La maladie à coronavirus (COVID-19) est une infection virale hautement contagieuse causée par le virus SRAS-CoV-2. La maladie s’est rapidement propagée entrainant une épidémie mondiale, causant la mort des personnes à risque. De nombreuses mesures sanitaires ont été prises durant ces deux dernières années, cependant la maladie n’est pas encore éradiquée. Considérant l’importance du système immunitaire dans le contrôle des maladies infectieuses et dans l’induction d’une mémoire immunitaire de longue durée, le SRAS-CoV-2 pourrait être une cible du système immunitaire, en particulier du système adaptatif représenté par les lymphocytes B et T. La réponse humorale induite chez les personnes convalescentes est largement perçue comme étant efficace pour combattre le virus. Par conséquent, toutes les plateformes de vaccination actuelles se sont basées sur la réponse humorale induite, particulièrement par la protéine SPIKE du virus. Compte tenu de la variabilité des réponses humorales ainsi que leur déclin rapide observé chez certains patients, et l’émergence de variants, il est nécessaire d’inclure d’autres stratégies permettant de renforcer la réponse immunitaire. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse cellulaire pouvait être induite par les lymphocytes T contre les différentes protéines virales du SRAS-CoV-2. Dans cette étude nous avons détecté la réactivité des lymphocytes T contre les protéines virales (SPIKE, membrane, nucléocapside) par ELISPOT chez les patients convalescents. Nous avons ensuite identifié plus précisément les séquences riches en épitopes au niveau de la protéine membranaire et de la nucléocapside en préparant des délétants successifs (approche « mRNA PCR-based epitope chase technique” ou mPec). La validation de ces séquences a été confirmée par l’utilisation de banques de peptides dans des zones définies, se chevauchant de 12 acides aminés. En vue d’inclure ces régions dans une stratégie vaccinale future, une protéine de fusion MN contenant les séquences riches en épitopes a été créée et la réactivité des lymphocytes T contre la protéine MN a été évaluée de nouveau par ELISPOT. Nos données démontrent une réponse T dirigée principalement contre la nucléocapside et la protéine membranaire. Trois zones immunogènes sont identifiées au niveau de la nucléocapside et une zone au niveau de la membrane. La réactivité observée contre la protéine de fusion MN souligne le potentiel pouvoir immunogène des protéines (membrane et nucléocapside) et l’importance d’inclure ces protéines dans une stratégie vaccinale future afin de solliciter une réponse immunitaire cellulaire protectrice. / Coronavirus disease (COVID-19) is a highly contagious viral infection caused by the SARS-CoV-2 virus. The disease has spread rapidly resulting in a worldwide epidemic, causing death in those at risk. Numerous health measures have been taken over the past two years, but the disease has not yet been eradicated. Considering the importance of the immune system in the control of infectious diseases and in the induction of a long-lasting immune memory, SARS-CoV-2 could be a target of the immune system, in particular of the adaptive system represented by B and T lymphocytes. The humoral response induced in convalescent individuals is widely used as an effective therapy to combat the virus. Therefore, all current vaccination platforms have relied on the humoral response induced particularly by the virus' SPIKE protein. Given the variability of humoral responses and their rapid decline in some patients, and the emergence of variants, it is necessary to include other strategies to enhance the immune response. We hypothesized that a cellular response could be induced by T cells against the different viral proteins of SARS-CoV-2. In this study, we detected the reactivity of T cells against viral proteins (SPIKE, membrane, nucleocapsid) by ELISPOT in convalescent patients. We then identified more precisely the immunogenic sequences at the level of the membrane protein and the nucleocapsid by successive deletants using the mRNA PCR-based epitope chase technique (mPec). The validation of these sequences was confirmed by the use of small peptide libraries (overlapping by 12 amino acids), covering defined sequences rich in epitopes. In order to include these regions in a future vaccine strategy, a MN fusion protein containing the selected sequences was created and T cell reactivity against the MN protein was further confirmed by ELISPOT. Our data show a T-cell response primarily against the nucleocapsid and membrane protein. Three immunogenic zones were identified at the nucleocapsid level and one zone at the membrane level. The reactivity observed against the MN fusion protein cassette rich in epitopes, highlights the potential immunogenicity of the proteins (membrane and nucleocapsid) and the importance of including these proteins in a future vaccine strategy.

La cytokinèse est un processus minutieusement régulé par une structure corticale appelée l'anneau contractile d'actomyosine, sous le contrôle de la petite GTPase RhoA. La protéine d'échafaudage Anilline est un effecteur de RhoA et organise les différents éléments de l'anneau permettant sa fermeture. Via son N-terminus, l'Anilline interagit avec la Citron kinase Sticky, la myosine II et l'actine-F ce qui permet la stabilisation de l'anneau contractile et sa maturation en anneau du corps central ou «midbody». Via son domaine C-terminal, l'Anilline interagit avec la RhoA-GTP et les septines pour ancrer l'anneau à la membrane. De précédentes études du laboratoire ont montré que Sticky et les septines ont des actions opposées sur l'Anilline. Nous avons donc défini plusieurs ensembles d'interactions entre l'Anilline et les cytosquelettes d'actomyosine et de septines, qui possèdent des fonctions différentes voire opposées dans la cytokinèse: ce sont des réseaux cytosquelettiques. L'Anilline est ainsi impliquée dans la coordination de ces réseaux opposés et RhoA-dépendants. Nous devons encore déterminer si ces interactions de l'Anilline en N-ter et C-ter peuvent se produire en même temps ou si elles sont mutuellement exclusives pour coordonner les différents éléments cytosquelettiques pendant la fermeture de l'anneau contractile. Les cellules S2 de drosophile ont été utilisées pour déterminer comment l'Anilline coordonnait les réseaux cytosqulettiques de l'anneau contractile. Deux modèles ont été proposés : l'un où une seule molécule d'Anilline se lie simultanément aux réseaux en N-ter et C-ter; l'autre modèle suggère qu'une ou plusieurs populations d'Anilline coordonnent les réseaux de façon mutuellement exclusive. Pour distinguer entre ces deux modèles, des allèles de séparation de fonction de l'Anilline ont été testés : l'AnillinΔ1-5 qui n'interagit plus avec Sticky, ainsi que l'AnillinRBD* qui n'interagit plus avec Rho1-GTP et qui ne recrute plus les septines à l'anneau contractile. Des expériences de sauvetage suite à la déplétion de l'Anilline endogène ont été réalisées et les tentatives de division ont été captées par microscopie en temps réel. L'expression de chaque mutant individuellement menait à une fermeture de l’anneau décalée, ralentie et souvent incomplète. En revanche, la co-expression de l'AnillinΔ1-5 et AnillinRBD* en trans dans les mêmes cellules a restauré la cinétique normale de la fermeture de l'anneau. Ce résultat supporte le modèle des populations multiples d'Anilline. Cette étude avance significativement nos connaissances de l'organisation de l'anneau contractile qui gère la division de toutes cellules animales. / Cytokinesis is a process thoroughly regulated by a cortical structure called the actomyosine contractile ring, under the control of the RhoA GTPase. The scaffolding protein Anillin is a RhoA effector organizing the several elements of the ring, thus permitting its closure. The AnillinN-terminus interacts with the Citron kinase Sticky, Myosin II and F-actin to stabilize the contractile ring and drive its maturation to the midbody ring. The AnillinC-terminus interacts with the RhoA GTPase and the septins to anchor the ring to the membrane. Previous works revealed that Sticky retains Anillin while the septins shed Anillin from the ring. Therefore, Anillin is involved in opposed RhoA-dependent cytoskeletal sub-networks to generate or reduce the tension at the membrane, and their balance is necessary to improve the ring closure. This study aims to decipher the coordination between these opposed sub-networks. We proposed two models : either sub-networks on AnillinN-ter and AnillinC-ter are simultaneously organized by the same molecule of Anillin, or several pools of Anillin coordinate separately the opposed subnetworks. We generated and expressed several inducible Anillin mutants in drosophila S2 cells : AnillinΔ1-5 prevents the interaction with Sticky; AnillinRBD* does not interact with RhoA and perturbs the Anillo-septin assembly. The expression of each mutant individually delayed, slowed down and failed the ring closure. However, co-expression of single mutants in trans rescued the ring closure. Moreover, Sticky over-expression improved AnillinRBD* recruitment in the ring. These results support the multiple pools of Anillin model. This study improves our knowledge on the contractile ring organization, necessary to succeed cytokinesis in animal cells.

Il devient de plus en plus clair que pour traiter efficacement les tumeurs solides, nous devons également nous intéresser au microenvironnement tumoral. Physiologiquement, les zones intratumorales peuvent présenter une disponibilité anormale en nutriments, un pH altéré ou encore des niveaux d’oxygène bas (hypoxie). Il est connu que l’adaptation hypoxique engendre des cellules tumorales qui sont plus difficiles à traiter indépendamment de l’approche thérapeutique. De plus, l’adaptation hypoxique est nécessaire pour la progression tumorale puisque cette dernière favorise des processus tels que: la survie cellulaire, la motilité, l’angiogenèse, le métabolisme du glucose, l’immunomodulation ainsi que la résistance aux médicaments. Ces phénotypes passent par la régulation des ARN messager (ARNm) et des micro ARN (miARN). Pour ces raisons, des efforts importants ont été déployés pour comprendre l’adaptation hypoxique et les interventions thérapeutiques potentielles pouvant la contrer. À l’heure actuelle, il y a un manque de cohérence et de variété dans les protocoles de traitement hypoxique in vitro qui ne tient pas compte des aspects importants de l’hypoxie in vivo, comme la réduction de la disponibilité en éléments nutritifs, la durée de l’exposition hypoxique ainsi que le degré d’hypoxie. Pour mieux simuler le microenvironnement hypoxique in vivo, nous avons développé de nouveaux protocoles hypoxiques in vitro qui visent à simuler ces aspects. Tout d’abord, en utilisant une lignée cellulaire B16-HIF1a-eGFP, nous avons optimisé le stress métabolique à court terme en conjonction avec l’hypoxie pour augmenter la stabilisation de l’HIF1a. Pour déterminer comment le programme HIF1 adapte les cellules à ces différentes conditions, nous avons analysé les données de séquencage d’ARN qui démontrent que le stress métabolique induit un programme transcriptionnel HIF1 plus robuste et diversifié dans les cellules hypoxiques, et que ce dernier est représentatif du stress hypoxique in vivo. Nous avons également identifié de nouveaux miARN induits par l’hypoxie et démontré que notre protocole d’incubation régule davantage les miRNA associés au pronostic négatif du patient. Nous avons aussi étudié l’adaptation hypoxique à long terme et extrême in vitro. Nous avons observé que l’incubation hypoxique à long terme induit une transition épithéliale à mésenchymateuse (TME), indépendante de l’expression différentielle des facteurs de transcription du TME canonique. Ce changement se produit à des niveaux spécifiques d’oxygène, et nécessite une pré-incubation à des niveaux hypoxiques plus faible. Avec ce protocole, nous avons découvert une nouvelle isoforme de WT1 (tWT1), un moteur potentiel du TME. tWT1 commence la transcription dans l’intron 5 du gène WT1, une région avec plusieurs séquences d’ADN contenant des éléments de réponse à l’hypoxie. La protéine tWT1 a une fonctionnalité limitée : elle est localisée au niveau du noyau, et conserve la liaison de l’ADN aux régions précédemment connues. Nous avons aussi identifié l’expression de tWT1 dans les échantillons de patients atteints de leucémie ainsi qu’une isoforme tWT1 potentiellement plus fonctionnelle grâce à des analyses par kmer. Pour cibler ces phénotypes identifiés dans nos expériences d’adaptation hypoxiques, nous avons développé une nouvelle catégorie d’ARN intérférent (ARNi) thérapeutique : le microARN synthétique (synmiR). Les synmiR sont des molécules de RNAi avec des multiples cibles. En utilisant des expériences in vivo, nous avons établi de nouveaux principes de RNAi qui élargissent considérablement l’espace de conception pour les synmiR. Nous avons mis au point deux algorithmes de conception de synmiR distincts et avons testé leur efficacité dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle du génome du VIH in vivo. En conclusion, nous avons montré que l’inclusion de facteurs physiologiques supplémentaires associés à l’hypoxie in vitro entraîne un engagement plus robuste de l’adaptation de l’hypoxie. À ce jour, aucun de nos protocoles d’hypoxie n’a été reproduit dans la littérature. Nous contribuons aux connaissances dans le domaine en décrivant les nouveaux ARNm/miARN induits par l’hypoxie, ainsi que la méthode d’induction fiable de l’EMT par l’hypoxie seulement. Nous faisons également état de l’existence de nouveaux isoformes de WT1 et de leurs liens avec le cancer et l’hypoxie. La connaissance de ces isoformes est importante pour l’avenir de la recherche sur WT1, car elle pourrait faire la lumière sur des résultats auparavant inexplicables. Notre travail dans les synmiR ouvre une nouvelle voie d’investigation pour le traitement de certaines maladies, et fournit un mécanisme d’action testable pour les miRNA endogènes. Une fois suffisamment développés, les synmiR offrent une occasion thérapeutique unique d’exploiter leur multi-ciblage pour avoir un impact spectaculaire sur une seule voie, ou affecter plusieurs voies par le ciblage simultané de gènes clés. / It is becoming increasingly clear that in order to effectively treat solid tumours, we must also address the tumour microenvironment. Physiologically, intratumoral areas may have abnormal nutrient availability, pH, or lower oxygen levels (hypoxia). It is known that hypoxic adaptation results in tumour cells which are harder to treat regardless of therapeutic approach, and hypoxic adaptation is necessary for disease progression due to the induction of tumour promoting phenotypes such as, but not limited to: cell survival, motility, angiogenesis, glucose metabolism, immunomodulation, and drug resistance. This is accomplished through the regulation of both mRNAs and miRNAs. For these reasons, significant effort has been applied to understanding hypoxic adaptation and potential therapeutic interventions. Currently, there is a lack of consistency and protocol variety in in vitro hypoxic treatments that leaves out important aspects of in vivo hypoxia, such as reduced nutrient availability, length of hypoxic exposure, and degree of hypoxia. To better simulate the in vivo hypoxic microenvironment, we have developed new in vitro hypoxic protocols which aim to simulate these aspects. First, using a B16-HIF1α-eGFP hypoxia reporter cell line, we optimized short-term metabolic stress in conjunction with hypoxia to enhance HIF1α stabilization. To ascertain how the HIF1 program adapts the cells to these different conditions, deep transcriptome profiling were performed and demonstrated metabolic stress induces a more robust and diversified HIF1 transcriptional program in cells under hypoxia, which was more representative of in vivo hypoxic stress. We identified novel hypoxia-induced miRNAs as well, and demonstrated our incubation protocol regulated more miRNAs associated with negative patient prognosis. We also investigated long-term and extreme hypoxic adaptation in vitro. Long term hypoxic incubation induced a epithelial to mesenchymal transition (EMT), independent of canonical EMT factor differential expression. This switch occurred at specific oxygen levels, and required pre-incubation at milder hypoxic levels, highlighting the relevance of simulating in vivo hypoxia development in vitro. Through this protocol, we discovered a novel isoform of WT1 (tWT1), a potential driver of our EMT. tWT1 begins transcription within intron 5 of the WT1 gene, a region with several Hypoxia Response Elements DNA sequences. tWT1 retains limited functionality: it is able to localize to the nucleus, and retains DNA binding to previously known gene promoter regions. We also identified the expression of tWT1 in leukemic patient samples as well as a potentially more functional tWT1 isoform through kmer-based analyses. To target these multiple phenotypes identified in our hypoxia adaptation experiments, we worked towards developing a new category of RNA-interference (RNAi) therapeutic, the synthetic microRNA (synmiR). SynmiRs are single-sequence, multi-targeted RNAi molecules. Using in vivo knock-down experiments, we established new RNAi principles which dramatically expand the design space for synmiRs. We developed two philosophically distinct synmiR design algorithms, and validated their efficacy in controlling HIV genome transcriptional activity in vivo. In conclusion, we have shown the inclusion of additional physiological factors associated with hypoxia in vitro results in a more robust engagement of hypoxia adaptation. To date, neither of our hypoxia protocols have been replicated in the literature. We contribute to the literature by describing novel hypoxia induced mRNAs/miRNAs, as well as methods for reliably inducing EMT through hypoxia alone. We also discovered the existence of novel WT1 isoforms and their links to cancer and hypoxia. Knowledge of these isoforms is important for WT1 research moving forward, as it may shed light on previously unexplainable results. Our work in synmiRs opens a new therapeutic avenue for multiple disease states, and provides a testable mechanism of action for endogenous miRNAs. Once sufficiently developed, synmiRs offer a unique therapeutic opportunity to harness their multi-targeting to dramatically impact a single pathway, or affect multiple pathways through simultaneous targeting of key genes.

La stabilité de la longueur des télomères est cruciale pour le maintien de l’intégrité du génome. De nombreux problèmes peuvent survenir lors de la perte de l’intégrité des télomères, tels que le vieillissement prématuré ainsi que d’autres maladies incluant, l’insuffisance de la moelle osseuse et les cancers. Certaines cellules, telles que les cellules souches embryonnaires, expriment la télomérase permettant le maintien de la longueur des télomères. Le laboratoire Harrington a démontré que l’absence de la télomérase engendre un défaut de différenciation des mESCs à télomères courts (mESCs Tert -/-) ainsi que des perturbations épigénétiques. Ils ont aussi détecté un rétablissement de l’habilité de différenciation des mESCs Tert -/- dans le contexte d’un « knockout » de Trp53. Nous avons cherché à comprendre comment Trp53 influence la différenciation des mESCs à télomères courts en étudiant l’impact de Cdkn1a (p21) sur leur différenciation. En utilisant CRISPR/Cas9, nous avons généré plusieurs clones Cdkn1a KO afin d’analyser leur capacité à se différencier. Nous avons également étudié l’impact d’un Trp53 KO dans les mESCs Tert -/- sur les marques épigénétiques ainsi que sur la longueur des télomères. Cette étude ne nous permet pas de conclure comment p53 impact la différenciation de ces cellules, même s’il semble apparent que p21 ne soit pas directement impliqué. La poursuite de ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme de différenciation des mESCs et son lien avec l’intégrité des télomères et par conséquent, contribuera à mieux connaître l’impact des télomères dans le vieillissement et ses maladies associées. / Telomere length stability is crucial for the maintenance of genome integrity. Many problems can arise from a loss of telomere integrity, such as premature aging, and other diseases including anemia, bone marrow failure, and cancer. Some cells, such as embryonic stem cells, express telomerase, which allows telomere length maintenance. The Harrington group showed that the absence of telomerase generates a defect in the differentiation of ES cells with eroded telomeres (mESCs Tert -/-) and was accompanied by other epigenetic modifications. They also detected a rescue in differentiation of mESCs Tert -/- that were disrupted or knocked out (KO) for the tumor suppressor p53, encoded by Trp53. We aimed to understand how Trp53 impacts mESCs differentiation by looking at the impact of Cdkn1a (p21) on the differentiation of those cells as well as the impact of p53 KO on epigenetic marks. Using CRISPR/Cas9, we generated several p21 KO clones to analyze their ability to differentiate. We also assessed the impact of a p53 KO in mESCs Tert -/- on epigenetic marks and telomere lengths. This study does not allow us to conclude how p53 impacts differentiation of those cells, even though it appears that p21 is not directly implicated. The continuation of this project will allow a better understanding of the differentiation mechanism in mESCs and its relationship to telomere integrity, and a deeper appreciation of the impact of telomeres in aging and correlated diseases.

Le développement d'une réponse antivirale contre les virus, incluant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de la grippe, le virus respiratoire syncytial (VRS) ou le SARS-CoV-2, repose sur l'activation d'adaptateurs intracellulaires qui conduisent à la production d'interférons et de cytokines proinflammatoires. Une activation correctement équilibrée de ces voies permet à la cellule de monter un état antiviral, essentiel pour restreindre la réplication et la propagation du virus. Les acides nucléiques viraux à base d'ADN, présents à l’intérieur de la cellule, peuvent être reconnus par la GMP-AMP Synthase cyclique (cGAS), qui transduit ensuite le signal via l'adaptateur Stimulateur des gènes d'interféron (STING). D'autre part, les acides nucléiques viraux à ARN sont reconnus par les récepteurs de type RIG-I (RLR), qui interagissent ensuite avec l'adaptateur de signalisation antivirale mitochondrial (MAVS). STING et MAVS sont des protéines pivots de signalisation localisées dans des compartiments membranaires, régulées par plusieurs modifications post-traductionnelles (PTM) et, lors de l'activation, elles subissent des événements de polymérisation allant jusqu'à la formation d'agrégats fonctionnels. Des données soutiennent un rôle des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la régulation des voies dépendantes de STING et MAVS, mais les mécanismes restent mal définis. Les ROS sont connus pour modifier la structure et l'activité des protéines de signalisation via des PTMs oxydatives réversibles sur des cystéines (Cys ox-PTM). Les Cys ox-PTM réversibles consistent en une variété de modifications, les plus étudiées étant la S-sulfénylation (Cys-SOH), la S-glutathionylation (Cys-SSG) et le disulfure (S-S). Afin d’identifier les Cys ox-PTM qui affectent les protéines de signalisation impliquées dans la réponse antivirale, nous avons effectué une identification à l'échelle du protéome des Cys ox-PTM induites par les ROS en utilisant un marquage bioswitch à base de maléimide couplé à la spectrométrie de masse. Nous avons identifié 2720 sites Cys ox-PTM uniques englobant 1473 protéines avec une abondance, localisation et fonctions distinctes. Parmi ceux-ci, nous avons découvert l'oxydation de STING sur la Cys148 et Cys206. Cette dernière étant inductible par le stress oxydatif ou par le ligand naturel 2'3'-cGAMP et joue un rôle inhibiteur pour empêcher l'hyperactivation de STING par la formation de polymères inactifs contenant des liaisons intermoléculaires S-S. En outre, nous avons observé que MAVS était également capable de former des polymères intermoléculaires contenant des S-S en réponse à une infection par des virus à ARN, et que l'ancrage de la protéine à la membrane était essentiel pour la formation de ces polymères. Le couplage du marquage par bioswitch à base de maléimide à l'analyse par immunoblot a confirmé que MAVS était oxydé pendant une infection avec un virus à ARN. Nous avons également constaté que des Cys situées dans des positions clés pour la formation de polymères de MAVS actifs étaient essentielles pour transduire la signalisation en aval et finalement activer le promoteur IFNβ en réponse à l'infection virale. Nos études établissent un mécanisme direct par lequel les ROS contrôlent la réponse immunitaire innée cGAS/STING et RLRs/MAVS-dépendante. Ils offrent un nouveau terrain pour la conception de thérapies ciblant des adaptateurs pertinents pour les infections virales, telles que la vaccination, mais aussi pour les troubles auto-immuns et inflammatoires. / The development of an antiviral response against viruses, including Human Immunodeficiency Virus (HIV), influenza, Respiratory Syncytial Virus (RSV) or SARS-CoV-2, relies on the activation of intracellular adaptors that ultimately lead to the production of interferons and proinflammatory cytokines. Properly balanced activation of these pathways allows the cell to mount an antiviral state, essential to restrict virus replication and spreading. Intracellular DNA viral nucleic acids can be recognized by the cyclic GMP-AMP Synthase (cGAS), which then transduces the signal through the Stimulator of Interferon Genes (STING) adaptor. On the other hand, RNA viral nucleic acids are recognized by the RIG-I-like Receptors (RLRs), which then interact with the Mitochondrial Antiviral Signaling (MAVS) adaptor. STING and MAVS are signaling hub proteins localized in membranous compartments, regulated by several posttranslational modifications (PTMs) and, upon activation, they undergo polymerization events going as far as the formation of functional aggregates. Compelling evidence supports a role of reactive oxygen species (ROS) in the regulation of STING and MAVS-dependent pathways, but the mechanisms remain ill-defined. ROS are known to modify signaling protein structure and activity through reversible oxidative PTM of Cysteines (Cys ox-PTM). Reversible Cys ox-PTMs consist of a variety of modifications, the most widely studied being S-sulfenylation (Cys-SOH), S-glutathionylation (Cys-SSG) and disulfide (S-S). To unveil the Cys ox-PTMs that affect signaling proteins involved in the antiviral response, we performed a proteome wide identification of the Cys ox-PTMs induced by ROS using maleimide-based bioswitch labeling coupled to mass spectrometry. We identified 2720 unique Cys ox-PTM sites encompassing 1473 proteins with distinct abundance, location, and functions. Among these, we uncovered the oxidation of STING at Cys148 and Cys206. The latter was inducible by oxidative stress or by the natural ligand 2’3’-cGAMP and plays an inhibitory role to prevent STING hyperactivation through the formation of inactive polymers containing intermolecular S-S bonds. Further, we observed that MAVS was also able to form intermolecular S-S containing polymers in response to RNA virus infection, and that the anchoring of the protein to the membrane was essential for these polymers to form. Maleimide-based bioswitch labeling couple to immunoblot analysis confirmed that MAVS was oxidized during RNA virus infection. We also found that Cys located in positions key for the formation of active polymers were essential for MAVS to transduce downstream signaling and ultimately activate IFNβ promoter in response to virus infection. Our studies establish a direct mechanism by which ROS control the cGAS/STING and the RLRs/MAVS-dependent innate immune response. They provide new ground for the design of therapies targeting adaptors relevant to viral infections, such as vaccination, but also to autoimmune and inflammatory disorders.

Les maladies métaboliques ont pris une ampleur considérable dans le monde ces dernières décennies, telle que certains parlent à ce jour de pandémie. Le diabète de type 2 est l’une de celles qui progressent avec la plus importante prévalence. L'un des facteurs à l’origine du développement de cette physiopathologie est l’insulino-résistance. Il s'agit d'une altération de la réponse à l’insuline des tissus cibles tels que le muscle squelettique, le tissu adipeux et le foie, induisant une dérégulation de l'homéostasie du glucose. Les tissus sensibles deviennent incapables, entre autres, d'absorber adéquatement le glucose sanguin conduisant ainsi à l’établissement d’une hyperglycémie chronique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de caractériser le rôle de la protéine Growth-arrest specific 6 (GAS6) dans la dérégulation de l’équilibre glycémique et le développement de la résistance à l’insuline. GAS6 est une protéine γ-carboxylée sécrétée qui agit comme ligand pour la famille des récepteurs tyrosines kinases TAM comprenant : TYRO3, AXL et MERTK. GAS6 et ses récepteurs jouent un rôle essentiel dans le système immunitaire, la progression tumorale et les métastases cancéreuses. Cependant, des études récentes menées chez l’humain ont montré que les niveaux circulants de GAS6 ou des variations dans le gène GAS6 sont associés à l’hyperglycémie, la résistance à l'insuline et le risque de développer le diabète de type 2. Cependant, le mécanisme par lequel GAS6 influence ces désordres métaboliques reste méconnu. Dans une première étude, nous avons évalué, pour la première fois dans une cohorte de femmes canadiennes, la corrélation éventuelle entre les niveaux circulants de GAS6 et des facteurs de risque liés au diabète. Cette cohorte nommée MONET (Montréal and Ottawa New Emerging Team) est constituée de 126 femmes post-ménopausées, en surpoids ou obèses. Ces femmes ne sont pas diabétiques, mais présentent un risque plus élevé de développer la maladie à cause de leur poids et de leur statut sédentaire. Nous avons constaté que les femmes ayant des taux élevés de GAS6 dans le sang ont une tolérance au glucose significativement plus faible que celles avec des niveaux plus faibles de GAS6. Par ailleurs, certains paramètres de dysfonctionnements hépatiques (AST, ALT) et des marqueurs d’inflammation (IL-6) concordent positivement avec des taux élevés de GAS6. Nos résultats suggèrent que GAS6 pourrait être un biomarqueur de l’intolérance au glucose chez des patientes obèses et qu’il pourrait être associé à l’inflammation et à certains problèmes hépatiques, qui sont des facteurs impliqués dans le développement du diabète. Dans une seconde étude, à l’aide de modèles murins modifiés génétiquement, nous avons pu démontrer que la délétion du gène Gas6 est suffisante pour améliorer la sensibilité à l’insuline et la tolérance au glucose, sans affecter la sécrétion d’insuline. Par ailleurs, les souris déficientes pour GAS6 sont protégées contre la résistance à l'insuline induite par un régime alimentaire riche en graisses et en sucres. À l’inverse, l'augmentation in vivo des taux circulants de GAS6 est suffisante pour réduire la sensibilité à l'insuline. L'analyse de l'expression génique des récepteurs TAM dans les tissus sensibles à l’insuline a révélé qu’Axl est fortement exprimé dans le muscle squelettique. Dans une lignée de cellules musculaires, nous avons démontré que la voie de signalisation de GAS6-AXL affecte la réponse à l'insuline en inhibant la phosphorylation du récepteur de l'insuline (RI) et de son effecteur en aval AKT. Mécaniquement, AXL s'hétérodimérise avec le RI et GAS6 reprogramme les voies de signalisation en aval du RI dans les cellules musculaires. Il en résulte une activation accrue de la voie des Rab, notamment Rab7 induisant une internalisation de RI. Ensemble, ces résultats décrivent le mécanisme cellulaire par lequel GAS6 et AXL influencent la sensibilité à l'insuline. Finalement, nos derniers résultats soulignent un autre mécanisme d’action de GAS6 sur le métabolisme des cellules musculaires. Nous avons démontré, par protéomique, que GAS6 augmente significativement les niveaux protéiques de plusieurs enzymes impliquées dans la glycolyse et la production de lactate. Le profil métabolique des cellules musculaires traitées avec GAS6 démontre une augmentation du niveau de la glycolyse anaérobique et de la production de lactate. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que le lactate lui-même induit une inhibition de la phosphorylation du RI en réponse à l’insuline. Ainsi, GAS6, en reprogrammant les voies métaboliques et l’utilisation du glucose des cellules musculaires, favoriserait la production de lactate induisant une diminution de la sensibilité à l'insuline. / Metabolic diseases have taken on a considerable scale in the world in recent decades, such that some speak of a pandemic. Type 2 diabetes is one of those diseases that progress with the highest prevalence. One of the factors behind the development of this pathophysiology is insulin resistance. It is an alteration of the insulin response of targeted tissues such as skeletal muscle, adipose tissue and liver, inducing dysregulation of glucose homeostasis. Sensitive tissues become incapable, among other things, of adequately absorbing blood glucose, thus leading to the establishment of chronic hyperglycemia. The work presented in this thesis focuses on characterizing the role of Growth-arrest specific protein 6 (GAS6) in the dysregulation of glycemic balance and the development of insulin resistance. GAS6 is a secreted γ-carboxylated protein that acts as a ligand for the TAM family of receptor tyrosine kinases including: TYRO3, AXL and MERTK. GAS6 and its receptors play an essential role in the immune system, tumor progression and cancer metastasis. However, recent studies in humans have shown that circulating GAS6 levels or variations in GAS6 gene are associated with hyperglycemia, insulin resistance and the risk of developing type 2 diabetes. However, the mechanism by which GAS6 influences these metabolic disorders remains unknown. In a first study, carried out for the first time in a cohort of Canadian women, we evaluated the potential correlation between circulating GAS6 levels and risk factors linked to diabetes. This cohort, named MONET (Montreal and Ottawa New Emerging Team), is composed of 126 post-menopausal, overweight or obese women. These women are not diabetic but have high risks of developing the disease because of their weight and sedentary status. We found that women with high levels of GAS6 in the blood have significantly lower glucose tolerance than those with lower levels of GAS6. In addition, certain liver dysfunction parameters (AST, ALT) and inflammation markers (IL-6) positively correlated with high levels of GAS6. Our results suggest that GAS6 could be a biomarker of glucose intolerance in obese patients and be associated with inflammation and certain liver problems, which are factors involved in the development of diabetes.  In a second study, using genetically modified mouse models, we were able to demonstrate that deletion of the Gas6 gene was sufficient to improve insulin sensitivity and glucose tolerance, without affecting insulin secretion. Furthermore, GAS6-deficient mice were protected against insulin resistance induced by a diet high in fats and sugars. Conversely, in vivo, increase of GAS6 circulating levels is sufficient to reduce insulin sensitivity. Analysis of TAM receptors gene expression in insulin-responsive tissues revealed that Axl is highly expressed in skeletal muscle. In a muscle cell line, we demonstrated that the GAS6-AXL signaling pathway affects the insulin response by inhibiting the phosphorylation of the insulin receptor (IR) and its downstream effector AKT. Mechanistically, AXL heterodimerizes with IR and GAS6 reprograms signaling pathways downstream of IR in muscle cells. This results in an increased activation of the Rab pathway, in particular Rab7, inducing an internalization of IR. Together, these results describe the cellular mechanism by which GAS6 and AXL influence insulin sensitivity. Finally, our latest results highlight another mechanism of action of GAS6 on muscle cell metabolism. We demonstrated by proteomics that GAS6 significantly increases the protein levels of several enzymes involved in glycolysis and lactate production. The metabolic profile of muscle cells treated with GAS6 demonstrates an increase in the level of anaerobic glycolysis and lactate production. Furthermore, our results suggest that lactate itself induces an inhibition of IR phosphorylation in response to insulin. Thus, GAS6, by reprogramming the metabolic pathways and the use of glucose in muscle cells, would promote lactate production inducing a decrease in insulin sensitivity.

Le cancer du sein est une maladie complexe résultant de la prolifération non contrôlée des cellules mammaires. Plus de 70% des tumeurs mammaires expriment les récepteurs des oestrogènes (ER) et peuvent bénéficier d’hormonothérapies ciblées. Parmi les thérapies hormonales, on y retrouve des anti-oestrogènes tel que le Fulvestrant. Les mécanismes d’action de ERα ne sont pas encore tous connus, d’où l’importance d’étudier son interactome. Un TurboID a été effectué dans la lignée cellulaire ERα+ ZR75.1. Ceci a permis d’identifier de potentiels interacteurs de ERα en réponse à différents traitements (E2 vs Fulvestrant) : GATAD2B, une sous-unité du complexe répresseur NuRD, et AIP, un interacteur connu du récepteur d’aryl hydrocarbone (AHR). Ces deux complexes sont connus comme pouvant être impliqué dans la signalisation par ERα. Nous avons donc émis comme hypothèse que GATAD2B et AIP étaient des cofacteurs de ERα et pouvaient avoir un impact sur l’activité transcriptionnelle de ERα. Nos objectifs étaient de mieux comprendre la relation entre ces protéines et ERα. Nous avons d’abord validé la colocalisation et la proximité de ces protéines avec ERα dans les cellules ER+ ZR-75-1. Nous avons ensuite observé l’interaction de ERα avec GATAD2B et AIP. De plus, des analyses par ChIP-qPCR ont permis d’observer le recrutement de ces protéines aux EREs du promoteur de GREB1 et que ce recrutement pouvait être modulé par les ligands de ERα. Finalement, nous avons pu observer par RNAseq que l’inhibition de GATAD2B entraînait une surexpression de groupes de gènes impliquées dans la réponse oestrogénique ERα-dépendante. Ainsi, nos travaux suggèrent que GATAD2B et AIP sont des interacteurs de ERα dans les cellules ER+ ZR-75-1. De plus, les résultats préliminaires semblent indiquer que GATAD2B pourrait jouer un rôle dans la répression de l’activité transcriptionnelle de ERα en présence de Fulvestrant. / Breast cancer is a complex and heterogenous disease resulting form the uncontrolled proliferation of breast cells. More than 70% of breast tumors express ERα and can benefit from targeted hormonotherapies. Among hormonal therapies, there are antiestrogens such as Fulvestrant. The mechanism of action of ERα signaling are still not all known and therefore, more studies need to be done to better understand Erα signaling pathways. With the aim to identify potential novel Erα interactors, a TurboID screening was done in ER+ cells, ZR-75-1. This screening led to the identification of GATAD2B, a sub-unit of the NuRD repressive complex, and AIP, a known interactor of AhR. Cross-signaling pathways between these two complexes and ERα are known. We hypothesized that GATAD2B and AIP were ERα cofactors could impact ERα transcriptional activity. Therefore, we aimed to better understand the relationship between these proteins and ERα. We first validated the colocalization and proximity of these proteins with ERα in ER+ ZR-75-1 cells. We then observed the interaction of ERα with GATAD2B and AIP. In addition, ChIP-seq experiments led to the observation of the recruitment of these proteins to the EREs of GREB1 promoter and that this recruitment could be modulated by ERα ligands. Finally, we were able to observe by RNAseq that the inhibition of GATAD2B leads to an overexpression of groups of genes involved in the ERα-dependent estrogen response. To conclude, our work suggests that GATAD2B and AIP are ERα interactors in ER+ ZR-75-1 cells. Additionally, preliminary results suggest that GATAD2B may play a role in suppressing ERα transcriptional activity in the presence of Fulvestrant.

RAS est une GTPase qui transduit les signaux extracellulaires envers des voies de signalisation intracellulaires, en liant ses effecteurs. RAS peut activer la voie Hippo qui inhibe la croissance cellulaire et qui est souvent dérégulée dans le cancer. Les protéines RASSF suppresseurs de tumeurs relient RAS à la voie Hippo. L’expression exogène de KRASG12V avec RASSF1 ou RASSF5 conduit à l'activation de la voie Hippo, bien que KRAS et RASSF1 ne s’associent pas directement. Ce projet de maîtrise vise à identifier les protéines impliquées dans l'activation de la voie Hippo par RAS. Nous avons effectué plusieurs expériences BioID, une technique qui permet d’identifier les interacteurs proximaux d’une protéine d’intérêt, dans des lignées cellulaires U2OS stables et inductibles exprimant les protéines KRASG12V, RASSF1 ou RASSF5 seules ou coexprimées, permettant de comparer les conditions où la voie Hippo inactive ou active. Nous avons élucidé l'interactome d'un mutant de KRAS avec affinité accrue envers RASSF5 et affinité réduite envers RAF, permettant d’étudier les voies activées en aval de RASSF5, avec une activation réduite de la voie MAPK. Nos données montrent que RASSF1 et RASSF5 relâchent les kinases Hippo MST1 et MST2 lorsque la voie Hippo est active, conformément aux données in vitro démontrant un rôle inhibiteur de l'interaction RASSF/MST. De plus, nous avons démontré que KRAS est un interacteur proximal des protéines VAMP3 et SNAP23. Comprendre comment l'oncoprotéine RAS active des effecteurs et des voies de signalisation moins étudiés, en particulier ceux qui ont des fonctions suppressives de tumeurs a des implications importantes pour le développement de nouvelles thérapies ciblées pour les cancers induits par RAS. / RAS is a small GTPase that transduces signals from membrane-bound receptors to intracellular pathways, by signaling to downstream effector proteins. RAS can activate the Hippo pathway, a growth-suppressive pathway that is often dysregulated in cancer. The tumor suppressor RASSF proteins link RAS to Hippo signaling. Co-expression of KRASG12V with either RASSF1 or RASSF5 leads to Hippo pathway activation, despite KRAS and RASSF1 not being direct binding partners. This M.Sc. project aims to identify proteins that are involved in RAS-mediated activation of the Hippo pathway. We performed BioID, a proteomic technique which is used to identify the proximal interactors of a protein of interest, in stable and inducible U2OS osteosarcoma lines expressing KRASG12V, RASSF1, or RASSF5 proteins alone, as well as in lines co-expressing both KRASG12V and the RASSF proteins, allowing for a comparison between inactive and active Hippo pathway interactomes. Furthermore, we mapped the interactome of a double mutant of KRAS that displays increased affinity for RASSF5 and decreased affinity for the effector RAF, allowing us to study KRAS signaling downstream of RASSF5, with decreased activation of the MAPK pathway. Our BioID data shows that RASSF1 and RASSF5 disengage the Hippo kinases MST1 and MST2 when the Hippo pathway is active, in line with the inhibitory role of the RASSF/MST interaction observed in vitro. Furthermore, we show that KRAS is a proximal interactor of the SNARE proteins VAMP3 and SNAP23. Understanding how the oncoprotein RAS signals to less studied effectors and pathways, particularly those with tumor suppressive functions has significant implications for understanding oncogenesis, and for development of new targeted therapies for RAS-driven cancers.

Le recrutement des leucocytes dans les tissus est un processus courant dans toutes les maladies inflammatoires de l'adulte. Celui-ci est médié par des interactions de haute affinité entre les molécules d'adhésion endothéliales à la surface des vaisseaux sanguins et leurs ligands sur les cellules immunitaires circulantes. Ce processus implique une multitude de molécules telles que ICAM1, VCAM1 et les sélectines pour soutenir la « capture » des cellules immunitaires et leur extravasation à travers les cellules endothéliales vasculaires. Nos résultats préliminaires suggèrent que le récepteur ALK1, exprimé spécifiquement sur les cellules endothéliales, pourrait réguler l'expression de ces molécules d'adhésion. Pour examiner l'impact de la signalisation ALK1 sur le recrutement des cellules immunitaires, nous avons utilisé des lignées de cellules endothéliales siALK1 (HUVECs) traitées avec du lipopolysaccharide (LPS) pour induire un processus inflammatoire. Tout d'abord, l'expression des gènes, examinée par Ampliseq, a montré une diminution significative de l'expression de ICAM1, VCAM1 et E-sélectine dans les HUVECs siALK1 par rapport au contrôle. De plus, l'analyse par cytométrie en flux a démontré que l'expression des protéines d'adhésion augmentent dans les cellules traitées avec du LPS, mais que cet effet est atténué dans les cellules endothéliales dépourvues d'ALK1. De plus, nous avons observé que le p38 phosphorylé, un facteur qui joue un rôle clé dans le processus inflammatoire, est diminué dans les cellules siALK1. Enfin, pour étudier les conséquences fonctionnelles de la délétion d'ALK1 sur les interactions leucocytes/cellules endothéliales, un test d'adhésion en flux est réalisé, dans lequel les leucocytes circulent sur les cellules endothéliales et l'extravasation des cellules immunitaires est observée au microscope. Les résultats ont montré une diminution de l'infiltration des leucocytes dans les HUVECs siALK1 par rapport aux témoins. En conclusion, nos données démontrent qu'ALK1 a un impact majeur sur le recrutement des leucocytes vers l'endothélium par l'expression de protéines d'adhésion ainsi que par la normalisation vasculaire. Ce projet contribue à une meilleure compréhension de l'interaction entre les leucocytes et l'endothélium vasculaire. / Leukocyte recruitment into tissues is a common process in all adult inflammatory diseases. This is mediated by high affinity interactions between endothelial adhesion molecules and their counter receptor ligands on circulating immune cells. This process involves a multitude of molecules such as ICAM1, VCAM1 and selectins to support the "capture’’ of immune cells and their extravasation through vascular endothelial cells. Our preliminary results suggest that ALK1 receptor, expressed specifically on endothelial cells, could regulate the expression of these adhesion molecules. To examine the impact of ALK1 signaling on immune cells recruitment, we used siALK1 endothelial cell lines (HUVECs) treated with LPS (Lipopolysaccharide) to induce an inflammatory process. First, gene expression, examined by Ampliseq, showed a significant decrease in ICAM1, VCAM1 and E-selectin expression in siALK1 HUVECs compared to control. Furthermore, flow cytometry analysis demonstrated that adhesion protein expression increases in control cells treated with LPS, but that this effect is lessened in endothelial cells lacking ALK1. Moreover, we observed that phosphorylated p38, a factor that plays a key role in inflammatory process, is decreased in siAlk1 cells. Finally, to study the functional consequences of ALK1 deletion on leukocyte/endothelial cells interactions, a flow adhesion assay is performed, in which leukocytes circulate on endothelial cells and extravasation of immune cells is observed under a microscope. The results showed decreased leukocyte infiltration in siALK1 HUVECs compared to controls. In conclusion, our data demonstrate that ALK1 has a major impact on leukocyte recruitment to the endothelium through the expression of adhesion proteins and the vascular normalization. This project contributes to a better understanding of the interaction of leukocytes and the vascular endothelium.

Ancylostoma caninum, un nématode parasite, présente une prévalence élevée chez les chiens dans le monde. L'ankylostomiase canine peut être diagnostiquée à l'aide de tests coprologiques qui détectent les œufs ressemblant à des ankylostomes, ainsi que la présence de symptômes tels que l'anémie et les selles noires. Ces dernières années, le nombre de rapports établissant une résistance aux anthelminthiques chez A. caninum aux États-Unis d’Amérique a considérablement augmenté. Cette tendance émergente a incité notre enquête sur la possibilité qu’un scénario similaire se produise au Canada. L'objectif de cette étude était d'étudier la survenue d'une infection à A. caninum chez un groupe de chiens de refuge au Québec ayant préalablement reçu un traitement anthelminthique. De plus, l'étude visait à évaluer l'établissement potentiel d'une résistance anthelminthique contre ce parasite en employant des approches modifiées pour détecter les infections à faible prévalence. La procédure d'examen a été réalisée dans deux groupes distincts : un groupe local et un groupe composé de trois chiens des États-Unis d'Amérique (groupe USA). Le test coprologique a été réalisé avant et après un traitement anthelminthique incluant les benzimidazoles. De plus, la présence d'A. caninum a été confirmée par une amplification PCR précise du gène ITS-2. Le groupe local a montré un effet thérapeutique significatif après avoir reçu du fenbendazole. L'identification d'une mutation hétérozygote au niveau du codon 167 du gène de l'isotype 1 de la β-tubuline dans le groupe américain a été réalisée par analyse moléculaire. Ainsi, en évaluant les résultats thérapeutiques du fenbendazole, nous pouvons confirmer son efficacité variable comme anthelminthique contre A. caninum. De plus, des preuves moléculaires indiquent la présence d'isolats résistants dans le pays, ce qui pourrait potentiellement constituer un défi important pour contrôler les nématodes gastro-intestinaux chez les animaux de compagnie / Ancylostoma caninum, a parasitic nematode, exhibits a high prevalence in dogs globally. Canine ancylostomiasis can be diagnosed using coprological tests that detect hookworm-like eggs, as well as the presence of symptoms such as anaemia and dark stool. In recent years, there has been a significant rise in the number of reports establishing anthelmintic resistance in A. caninum within the United States of America. This emerging trend has prompted our investigation on the possibility of a similar scenario occurring in Canada. The objective of this study was to investigate the occurrence of A. caninum infection in a group of shelter dogs in Quebec who had previously received anthelmintic treatment. Additionally, the study aimed to assess the potential establishment of anthelmintic resistance against this parasite by employing modified approaches to detect infections with a low prevalence. The examination procedure was carried out in two distinct groups: a native group and a group consisting of three dogs from the United States of America (USA group). The coprological test was undertaken both prior to and following anthelmintic treatment, which included the benzimidazoles. Moreover, A. caninum presence was confirmed via precise PCR amplification of the ITS-2 gene. The native group showed a significant treatment effect after receiving fenbendazole. The identification of a heterozygous mutation at codon 167 on the β-tubulin isotype-1 gene in the USA group was achieved through molecular analysis. Thus, by assessing the therapeutic outcomes of fenbendazole, we can confirm its varying effectiveness as an anthelmintic against A. caninum. Additionally, molecular evidence indicates the presence of resistant isolates in the country, which could potentially pose a significant challenge for controlling gastrointestinal nematodes in companion animals.