis par T-RFLP. Cependant, cette analyse a révélé que l'importance des processus impliqués dans les patrons biogéographiques pouvait évoluer en fonction des phylums ou des classes bactériens considérés. La variabilité spatiale des densités de mycobactéries (PCR en temps réel), était quant à elle expliquée à hauteur de 50% par des facteurs déterministes (pH de l'eau, concentration en fer labile et connexion à une rivière).À l'échelle locale, le suivi du lac de Créteil n'a révélé aucune variation spatiale significative (le long des transects horizontal et vertical) de la structure de la communauté bactérienne ainsi que des densités de mycobactéries. Par contre une étude spécifique sur deux lacs a révélé des variations significatives de densité et la diversité des mycobactéries au sein de différents compartiments des lacs. À l'inverse, d'importantes variations temporelles de la structure des communautés bactériennes ont été observées au cours des deux années de suivi, principalement associées aux variations de température de l'eau. Par ailleurs, bien que relativement stable au cours des deux années de suivi, les variations de densités des mycobactéries ont seulement été prédites par les processus stochastiques à hauteur de 35% / Although bacteria are widespread in lacustrine environments, their composition and abundance vary at the regional and also at the local scale. A better understanding of the factors responsible for these biogeographic patterns would improve our knowledge of these aquatic systems and thus their potential response to anthropogenic pressures. In this context, this thesis studied the biogeography of the bacterial compartment in a set of shallow lakes located in the Paris area. The main objectives of this study were to assess at the regional and local scale the factors responsible for the biogeographical patterns on (i) the entire bacterial community, and (ii) a specific bacterial group, i.e. the nontuberculous mycobacteria. To achieve these objectives two complementary approaches were undertaken. First, at the regional scale, the spatial variability was assessed by sampling 49 lakes during three consecutive summers. A finer study was also performed to characterize the spatiotemporal dynamics of the bacterial compartment over a two-year monthly monitoring and during six important rain events within the Créteil Lake (Val de Marne).At the regional scale, the spatial variability of the bacterial community structure for the three summers (assessed by T-RFLP) was predicted for 76% (mean r-squared) by stochastic processes and less than 14% by deterministic factors including environmental parameters (trophic status) and dispersal-related process (connection to a river and PCNM axes). The analysis of the bacterial composition by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq) showed similar tendencies to those acquired by T-RFLP. However, this analysis revealed that the importance of the processes involved in biogeographical patterns could vary according to the bacterial phyla or classes considered. Spatial variability of mycobacterial densities (real time PCR) was explained up to 50% by deterministic factors (water pH, amount of labile iron and connection to a river).At the local scale, the monitoring of Creteil Lake revealed no significant spatial variation (along the horizontal and vertical transect) on the structure of the bacterial community and mycobacterial densities. However, a specific study of two lakes showed that mycobacterial density and diversity significantly varied among the different compartments of the lakes. Inversely, significant temporal variations on the bacterial community structure were observed over the two-year of monitoring, mainly related to water temperature changes. Although mycobacterial densities were relatively stable over the Créteil Lake monitoring, their variations were only predicted by stochastic processes up to 35%

JNK1 (c-Jun N-terminal kinase 1) has been studied in numerous biological phenomena, but its role in skin inflammation diseases has not been fully defined yet. We therefore evaluated the role of JNK1 in imiquimod-induced dermatitis, a classical model that shares many features with human psoriasis. We showed that JNK1 was necessary for the expression of inflammatory markers and for acanthosis induced by imiquimod. We demonstrated that the loss of JNK1 in dendritic cells or myeloid cells reduced inflammatory markers but did not affect acanthosis induced by imiquimod. In vitro experiments in bone marrow-derived macrophages (BMMs) supported the role of JNK1 in the activation of the inflammasome pathway by the Aldara® cream. Next, we observed that the loss of JNK1 in keratinocytes did not reduce imiquimod-induced expression of most inflammatory markers but acanthosis and proliferation of epidermal cells was decreased. To better understand the role of JNK1 in keratinocytes, we evaluated the transcriptome and the epigenomic landscape of JNK1-deficient epidermal cells from mice treated with imiquimod. These data highlighted the potential role of JNK1 downstream of the EGFR pathway. We further observed that the inhibition of the EGFR pathway decreased imiquimod-induced acanthosis. Our work shows the dual role of JNK1 in skin inflammation induced by imiquimod. On one hand, JNK1 influences the expression of inflammatory mediators by myeloid cells, probably through the inflammasome pathway. On the other hand, JNK1 modulates the response of keratinocytes to EGFR ligands. Taken together, these data suggest that JNK1 could represent a valuable therapeutic target for the management of psoriasis. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’acide rétinoïque (AR) est le ligand des récepteurs nucléaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et médient ses effets biologiques. Il est connu que l’AR a des propriétés prodifférenciatrices et antiprolifératives, notamment sur les cellules de l’épithélium mammaire. Une perte de sensibilité de l’AR a toutefois été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires mammaires cancéreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusqu’ici cette perte de sensibilité avait été attribuée à des défauts de la voie de signalisation de l’AR, causée par la perte de l’expression des récepteurs à l’AR dans la tumeur, bien que plusieurs lignées de cellules cancéreuses y soient tout de même très sensibles. Peu d’études se sont intéressées au rôle de la voie de synthèse de l’AR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, l’AR est synthétisé à partir de la vitamine A, ou rétinol, son précurseur sanguin provenant de la diète. Les cellules de l’épithélium mammaire normales ont la capacité de synthétiser l’AR à partir du rétinol. Nos rapportons pour la première fois que l’épithélium mammaire est probablement le siège de la synthèse et de la signalisation de l’AR. Cela est dû, au moins en partie, à l’expression d’une enzyme de synthèse de l’AR, RALDH3, dans l’épithélium mammaire normal. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses de type luminal, qui ont sensibles à l’AR (et qui expriment le récepteur des estrogènes ER, catégorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiquées) n’ont au contraire pas la capacité de sythétiser l’AR, probablement en raison d’une faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous l’effet des estrogènes. Cela pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules proliférent en présence du rétinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthèse de l’AR, et qui partage 70 % d’identité de séquence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de métastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur d’une moindre probabilité de développer des métastases chez les patientes atteintes d’une tumeur luminale. Cela suggère des rôles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos résultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des propriétés enzymatiques très différentes, ce qui est en accord avec cette dernière hypothèse. Nos données suggèrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient être des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons d’exploiter les diffèrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des méthodes de séparation des différentes population de cellules de l’épithélium mammaire ce qui pourrait aider à comprendre le rôle de la synthèse d’AR dans ce tissu. / Retinoic acid (RA) is ligand of nuclear receptors RARs and RXRs that act as ligand-inducible transcription factors and mediate its biological effects. It was shown that RA has antiproliferative and prodifferenciating properties in mammary cells. A loss of RA sensitivity was associated with increased tumorigenicity in the mammary tissue, potentially facilitating the growth of tumors. It’s believed that is was mainly due to deficiencies in the RA signaling pathway, probably caused by the loss of RAR and RXR expressions. However, some tumorigenic cell lines were still reported to be RA sensitive. The role of RA synthesis in mammary tumorigenesis has been poorly characterized. RA is synthezised in target tissues from vitamin A (retinol) its precursor in blood. It was shown that mammary epithelial cells were able to synthesize RA from retinol in vitro. We show here for the first time that RALDH3, an enzyme involved in RA synthesis, is probably responsible for RA synthesis in normal mammary epithelial cells. Our result suggest that luminal cancer cells (that express ER and represent 75 % of breast tumors) have a very low capacity of RA synthesis, probably due to a low estrogen-mediated RALDH3 expression. It might represent a new mechanism of estrogen-driven tumorigenenesis allowing RA senstive tumors to proliferate in the presence of retinol in the blood. It was suggested that RALDH1, an other enzyme of the RA synthesis pathway that shares 70 % of identity with RALDH3, is a marker of mammary stem cells, of more agressive tumors and higher occurance of metastasis. We shown that unlinke RALDH1, RALDH3 is a marker of a lower occurance of metastasis and probably a marker of differentiation, suggesting different roles in the mammary gland for these 2 enzymes. This is in good agreement with our results showing that they have very different enzymatic properties. All together our data suggest that RALDH1 and 3 might be markers of different populations of cells of in the mammary epithelium. We propose to use the differences between RALDH1 and 3 to rationally develop methods and tools to separate and isolate RALDH1- and 3-expressing cells that would help the understand the role of RA synthesis in the mammary gland.

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