Pendant le bris de l'enveloppe nucléaire, la kinase dépendante des cyclines liée à la cycline B (CDK1-cycline B) et d'autres kinases phosphorylent des protéines nucléaires conduisant au désassemblage des complexes de protéines de l'enveloppe nucléaire. Les protéines nucléaires phosphorylées sont ensuite déphosphorylées par un groupe de phosphatases en sortie mitotique. La protéine phosphatase 2A en complexe avec la sous-unité régulatrice B55 (PP2A-B55) est connue pour être la principale phosphatase à déphosphoryler les protéines critiques à la fin de la mitose. Cependant, les substrats nucléaires déphosphorylés par PP2A-B55 à la sortie mitotique sont peu connus. En utilisant des cellules de drosophile en culture, nous avons démontré que PP2A-B55 est nécessaire pour le recrutement de protéines de l'envelope nucléaire telles que BAF, la protéine de lamina nucléaire Lamin B et la nucléoporine Nup107. De plus, nous avons trouvé que les œufs de femelles des drosophiles hétérozygotes pour une mutation dans les gènes codant pour la Lamine B et Tws (B55 chez la drosophile) n’éclosent pas. Ces œufs présentent divers défauts au stade de la méiose et des divisions nucléaires de l’embryon syncytial. De plus, des tests in vitro et d'autres analyses biochimiques indiquent que PP2A-Tws se lie et déphosphoryle BAF. J'ai d'autres résultats qui suggèrent un rôle de la protéine Ankle2 dans la régulation du recrutement de BAF pour réassembler les noyaux à la sortie mitotique. Mes résultats suggèrent également que Ankle2 en complexe avec PP2A est responsable de la bonne progression mitotique. Mes résultats mettent en évidence l'utilité de la drosophile comme système modèle dans l'étude de différents aspects du cycle cellulaire. Ils démontrent également / During nuclear envelope breakdown, the cyclin-dependent kinase 1 bound to Cyclin B (CDK1-Cyclin B) and other kinases phosphorylate a number of nuclear proteins leading to the disassembly of nuclear envelope protein complexes. Phosphorylated nuclear proteins are then dephosphorylated by a group of phosphatases at mitotic exit. The protein phosphatase 2A in complex with the regulatory subunit B55 (PP2A-B55) is known to be the major phosphatase to dephosphorylate critical proteins at the end of mitosis. However, little was known about the nuclear substrates dephosphorylated by PP2A-B55 at mitotic exit. Using Drosophila cells in culture, we demonstrated that PP2A-B55 is required for the recruitment of nuclear envelope proteins such as BAF, the nuclear lamina protein Lamin B, and the nucleoporin Nup107. Also, eggs from Drosophila females heterozygous for a mutation in genes coding for Lamin B and Tws (B55 in Drosophila), didn’t hatch. These eggs showed various defects during the nuclear division stage and meiosis. Moreover, in vitro assays and other biochemical analyses indicate that PP2A-B55 binds and dephosphorylates BAF. I have other results that suggest a role of the protein Ankle2 in regulating BAF recruitment to reassembling nuclei at mitotic exit. My results also suggest that Ankle2 in complex with PP2A is responsible for the proper mitotic progression. Our results highlight the importance of Drosophila in investigating different aspects of the cell cycle. It also demonstrates a role of PP2A in the nuclear envelope reformation at the end of mitosis.

M42 aminopeptidases are dinuclear enzymes widely found in prokaryotes but completely absent from eukaryotes. They have been proposed to hydrolyze peptides downstream the proteasome or other related proteolytic complexes. Their description relies mainly on the pioneering work on four M42 aminopeptidases from Pyrococcus horikoshii. Their quaternary structure consists of twelve subunits adopting a tetrahedral-shaped structure. Such a spatial organization allows the compartmentalization of the active sites which are only accessible to unfolded peptides. The dodecamer assembly results from the self-association of dimers under the control of the metal ion cofactors. Both oligomers have been shown to co-exist in vivo and heterododecamers with broadened substrate specificity may even occur. Yet, the molecular determinants behind the dodecamer assembly remain unknown due the lack of a high-resolution structure of a stable dimer. In addition, the bacterial M42 aminopeptidases are still ill-described due to the paucity of structural studies. This work focuses mainly on the characterization of TmPep1050, an M42 aminopeptidase from Thermotoga maritima. As expected, TmPep1050 adopts the genuine tetrahedral-shaped structure with twelve subunits. It also displays a leucyl-aminopeptidase activity requiring Co2+ as a cofactor. In addition to its catalytic function, Co2+ has a role in the enzyme thermostability and oligomerization. The absence of Co2+ provokes the disassembly of active TmPep1050 dodecamers into inactive dimers. The process, however, is reversible since Co2+ triggers the self-association of dimers into dodecamers, as shown by native MS. The main achievement of this work is the determination of the first high-resolution structure of a dimer, allowing to better understand the dimer-dodecamer transition. Several structural motifs involved in oligomerization are displaced or highly flexible in the TmPep1050 dimer structure. Furthermore, a loop bringing two catalytic relevant residues is displaced outside the catalytic site. These residues are the catalytic base and a ligand involved in the Co2+ binding at the M1 site. The metal ion binding sites have been further investigated to define how they influence the oligomerization of TmPep1050. A mutational study shows that the M1 site strictly controls the dodecamer formation while the M2 site contributes only partly to it. A strictly conserved aspartate residue of the M2 site second shell also plays an important structural role in maintaining the active site integrity. Indeed, its substitution prevents the formation of dodecamer probably due to the lack of stabilization of the active site loop. The characterization of TmPep1050 supports that bacterial M42 aminopeptidases probably share the quaternary structures and dodecamer assembly with their archaeal counterparts. The dimer structure highlights several structural modifications occurring in the dimer-dodecamer transition. Yet, based on current knowledge, no general rules can be drawn for the role of the M1 and M2 sites in oligomerization. Besides, the physiological function of the M42 aminopeptidases is under-examined albeit the proposed link to the proteasome. In this work, this has been investigated using the Escherichia coli M42 aminopeptidases as a model. Yet, no phenotype has been associated to the deletion of their coding genes. Preliminary results have shown that the three enzymes (i) display a redundant substrate specificity, (ii) could be localized partly to the membrane, and (iii) form heterocomplexes. Further experiments are still required to crack the function of these M42 aminopeptidases. / Option Biologie moléculaire du Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The general objective of this work is to better understand the mechanisms of diversification of the African flora on the Gulf of Guinea islands. We focused on orchids, one of the three predominant plant families on São Tomé and Príncipe. We selected the genus Tridactyle, wich presents a high level of diversity and of endemism in the archipelago.We first redefined the taxonomical framework, as the genus belongs to a clade in which the taxonomical classification did not correspond to the phylogenetic tree obtained by previous studies. To address these classification problems (paraphyly and polyphyly of nominal genera), we firstly used Sanger sequencing to obtain more molecular markers to better estimate the phylogenetic tree of the Tridactyle-Cyrtorchis clade. We used one nuclear marker, the internal transcribed spacer (ITS), and five chloroplastic markers (matK, rps16, trnC-petN intergenic spacer, trnL-trnF intergenic spacer, ycf1). Then, we combined the phylogenetic information to a morphological survey, including as many specimens as possible for the genera concerned. We recircumscribed the previously paraphyletic genus Tridactyle, as well as three other genera within the Tridactyle-Cyrtorchis clade (Rangaeris, Ypsilopus and Podangis), and we described two genera with our collaborators, Aziza and Planetangis. We also described six species new to science, two from East Africa and four from São Tomé and Príncipe. Indeed, the morphological diversity of the Tridactyle in the Gulf of Guinea islands has been misevaluated, such that wrong names have been attributed to species new to science.Once this taxonomic work was achieved, we have focused on two other studies: a biogeographic analysis of Tridactyle, to understand the origin and mechanisms generating its diversity in São Tomé and Príncipe, and a phylogeographic study to analyse the genetic variation and geographical distribution of Tridactyle tridactylites, distributed on the archipelago as well as on the continent. These studies were based on DNA sequence variation of the chloroplast genome and ribosomal DNA genes and the data were generated through Illumina Next Generation Sequencing (NGS), which allowed us to include herbarium specimens for which the classic Sanger method did not give satisfactory results.Our study showed that all Tridactyle species currently found on São Tomé and Príncipe colonised the archipelago independently, and that the current species diversity on the islands is the result of allopatric divergence between the islands and the continent, following island colonisation.- 20 -The intraspecific study revealed a high genetic diversity for Tridactyle tridactylites individuals present on Príncipe, which is not common on oceanic islands, but could be a signal that the island was a refuge for the species during the climatic changes related to ice ages. An approximate Bayesian computation analysis (ABC) of the geographic distribution of genetic variation in Atlantic Central Africa and West Africa favoured a hypothesis of recolonisation of the continent from the island rather than a colonisation of the island from the continent. It is possible that the dust-like seeds used wind currents moving from the islands to Central and West Africa as a mean of travel.The work presented here stresses the importance of conducting such studies on more orchid genera, but also on the two other main families of São Tomé and Príncipe, Rubiaceae and Euphorbiaceae. We made a first step toward a better understanding of the mechanisms of diversifications on the Gulf of Guinea islands, but only with a larger number of studies on diverse families and genera, we could draw more general conclusions about these mechanisms for the flora of the archipelago.With regard to the limitations of our study, we were not able to include all species of the genus, especially species from the Democratic Republic of Congo or East Africa. Sampling in the African rainforests is currently not uniformly carried out, and could be improved. Another way to increase sampling is to use new NGS sequencing methods to extract DNA from herbaria preserved in European Herbarium institutions, and obtain genetic information from the chloroplast and ribosome as we have done, but potentially from low-copy nuclear genes as well. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La création de nouvelles fonctions basées sur la reconnaissance protéique et sur l'assemblage de domaines est un enjeu majeur en biotechnologie et est un moyen de comprendre les relations structures/fonctions des protéines engagées dans des processus d'interactions. Aujourd’hui, des bibliothèques de protéines artificielles obtenues par ingénierie peuvent être sources de protéines aux propriétés de reconnaissance analogues à celles des dérivés d’anticorps.L’équipe Modélisation et Ingénierie des Protéines a ainsi construit une banque de protéines à motifs structuraux répétés appelées « alphaReps ». Les alphaReps présentent des propriétés remarquables en termes de production et de stabilité. Contrairement à la plupart des anticorps et dérivés d’anticorps, elles peuvent même s’exprimer sous forme fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes. De tels objets peuvent donc maintenant être utilisés comme des briques élémentaires en vue d’une ingénierie modulaire. Ainsi la construction de nouvelles fonctions de reconnaissance optimisées tant au niveau de la spécificité que de l’affinité sera possible en réarrangeant et/ou dupliquant ces briques élémentaires.Un premier volet de ce projet de thèse a consisté à construire puis étudier les propriétés biophysiques de protéines bidomaines basées sur les alphaReps afin de mieux comprendre les comportements adoptés par de telles constructions. Outre l’aspect fondamental de cette question, cette étude donnera « les règles » pour moduler de façon contrôlée les interactions entre ces protéines. Les résultats montrent qu'il est possible de créer de nouvelles fonctions par simple ajout d'un linker entre deux alphaReps : avidité, coopérativité, changement de conformation.Dans un second temps, l’objectif a été de développer, à partir des protéines bidomaines précédemment étudiées, de nouveaux biosenseurs basés sur le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pouvant être utilisés in vivo et in vitro. Cette deuxième partie présente deux biosenseurs avec des limites de détection de l'ordre du nanomolaire. Les alphaReps utilisées dans ces constructions pouvant être changées en fonction de la cible souhaitée, il s'agit ici d'une preuve de concept pouvant être généralisée à n'importe quelle cible.Enfin la dernière partie de cette thèse s'est portée sur la conception et l'étude de nouveaux biosenseurs génétiquement codables. Ces biosenseurs présentent notamment l’avantage d’être utilisables immédiatement après production et ne nécessitent donc plus d’étape de couplage chimique. Les résultats obtenus montrent que la création de tels biosenseurs est possible mais qu’une optimisation reste encore nécessaire pour améliorer leur spécificité, leur stabilité et leur capacité de détection. / The creation of new protein functions based on recognition and molecular assembly is not only a major goal in biotechnology but is also a means to understand the relation structure/function of proteins involved in interaction processes. Today, libraries of artificial proteins obtained by engineering can be a source of proteins with recognition properties similar to the properties of antibodies.The team Protein Engineering and Modeling has thus created a library of proteins with structural repeats called the “alphaReps”. The alphaReps present remarkable properties in terms of production and stability. Unlike most of the antibodies and their derivatives, they can even be expressed and functional in the cytoplasm of eukaryotic cells. Such objects can therefore be used as building bricks in modular engineering. The construction of new optimized recognition functions both in specificity and in affinity can then be possible by rearranging or duplicating these elementary bricks.The first part of this thesis project consisted in the construction and study of the biophysical properties of bidomain proteins based on alphaRep in order to have a better understanding of the behaviour of such constructions. Beside the fundamental aspect of this question, this study will give the “rules” to modulate the interactions between these proteins in a controlled way. The results show that it is possible to create new functions such as avidity, cooperativity, conformational change, simply by adding a linker between two alphaReps.In a second step, the goal was to develop, with the bidomain proteins previously studied, new biosensors based on the FRET (Förster Resonance Energy Transfer) which can be used in vivo and in vitro. This second part presents two biosensors with limits of detection in the nanomolar range. Since the alphaReps used in these constructions can be changed depending on the chosen target, it is a proof of concept which can be adapted to any desired target.Finally, the third part of this thesis focused on the development of genetically codable biosensors. These biosensors have the particular advantage of being usable directly after production and therefore no longer require a chemical coupling step. The results show that the development of such biosensors is worth considering but an optimization is still required in order to improve their specificity, their stability and their detection capacity.

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IKAROS est un facteur de transcription majeur dans l’hématopoïèse qui agit en recrutant à la chromatine de nombreux partenaires décisifs dans le renouvellement cellulaire et l’engagement vers des lignages spécifiques. Il est notamment requis dans les cellules lymphoïdes pour réprimer les gènes cibles de la voie de signalisation NOTCH. IKAROS est aussi important dans le développement des cellules érythroïdes dans lesquelles il facilite le passage d’une globine fœtale à adulte chez l’embryon grâce au recrutement des complexes remodeleurs de la chromatine NuRD et BAF. En condition normale, la voie de signalisation NOTCH réprime la différenciation en cellules érythroïdes. Il est donc important que les gènes cibles de la voie NOTCH soient finement régulés afin d’amener une cellule progénitrice à se différencier en érythrocyte énucléé. Dans les cellules hématopoïétiques, incluant les cellules érythroïdes, IKAROS est un régulateur important du gène Hes1, cible effectrice majeure de la voie NOTCH. En effet, IKAROS participe activement à la répression du gène Hes1, permettant le développement des cellules érythroïdes. Nous avons donc émis l’hypothèse que dans ces cellules, IKAROS pourrait avoir une action plus généralisée sur le contrôle des gènes ciblés par NOTCH, comme observé dans les cellules lymphoïdes. Il pourrait ainsi agir en recrutant les complexes enzymatiques nécessaires à la régulation de ces gènes comme NuRD et BAF afin d’assurer le développement des cellules érythroïdes. Étant donné que la régulation des gènes est aussi dépendante du motif de méthylation de l’ADN, nous avons étendu notre questionnement à cet autre aspect de la régulation qu’IKAROS pourrait utiliser pour contrôler les gènes de la voie NOTCH. Pour ce faire, nous avons procédé à l’analyse bio-informatique d’un séquençage d’ARN de cellules érythroïdes murines préalablement réalisé au laboratoire afin d’en extraire les gènes régulés par IKAROS, mais aussi par NOTCH. L’analyse nous a permis d’extraire deux motifs d’expression intéressants observés dans les cellules érythroïdes pour lesquels IKAROS réprime ou active des gènes qui sont normalement réceptifs à l’activation de la voie NOTCH. Parmi les gènes réprimés par IKAROS en sont ressortis les gènes cibles de NOTCH Cdkn1a (P21WAF1/CIP1) et Trp53 (TP53), dont l’expression augmente fortement quand IKAROS est muté et que NOTCH est actif. Parmi les gènes activés par IKAROS en sont ressortis les gènes cibles de NOTCH Prdm16 et Nrarp, dont l’expression diminue fortement quand IKAROS est muté et que NOTCH est actif. IKAROS est donc un régulateur pouvant être répresseur, mais aussi activateur d’une multitude de gènes ciblés par NOTCH dans les cellules érythroïdes. Par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, nous avons pu observer qu’IKAROS semblait toujours agir en partenariat avec le complexe NuRD et que la présence du complexe BAF était plutôt dépendante de la voie NOTCH. L’association IKAROS-NuRD semble servir de plateforme pour imposer un état de chromatine bivalente (avec co-présence de H3K4me3 et de H3K27me3) associée à une pause transcriptionnelle. Dans ce contexte, les éléments nécessaires à l’initiation de la transcription (présence de la marque H3K4me3) des gènes ciblés par NOTCH sont recrutés mais, l’élongation transcriptionnelle est affectée. L’état de chromatine bivalente peut être associé à l’activité des déméthylases de l’ADN Ten-Eleven-Translocation (TET) qui empêchent alors l’hyperméthylation de ces régions. Nos résultats démontrent qu’IKAROS peut utiliser la protéine TET1 pour réguler des gènes cibles de la voie NOTCH, en y formant l’hydroxyméthylcytosine (5-hmC). Celle-ci peut aussi marquer les régions de régulation génique caractérisées par une chromatine bivalente et une pause transcriptionnelle. Ces travaux décrivent IKAROS comme un facteur agissant de façons multiples dans la régulation des gènes cibles de NOTCH dans les cellules érythroïdes. Nous proposons qu’IKAROS et son partenaire NuRD soient requis pour mettre en place un état de chromatine bivalente et de pause transcriptionnelle pour faciliter l’activation physiologique des gènes cibles de NOTCH lors de la signalisation. IKAROS peut ainsi prendre part à l’activation ou la répression de gènes cibles de NOTCH, tout en facilitant la déméthylation de l’ADN ainsi que le recrutement d’éléments transcriptionnels qui favorisent un état de pause transcriptionnelle. NOTCH ainsi que d’autres éléments de régulation sont alors requis pour induire l’activation ou la répression des gènes cibles. / IKAROS is a critical transcription factor in hematopoiesis. It facilitates the chromatin binding of many important co-factors required for chromatin organization during cell renewal and lineage commitment. IKAROS is particularly important in lymphoid cells whereby it is involved in the repression of target genes of the NOTCH signaling pathway. IKAROS is also important in the development of other hematopoietic lineages, including the erythroid cells, in which it facilitates the passage of a fetal to adult globin in the embryo through the recruitment of the chromatin remodeling complexes NuRD and BAF. Under normal conditions, the NOTCH signaling pathway represses development of erythroid cells. It is therefore important to precisely understand how the NOTCH target genes are regulated during passage from hematopoietic progenitor to the enucleated circulating erythrocyte. IKAROS has been demonstrated to be an important regulator of Hes1 gene expression in hematopoietic cells of different lineages. Hes1 is the major effector target of the NOTCH pathway and IKAROS actively participates in its repression. In erythroid cells, the regulation of Hes1 imposed by IKAROS is required for terminal differentiation. We therefore investigated the importance of IKAROS in the regulation of NOTCH-targeted genes in erythroid cells. The combined effect of the mutation of IKAROS with NOTCH signaling was particularly investigated in these cells. To define how IKAROS influences the regulation of NOTCH target genes, we performed the bioinformatics analysis of a RNA-sequencing performed in murine erythroid cells activated or not for NOTCH signaling and whereby IKAROS is absent. We identified genes influenced by IKAROS expression and by NOTCH, and defined the effect of the combination of the absence of IKAROS expression and NOTCH pathway activation. Two particular expression patterns were identified and characterized the combined effect of the absence of IKAROS and NOTCH pathway activation in erythroid cells. Indeed, the absence of IKAROS either favors the overexpression of NOTCH target genes or prevents their response to NOTCH pathway activation. To understand how IKAROS could have an opposite effect on different NOTCH target genes we analysed the effect of IKAROS on their regulation. Among the genes repressed by IKAROS are the target genes of NOTCH Cdkn1a (encoding the P21WAF1/CIP1 protein) and Trp53 (encoding the TP53 protein), whose expression increases strongly when IKAROS is mutated and the NOTCH pathway is activated. Prdm16 and Nrarp are, instead, requiring IKAROS expression for their activation by NOTCH. The characterization of these NOTCH target genes suggests that IKAROS can work in partnership with the NuRD complex to influence the expression. The chromatin characterization of these genes led us to posit that the IKAROS-NuRD could act as a ‘platform’ to impose a bivalent chromatin organization associated with poised transcription. Then, the regulation imposed by IKAROS-NuRD would be required for the physiological activation of NOTCH targets upon external signaling. Finally, since in embryonic stem cells the Ten-Eleven Translocation (TET) enzymes are reported to be frequently associated to bivalent chromatin in order to prevent DNA hypermethylation, we assessed whether IKAROS could interact and ‘use’ TET enzymes to regulate NOTCH target genes. We determined that IKAROS can co-immunoprecipitate with the TET1 enzymes. We show that IKAROS influences both recruitment and activity of TET1 to different NOTCH target genes and favors the accumulation of hydroxymethylcytosine (5-hmC) to these genes. 5-hmC can be considered as a mark of transcriptional pausing/bivalence. Thus, these studies bring new information on the mechanism used by IKAROS to influence gene regulation in hematopoietic cells. Our results suggest that IKAROS primary function is to organize a bivalent chromatin and to promote transcriptional pausing to multiple NOTCH target genes. IKAROS is required to set the epigenetic and promoter organization for rapid activation upon NOTCH signaling.

La modification post-traductionnelle par les « Small Ubiquitin-Like MOdifyers (SUMOs) » est un processus majeur de régulation qui influence plus d’une centaine de protéines. Cette modification (SUMOylation) touche plusieurs fonctions nucléaires telles que la réparation de l’ADN, la réplication et la transcription. La SUMOylation affecte une protéine le plus souvent en permettant la formation de nouvelles interactions protéine-protéines avec des facteurs de régulations qui possèdent un court segment hydrophobe dans leur séquence connu sous le nom de « SUMO interacting motif (SIM) ». Bien que les interactions SUMO-SIMs soient bien documentées, la description de leur régulation n’est pas complète. Cette thèse décrit des études fonctionnelles et structurales sur différents mécanismes de régulation des interactions SUMO-SIMs. Plus précisément, elle décrit les effets de l’acétylation et de la queue N-terminale des protéines SUMOs sur leur capacité à réguler les interactions entre SUMOs et les SIMs de trois protéines : le suppresseur de tumeur « promyelocytic leukemia (PML) », le corépresseur de transcription « Death Domain Associated Protein 6 (Daxx) » et « Protein Inhibitor of Activated STAT (PIAS) », une ligase E3 pour SUMO. La première étude décrit l’effet de l’acétylation de SUMO1 sur sa capacité à interagir avec les SIMs de PML et de Daxx. À partir d’expériences de titrage calorimétrique et d’études cristallographiques, nous avons démontré que l’acétylation précise de certains résidus conservés chez SUMO1 (K39 et K46) réduit fortement l’affinité avec les deux SIMs testés. En contraste, nous démontrons que l’acétylation du résidu K37 sur SUMO1 à un effet inhibiteur spécifique pour le SIM de Daxx. Les structures cristallographiques des complexes formés entre les variants acétylés de SUMO1 avec les SIMs concordent avec les données des titrages et suggère une plasticité dans la formation des liens sur la surface d’interaction. Partant de ce constat, nous postulons que la plasticité observée dans la structure des complexes acétylés démontre un mécanisme de régulation des interactions SUMO-SIMs par l’acétylation de résidus conservés chez SUMO1. Dans la deuxième étude, nous avons identifié un deuxième SIM à l’extrémité C-terminale de protéines de la famille (PIAS1-2-3). Nous démontrons que ce SIM est capable de lier SUMO1 et que structurellement la phosphorylation de résidus clés dans ce domaine ainsi que l’acétylation de SUMO1 peut contrôler cette interaction. Une comparaison avec le premier SIM des variants PIAS démontre que les deux SIMs sont affectés différemment par la phosphorylation et l’acétylation. En outre, nous avons déterminé que le nouveau SIM identifié joue un rôle important dans la formation d’un complexe ternaire répresseur de la transcription, formé des protéines PIAS, SUMO1 et de l’enzyme de conjugaison « UBiquitin Conjugating enzyme E2I (UBC9) ». Pris ensemble, ces résultats donnent une description atomique de l’interaction d’un nouveau SIM chez PIAS avec SUMO1 et décris comment la phosphorylation et l’acétylation peuvent sélectivement réguler la spécificité des SIM trouvés chez les variants PIAS. Finalement, dans la dernière étude, nous avons exploré le rôle de la queue N-terminale des paralogues SUMO1 et 2 sur sa capacité à moduler les interactions SUMO-SIMs. Nous avons démontré que la queue N-terminale de SUMO1, mais pas SUMO2, avait un effet auto-inhibiteur sur les interactions SUMO-SIMs et que cet effet dépendait de la présence de résidus chargés négativement présent dans le SIM. Aussi, nous avons démontré que l’effet auto-inhibiteur était spécifique à la surface d’interaction des SIMs sur SUMO1. De plus à partir d’études cristallographiques et de calorimétrie, nous avons démontré que l’effet auto-inhibiteur de la queue N-terminale de SUMO1 peut être neutralisé par la présence de zinc. La structure cristallographique du complexe entre SUMO1 et le SIM de PML démontre que le zinc stabilise la formation de liens entre des résidus chargés négativement du SIM et de la queue N-terminale de SUMO1. De plus, le zinc induit la formation d’une hélice α dans la queue N-terminale de SUMO1 qui est normalement intrinsèquement désordonnée. En résumé, cette étude donne une description atomique de l’effet de l’acétylation sur les interactions SUMO-SIMs, décris un nouveau SIM dans la famille de protéines PIAS et identifie un nouveau rôle de la queue N-terminale de SUMO1 ainsi que comment cette région peut définir la sélectivité des paralogues SUMOs. / Post-translational modification with the « Small Ubiquitin-Like MOdifyer (SUMO) » is a major regulatory process (commonly referred to as SUMOylation) that regulates hundreds of proteins associated with a diverse array of biological activities including several nuclear functions such as DNA repair, replication and transcription. SUMOylation of a protein can impact its function in many ways most often by providing an additional binding surface for forming protein-protein interactions with regulatory factors through short hydrophobic regions on their binding partners known as « SUMO interacting motif (SIM) ». Although SUMO-SIM interactions are well documented, there are nevertheless outstanding questions that still need to be addressed regarding their controlling mechanisms. This thesis reports functional and structural studies on the regulatory mechanisms that govern SUMO-SIM interactions. More precisely, we studied how acetylation and the amino-terminal tail of SUMO proteins affects the interaction of SUMO with model SIMs from three proteins: the « promyelocytic leukemia (PML) » tumor suppressor, the transcriptional corepressor « Death Domain Associated Protein 6 (Daxx) » and the SUMO E3 ligase « Protein Inhibitor of Activated STAT (PIAS) ». The first study reports the role that acetylation of SUMO1 plays on its binding to the SIMs of PML and Daxx. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) experiments demonstrated that acetylation of SUMO1 at conserved residues (K39 and K46) dramatically reduces the binding to the SIMs of PML and Daxx. In contrast, SUMO1 acetylation at K37 dramatically reduced binding to the SIM of Daxx but only had minimal impact on binding to the SIM of PML. Crystal structures of the SUMO1 acetylated variants bound to the two SIMs support the ITC titrations and suggest that there is plasticity in SUMO-SIM interactions. The plasticity observed in the structures of these complexes would provide a robust mechanism for regulating SUMO-SIM interactions using a combination of signalling mechanisms that control post-translational modifications. In the second study, we identified and characterized a novel SIM at the C-terminal extremity of three of the four known variants of the PIAS-family proteins (PIAS1-2-3). We demonstrated that this SIM binds to SUMO1 and structurally show that phosphorylation of the SIM or acetylation at select lysine residues of SUMO1 alters this interaction. In addition, we determined that it plays an important role in the formation of ternary complex made of SUMO1, PIAS1 and the « UBiquitin Conjugating enzyme E2I (UBC9) » in human cells. Together, these results provide an atomic description of the interaction between the C-terminal SIM of PIAS proteins and SUMO1 as well as important insight into how posttranslational modifications selectively regulate the specificity of the SIMs found in PIAS1-2-3. Finally, our third study explores the intrinsically disordered N-terminal tail of SUMO paralogs and their ability to regulate SUMO-SIM interactions. We demonstrate that the N-terminal region of SUMO1, but not SUMO2, has an auto-inhibitory effect on the binding to SIMs and that this effect is dependent on the presence of acidic or phosphorylated residues that within the SIM. In addition, we also determined that this inhibition does not affect the interaction of SUMO1 with its E2 conjugating enzyme UBC9. Using titration calorimetry and crystallographic screening, we identified zinc as a negative regulator of this auto-inhibitory effect. The crystallographic structure of the complex between SUMO1 and the SIM of PML shows that zinc stabilises the formation of interactions with the negatively charged residues within the SIM and the N-terminal tail of SUMO1. Interestingly, zinc also appears to stabilize the formation of an α-helix within the N-terminal tail of SUMO1 which is normally intrinsically disordered. In summary, this thesis describes the underlying atomic regulatory mechanisms of SUMO-SIM interactions by acetylation, reveals a novel SIM within the PIAS SUMO E3 ligase family and describes an unprecedented role of the N-terminal region of SUMO1 and provides important insight on how this region can define SUMO paralog specificity.

La sénescence cellulaire est un mécanisme naturel de suppression tumorale défini par un arrêt stable de la prolifération. Bien que presque toujours mutées dans au moins une des voies déclenchant la sénescence (ex : p53/p21 ou p16/Rb), les cellules cancéreuses conservent souvent la capacité d’y entrer en réponse au traitement. Cette sénescence induite par la thérapie (SIT) peut être ciblée pharmacologiquement pour en renforcer les effets positifs. Une approche émergente consiste à combiner un traitement anticancéreux induisant la sénescence à un sénolytique, agent éliminant spécifiquement les cellules sénescentes. Dans le contexte du cancer de la prostate (CP), différents types de SIT ont déjà été observées dans de multiples modèles exposés à différents traitements. Cependant, le manque de données comparant ces phénotypes souligne le besoin d’analyses plus systématiques. De plus, la sensibilité aux sénolytiques des cellules du CP en état de SIT n’a pas encore été évaluée dans ces contextes. Dans cette étude, nous avons évalué les destins cellulaires des lignées du CP après exposition à trois traitements pertinents au niveau clinique : l’irradiation et l’olaparib, deux inducteurs de dommages à l’ADN et l’enzalutamide, un anti-androgène. Dépendamment de la lignée, les traitements par irradiation et olaparib ont mené à une réponse dirigée principalement vers la sénescence ou vers une réponse mixte de mort cellulaire, de catastrophe mitotique et de sénescence. Dans tous les cas, ceux-ci ont déclenché un phénotype sénescent classique et convertible en mort cellulaire par des sénolytiques inhibiteurs des antiapoptotiques de la famille Bcl-2. D’autre part, le traitement à l’enzalutamide a déclenché un phénotype semblable à la sénescence se distinguant par sa réversibilité, son absence de dommages à l’ADN et son insensibilité à ces mêmes sénolytiques. Globalement, nos résultats soulignent l’importance du contexte thérapeutique dans l’élaboration des stratégies de manipulation de la SIT du CP. Ils constituent également une justification robuste à l’étude préclinique des traitements combinant la radiothérapie ou l’olaparib à des inhibiteurs des antiapoptotiques de la famille Bcl-2 dans le contexte du CP. / Cellular senescence is a natural tumor suppression mechanism defined by a stable proliferation arrest. Although almost always mutated in at least one of the senescence pathways genes (e.g., p53/p21 or p16/Rb), cancer cells often retain the ability to become senescent in response to treatment. This therapy-induced senescence (TIS) can be pharmacologically targeted to enhance its positive effects. An emerging approach is to combine senescence-inducing cancer treatment with senolytics, compounds that specifically eliminate senescent cells. In the context of prostate cancer (PCa), different types of TIS have already been observed in multiple models exposed to different treatments. However, the lack of data comparing these phenotypes highlights the need for more systematic analyses. In addition, the senolytic sensitivity of TIS PCa cells has not yet been evaluated in these settings. In this study, we evaluated the cell fates of PCa cell lines after exposure to three clinically relevant treatments: irradiation and olaparib, two DNA damage inducers, and enzalutamide, an anti-androgen. Depending on the cell line, irradiation and olaparib treatments led to a response mainly directed towards senescence or toward a mixed response of cell death, mitotic catastrophe and senescence. In all cases, these treatments triggered a classic senescent phenotype that was convertible to cell death by senolytic inhibitors of the Bcl-2 family antiapoptotics. On the other hand, treatment with enzalutamide triggered a senescence-like phenotype, distinguishable by its reversibility, absence of DNA damage and insensitivity to these same senolytics. Overall, our results underscore the importance of the therapeutic context in the development of PCa-TIS manipulation strategies. They also provide a robust rationale for the preclinical study of treatments that combine radiotherapy or olaparib with Bcl-2 family antiapoptotic inhibitors in the PCa context.

Le système lymphatique joue un rôle clé dans le transport du cholestérol hors de la paroi artérielle et une dysfonction lymphatique précède l'apparition de l'athérosclérose. Cette dysfonction est associée à une diminution de l’expression du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et est à priori indépendante des taux de cholestérol circulant. Il a été démontré que les souris dépourvues de la proprotéine subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une proprotéine qui mène à la dégradation du LDLR, ont une fonction lymphatique améliorée, tandis que les souris dépourvues de LDLR développent une dysfonction lymphatique. Nous visons maintenant à mieux comprendre les mécanismes par lesquels la présence de PCSK9 dans la lymphe ou la modulation du LDLR sur les cellules endothéliales lymphatiques (CEL) affecte la fonction lymphatique. Les CEL sont incubées avec du PCSK9 ou traitées avec un ARN inhibant spécifiquement l’expression du LDLR afin d’évaluer comment la présence de PCSK9 ou la modulation du LDLR affecte l'intégrité des CEL. Nos résultats démontrent que le PCSK9 n’induit pas la sécrétion de cytokines inflammatoires et n'affecte pas l'expression des marqueurs lymphatiques. L’inhibition de l’expression du LDLR entraîne une diminution des marqueurs lymphatiques membranaires endothéliaux. La diminution du LDLR a aussi entrainé une diminution des taux de certains lipides intracellulaires et en particulier des phospholipides, des sphingolipides et des triglycérides. Ces résultats suggèrent qu'une perte du LDLR, mais pas la présence de PCSK9 en circulation, pourrait induire à une altération de l'endothélium lymphatique causée par une diminution de l’expression de protéines membranaires essentielles au bon transport de la lymphe. / The lymphatic system plays a key role in the removal of cholesterol from the artery wall and lymphatic dysfunction is known to occur prior to the onset of atherosclerosis. This dysfunction is associated with reduced expression of the low-density-lipoprotein receptor (LDLR) and is first independent of circulating cholesterol levels. It has been shown that mice lacking proprotein subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), a proprotein that degrades LDLR, have improved lymphatic function while mice lacking LDLR had a lymphatic dysfunction. We now aim to better understand the mechanisms by which the presence of PCSK9 in lymph or the modulation of LDLR on lymphatic endothelial cells (LECs) affects lymphatic function. Incubation of LECs with PCSK9 and specific targeting of LDLR expression with silencing RNAs were used to further evaluate how PCSK9 or modulation of LDLR affect the metabolism and integrity of LECs. Our results demonstrate that PCSK9 does not induce the secretion of inflammatory cytokines and does not affect the expression of lymphatic markers. LDLR silencing RNA leads to a decrease of membrane-bound lymphatic endothelial cell markers. A decrease in LDLR expression also led to a decrease in the content of some intracellular lipids and particularly phospholipids, sphingolipids and triglycerides. These results suggest that loss of LDLR expression, but not circulating PCSK9, could lead to alterations in the lymphatic endothelium caused by loss of membrane integrity which could in turn affect lymph transport.

Les petites GTPases RAS alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Ce mécanisme permet aux protéines RAS de transmettre les signaux des récepteurs se trouvant à la surface cellulaire vers divers réseaux de signalisation en aval. La protéine RAS joue un rôle important dans plusieurs fonctions biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et même l'apoptose. Les mutations des gènes de la famille RAS sont retrouvées dans environ un tiers des tumeurs. HRAS, KRAS et NRAS, les trois principaux homologues de la protéine RAS, sont principalement mutées au niveau des codons 12, 13 ou 61. Les mutations avec un effet de gain de fonction au niveau de ces codons rendent ces protéines RAS constitutivement actives et sont à l’origine des signaux hyperprolifératifs. Depuis la découverte de la protéine RAS, de nombreuses "protéines effectrices RAS" agissant en aval ont été identifiées. Le rôle biologique de la plupart de ces effecteurs RAS est lié à la prolifération et à la survie des cellules. Cependant, au cours des deux dernières décennies une nouvelle famille d'effecteurs RAS, les protéines RASSF, a été découverte comme ayant une fonction pro-apoptotique. Les protéines suppresseures de tumeurs de la famille RASSF sont fréquemment inhibées dans les cellules cancéreuses humaines. Il existe 10 homologues de RASSF (RASSF1-10) chez humain, chacun comprenant un domaine d'association RAS (RA) impliqué dans la liaison avec les GTPases RAS. Plusieurs RASSF comportent également les domaines SARAH (Salvador-RASSF-Hippo), connus pour interagir avec les kinases Hippo contenant aussi les domaines SARAH. On ne sait toutefois pas si toutes les protéines RASSF sont de véritables effecteurs RAS. Il a été démontré qu'un seul membre de la famille RASSF, appelé RASSF5, s'associe directement à HRAS et cette interaction a été validée par des études cristallographiques à rayons X. Dans la première partie de cette thèse, je démontre qu'aucun autre membre de la famille RASSF n'interagit directement avec KRAS. En me servant de la modélisation par l'homologie du domaine RA hautement apparenté de RASSF1, j’ai identifié les acides aminés essentiels pour l’interaction avec la GTPase. Je démontre que la substitution d’un seul acide aminé dans la protéine RASSF1 permet l'interaction avec KRAS, et je pose l'hypothèse que ce résidu, ayant divergé au cours de l'évolution, a modifié la spécificité de RASSF1 pour les petites GTPases. En utilisant une approche informatique, nous avons prédit six GTPases candidates que pourraient interagir avec RASSF1 : GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS et DIRAS3. J'ai validé les interactions avec plusieurs GTPases RGK (GEM, REM1, REM2) et j’ai démontré que la co-expression des GTPases RGK avec RASSF1 active la voie Hippo. Ainsi, je propose un nouveau lien entre ces GTPases peu étudiées et la régulation de la voie de signalisation Hippo. Dans la deuxième partie de ma thèse, je tente de rediriger la signalisation de prolifération cellulaire de KRAS (RAF/MAPK) vers une signalisation impliquant les effecteurs pro-apoptotiques (RASSF-Hippo). Pour y parvenir, j'ai conçu des mutations dans KRAS dans le but d’augmenter son affinité pour RASSF5 et d’affaiblir son interaction avec BRAF. Comme deuxième stratégie, j'ai remplacé les résidus divergents de l'effecteur RASSF1 par les résidus correspondants de RASSF5 et j’ai démontré que cette variante de RASSF1 est capable de lier KRAS. Diverses approches biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour valider KRAS et RASSF1 mutés, impliquées dans cette signalisation redirigée. Les études de co-localisation montrent que ces mutants interagissent avec leurs nouveaux partenaires comme prévu. D’autre part, je démontre par les expériences intracellulaires que KRAS modifiée ne lie plus BRAF tout en interagissant fortement avec RASSF5 et RASSF1, et que les mutants établis activent la voie Hippo. Ainsi, j'ai développé deux approches qui nous aideront à étudier la signalisation de KRAS dans la voie pro-apoptotique impliquant RASSF en absence de l’activation de la voie des MAP kinases. Les données présentées ici nous permettent de mieux comprendre la manière dont les protéines RASSF ont divergé au cours de l'évolution; cette divergence leur empêchant d’interagir avec les RAS. Ces données fournissent également une stratégie innovante pour rediriger les signaux RAS vers les effecteurs RASSF, qui pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie dans les études cliniques utilisant RAS comme cible thérapeutique. / RAS small GTPases function as molecular switches to transduce signals from cell surface receptors to various downstream signalling networks. The RAS protein has roles in multiple biological functions, including cell proliferation, survival, and even apoptosis. Mutations in RAS genes are present in up to 30% of all human tumors. The three major RAS homologs HRAS, KRAS, and NRAS are each found mutated, predominantly at codons 12, 13 or 61. Gain-of-function mutations at these codons render these RAS proteins constitutively active and thereby produce hyperproliferative signals. Since the discovery of RAS, numerous downstream ‘RAS effector proteins’ have been identified. The biological role of most identified RAS effectors relates to cell proliferation and survival, however, in the past two decades a new family of RAS effectors, RASSF proteins, were discovered to have a pro-apoptotic function. The RASSF family of tumor suppressors proteins are frequently downregulated in human cancer cells. There are 10 RASSF homologs (RASSF1-10) in humans, each comprising a RAS association (RA) domain presumed to bind RAS GTPases. RASSF also encode SARAH (Salvador-RASSF-Hippo) domain, known to interact with SARAH-containing Hippo kinases. It is not clear whether all the RASSF proteins are true RAS effectors. Only a single family member, RASSF5, has been shown to directly associate with HRAS and this interaction has been completely validated by X-Ray crystallographic studies. In the first part of this thesis, I demonstrate that no other RASSF family members directly interact with KRAS. I used homology modelling of the highly related RASSF1 RA domain to identify amino acids crucial to GTPase binding. I show that a single amino acid substitution in RASSF1 enables interaction with KRAS, and hypothesize that this evolutionarily diverged residue has altered RASSF1 specificity for small GTPases. Using an informatics approach, we predicted six candidate GTPases that could interact with RASSF1: GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS and DIRAS3. I validated interactions with several RGK GTPases (GEM, REM1, REM2) and show that co-expression of RGK GTPases with RASSF1 activates the Hippo pathway. Thus, I show a novel link between these unstudied GTPases to Hippo pathway regulation. In the second part of my thesis I attempt to rewire KRAS signalling from cell proliferation pathways (RAF/MAPK) to pro-apoptotic effectors (RASSF-Hippo). To achieve this, I designed mutations in KRAS that augmented its affinity for RASSF5 and weakened interaction with BRAF. As a second strategy, I reverted evolutionarily diverged residues in the RASSF1 effector to corresponding residues in RASSF5 and demonstrate that this variant now binds KRAS. Various biophysical and biochemical approaches were used to validate both the KRAS and RASSF1 rewired mutants, and co-localization studies show that these mutants interact with their new binding partners as predicted. Further, I demonstrate that our rewired KRAS no longer binds BRAF in cells but interacts strongly with RASSF5 and rewired RASSF1, and that the rewiring mutants activate the Hippo pathway. Thus, I have developed two rewiring approaches that will help us to study KRAS signalling towards pro-apoptotic RASSF pathway in the absence of strong MAP kinase activation. The data presented here provide several novel insights into how RASSF proteins diverged through evolution and are not all direct effectors of RAS. In addition, I present an innovative rewiring strategy to couple RAS signals towards RASSF effectors which can be a clinical tactic to target RAS oncogenesis.