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La phase-M chez les ovocytes et les embryons de mammifères : impact et conséquence d’une prolongation de la phase-MAllais, Adélaïde 08 1900 (has links)
Un couple canadien sur six aurait des problèmes de fertilité. Jusqu’à 70% des embryons humains générés en clinique de fertilité possèdent des cellules avec un nombre erroné de chromosomes appelées cellules aneuploïdes. L’aneuploïdie est le résultat d’une mauvaise ségrégation des chromosomes durant la division cellulaire et réduit les chances de grossesse à terme. Il fut démontré que les embryons ont un temps de division différent et que ce temps peut être un indicateur de sa santé. Cependant, comment cette division affecte l’embryon au niveau cellulaire reste à démontrer.
Chez les cellules somatiques, le temps de divisions cellulaires (phase-M) est directement lié à l'intégrité chromosomique. Plus précisément, une phase-M prolongée peut provoquer une séparation prématurée des chromatides sœurs appelée "fatigue des cohésions" (CF). Indépendamment, divers mécanismes réduisent les erreurs de ségrégation des chromosomes. L’un d’entre eux, le point de contrôle de l'horloge mitotique (mitotic-timer) fut décrit chez les cellules somatiques comme actif après une prolongation de la phase-M provoquant ainsi un arrêt G1/S des cellules filles. L’existence du mitotic-timer et la présence de CF chez l'embryon de mammifère reste inconnues. Des travaux suggèrent que certains points de contrôle sont défaillants chez les embryons. Ici, nous faisons l’hypothèse que les embryons préimplantatoires n'ont pas de mitotic-timer et examinons leurs capacités de division après une exposition à des agents perturbateurs de la mitose.
La durée de la phase-M fut manipulée chez des embryons de souris au stade deux-cellules avec un inhibiteur du complexe de promotion de l’anaphase. L'imagerie de cellules fixées et vivantes fut réalisée sur un microscope confocal et à fluorescence inversée. Contrairement aux cellules somatiques, les embryons préimplantatoires ne parviennent pas à activer le mitotic-timer après une phase-M prolongée de 6 heures au stade 2-cellules, et ils se développent jusqu'au stade blastocyste. Cette même extension conduit à la CF, qui induit des défauts de ségrégation chromosomique. En revanche, une extension extrême (14 heures) de la phase-M provoque un arrêt du cycle cellulaire à l'interphase suivante. Également, une accumulation de dommages à l'ADN est observée avec l'individualisation des chromosomes en phase-M. Pour résumer, une prolongation extrême de la phase-M provoque un arrêt du cycle cellulaire. Une phase-M de 6 heures suffit à provoquer des erreurs de ségrégation, mais n’active pas le mitotic-timer et conduit ainsi à une instabilité chromosomique.
Par conséquent, comme les embryons sont sensibles à la CF, nous nous sommes demandé si les œufs en métaphase II, où le fuseau persiste pendant plusieurs heures, pourraient également être sujets à la CF. Pour tester cela, nous avons examiné des ovocytes de souris jeunes (2-3 mois) et âgées (16 mois), ainsi que des ovocytes humains. De manière frappante, la fréquence des chromosomes mal alignés n'était pas associée à la durée de l'arrêt en métaphase II, quel que soit l'espèce ou l'âge. En conclusion, contrairement aux embryons, les ovocytes en métaphase-II semblent protégés de la CF pour garantir l'intégrité du génome pendant l'arrêt prolongé qui précède la fécondation. Nous pensons que l’intégration de la durée de la phase-M pourrait améliorer la sélection des embryons viable en clinique. / One in six Canadian couples struggle with infertility. Nearly 70% of human embryos generated in fertility clinics contain aneuploid cells, possessing the wrong number of chromosomes due to errors during embryonic cell division in chromosome segregation. Aneuploidy reduces the risk of full-term pregnancy and is the cause of various genetic disorders. It has been reported that the timing of cell divisions in the early embryo is variable and may be an indicator of embryo health, but we have a limited understanding of how mitotic timing in the embryo impacts the embryo on a cellular level.
In somatic cells the timing of cell divisions has recently been shown to relate directly to chromosome integrity. Specifically, extended M-phase can cause premature separation of sister chromatids, known as "cohesion fatigue" (CF). In addition, several checkpoints operate to reduce chromosome segregation errors. The mitotic timer (MitClock) has been described in somatic cells where an extended duration of M-phase can cause a subsequent G1/S arrest. But whether MitClock can operate in the mammalian embryo, and whether the embryo is susceptible to CF, are unknown. Other work suggests that well characterised genetic integrity-protecting pathways may be lacking in embryos. We therefore hypothesized that early mammalian embryos lack a mitotic clock checkpoint and we aimed to examine their ability to divide following exposure to mitotic disrupting agents.
To address these questions, M-phase duration was manipulated in two-cell stage mice embryos with an anaphase promoting complex inhibitor. Fixed-cell and live imaging were performed on confocal and inverted fluorescence microscopes. In contrast to somatic cells, preimplantation embryos fail to activate MitClock after 6-hours in a prolonged M-phase at the 2-cell stage, and embryos develop to blastocysts. Importantly however, this same extension leads to CF, which induces chromosome segregation defects. In contrast, an extreme (14 hour) M-phase extension causes cell cycle arrest in the subsequent interphase, which we show involves the accumulation of DNA damage and is potentiated by chromosome individualisation in M-phase. To summarise, while extreme elongation of M-phase can cause cell cycle arrest, even a 6-hour M-phase is enough to elicit CF and chromosome segregation errors. The 6-hour M-phase fails to activate a mitotic clock checkpoint and thus leads to chromosomal instability.
As we have shown that embryos are susceptible to CF, we wondered whether Metaphase-II eggs, where the spindle persists for several hours, might also be prone to CF. To test this, we examined oocytes from young (2-3 months) and old (16 months) mice, as well as human oocytes matured from GV stage from patients undergoing fertility treatment. Strikingly, the frequency of misaligned chromosomes was not associated with the length of Metaphase-II arrest regardless of species, or age. We conclude that, contrary to what we found to be the case for mitotic M-phases in the early embryo, the chromosomes on Metaphase-II spindles are protected from cohesion fatigue to protect genome integrity during the prolonged Metaphase-II arrest that precedes fertilization. Altogether, we speculate that integration of M-phase lengths into embryo selection algorithms may in future improve the ability to select the most viable embryo in the clinic.
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Aléatoire et variabilité dans l’embryogenèse animale, une approche multi-échelle / Randomness and variability in animal embryogenesis, a multi-scale approachVilloutreix, Paul 03 July 2015 (has links)
Nous proposons dans cette thèse de caractériser quantitativement la variabilité à différentes échelles au cours de l'embryogenèse. Pour ce faire, nous utilisons une combinaison de modèles mathématiques et de résultats expérimentaux. Dans la première partie, nous utilisons une petite cohorte d'oursins digitaux pour construire une représentation prototypique du lignage cellulaire, reliant les caractéristiques des cellules individuelles avec les dynamiques à l'échelle de l'embryon tout entier. Ce modèle probabiliste multi-niveau et empirique repose sur les symétries des embryons et sur les identités cellulaires; cela permet d'identifier un niveau de granularité générique pour observer les distributions de caractéristiques cellulaires individuelles. Le prototype est défini comme le barycentre de la cohorte dans la variété statistique correspondante. Parmi plusieurs résultats, nous montrons que la variabilité intra-individuelle est impliquée dans la reproductibilité du développement embryonnaire. Dans la seconde partie, nous considérons les mécanismes sources de variabilité au cours du développement et leurs relations à l'évolution. En nous appuyant sur des résultats expérimentaux montrant une pénétrance incomplète et une expressivité variable de phénotype dans une lignée mutante du poisson zèbre, nous proposons une clarification des différents niveaux de variabilité biologique reposant sur une analogie formelle avec le cadre mathématique de la mécanique quantique. Nous trouvons notamment une analogie formelle entre l'intrication quantique et le schéma Mendélien de transmission héréditaire. Dans la troisième partie, nous étudions l'organisation biologique et ses relations aux trajectoires développementales. En adaptant les outils de la topologie algébrique, nous caractérisons des invariants du réseaux de contacts cellulaires extrait d'images de microscopie confocale d'épithéliums de différentes espèces et de différents fonds génétiques. En particulier, nous montrons l'influence des histoires individuelles sur la distribution spatiales des cellules dans un tissu épithélial. / We propose in this thesis to characterize variability quantitatively at various scales during embryogenesis. We use a combination of mathematical models and experimental results. In the first part, we use a small cohort of digital sea urchin embryos to construct a prototypical representation of the cell lineage, which relates individual cell features with embryo-level dynamics. This multi-level data-driven probabilistic model relies on symmetries of the embryo and known cell types, which provide a generic coarse-grained level of observation for distributions of individual cell features. The prototype is defined as the centroid of the cohort in the corresponding statistical manifold. Among several results, we show that intra-individual variability is involved in the reproducibility of the developmental process. In the second part, we consider the mechanisms sources of variability during development and their relations to evolution. Building on experimental results showing variable phenotypic expression and incomplete penetrance in a zebrafish mutant line, we propose a clarification of the various levels of biological variability using a formal analogy with quantum mechanics mathematical framework. Surprisingly, we find a formal analogy between quantum entanglement and Mendel’s idealized scheme of inheritance. In the third part, we study biological organization and its relations to developmental paths. By adapting the tools of algebraic topology, we compute invariants of the network of cellular contacts extracted from confocal microscopy images of epithelia from different species and genetic backgrounds. In particular, we show the influence of individual histories on the spatial distribution of cells in epithelial tissues.
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Aléatoire et variabilité dans l’embryogenèse animale, une approche multi-échelle / Randomness and variability in animal embryogenesis, a multi-scale approachVilloutreix, Paul 03 July 2015 (has links)
Nous proposons dans cette thèse de caractériser quantitativement la variabilité à différentes échelles au cours de l'embryogenèse. Pour ce faire, nous utilisons une combinaison de modèles mathématiques et de résultats expérimentaux. Dans la première partie, nous utilisons une petite cohorte d'oursins digitaux pour construire une représentation prototypique du lignage cellulaire, reliant les caractéristiques des cellules individuelles avec les dynamiques à l'échelle de l'embryon tout entier. Ce modèle probabiliste multi-niveau et empirique repose sur les symétries des embryons et sur les identités cellulaires; cela permet d'identifier un niveau de granularité générique pour observer les distributions de caractéristiques cellulaires individuelles. Le prototype est défini comme le barycentre de la cohorte dans la variété statistique correspondante. Parmi plusieurs résultats, nous montrons que la variabilité intra-individuelle est impliquée dans la reproductibilité du développement embryonnaire. Dans la seconde partie, nous considérons les mécanismes sources de variabilité au cours du développement et leurs relations à l'évolution. En nous appuyant sur des résultats expérimentaux montrant une pénétrance incomplète et une expressivité variable de phénotype dans une lignée mutante du poisson zèbre, nous proposons une clarification des différents niveaux de variabilité biologique reposant sur une analogie formelle avec le cadre mathématique de la mécanique quantique. Nous trouvons notamment une analogie formelle entre l'intrication quantique et le schéma Mendélien de transmission héréditaire. Dans la troisième partie, nous étudions l'organisation biologique et ses relations aux trajectoires développementales. En adaptant les outils de la topologie algébrique, nous caractérisons des invariants du réseaux de contacts cellulaires extrait d'images de microscopie confocale d'épithéliums de différentes espèces et de différents fonds génétiques. En particulier, nous montrons l'influence des histoires individuelles sur la distribution spatiales des cellules dans un tissu épithélial. / We propose in this thesis to characterize variability quantitatively at various scales during embryogenesis. We use a combination of mathematical models and experimental results. In the first part, we use a small cohort of digital sea urchin embryos to construct a prototypical representation of the cell lineage, which relates individual cell features with embryo-level dynamics. This multi-level data-driven probabilistic model relies on symmetries of the embryo and known cell types, which provide a generic coarse-grained level of observation for distributions of individual cell features. The prototype is defined as the centroid of the cohort in the corresponding statistical manifold. Among several results, we show that intra-individual variability is involved in the reproducibility of the developmental process. In the second part, we consider the mechanisms sources of variability during development and their relations to evolution. Building on experimental results showing variable phenotypic expression and incomplete penetrance in a zebrafish mutant line, we propose a clarification of the various levels of biological variability using a formal analogy with quantum mechanics mathematical framework. Surprisingly, we find a formal analogy between quantum entanglement and Mendel’s idealized scheme of inheritance. In the third part, we study biological organization and its relations to developmental paths. By adapting the tools of algebraic topology, we compute invariants of the network of cellular contacts extracted from confocal microscopy images of epithelia from different species and genetic backgrounds. In particular, we show the influence of individual histories on the spatial distribution of cells in epithelial tissues.
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Gènes et comportements: au-delà de l'inné et de l'acquis / Gene and behaviors: beyond nature and nurturePerbal, Laurence 11 March 2009 (has links)
Le contexte historique et épistémologique de l’émergence de la génétique des comportements en tant que discipline trouve ses racines dans différentes disciplines biologiques :la génétique, la biologie de l’évolution et la biologie moléculaire. Ces dernières font partie du paradigme néodarwinien moléculaire. De cette origine, elle a hérité deux grands domaines de recherche, la génétique quantitative et la génétique moléculaire. Ils ont chacun des objectifs et des méthodologies différents. Les études concernant l’intelligence, les comportements agressifs, les comportements addictifs et l’orientation sexuelle permettent notamment d’illustrer ces différences. Elles permettent également de faire un état des lieux des recherches menées dans ce domaine parfois hautement polémique. En fait, la génétique des comportements est marquée par deux ères épistémologiques, l’ère génomique qui a débuté dans les années 1980 et l’ère post-génomique, qui comme son nom l’indique, lui succède dès le début des années 2000. Les résultats apportés par l’ensemble de ces recherches imposent une conclusion, les approches théoriques et techniques phares de l’ère génomique sont insuffisantes à rendre compte de la complexité des phénomènes développementaux liés aux comportements. L’ère post-génomique tente donc de combler les faiblesses de l’ère précédente. Ainsi, la biologie développementale revient au premier plan et ce retour est souhaité depuis longtemps par un courant philosophique majeur né dans les années 1990, la Developmental Systems Theory. L’ère post-génomique est également caractérisée par un pluralisme pragmatique, à la fois théorique et expérimental. La nécessité de multiplier les modes d’appréhension des comportements s’impose car leur complexité intrinsèque est reconnue et tend à être assumée. Les résultats plus récents apportés par les recherches sur l’intelligence, les comportements agressifs, addictifs et l’orientation sexuelle illustrent cette évolution épistémologique. L’opposition entre inné et acquis échoue à rendre compte de la complexité et du dynamisme développemental des phénotypes comportementaux./ The historical and epistemological context of the birth of behavioral genetics as a discipline has its roots in different biological domains: genetics, evolutionary biology and molecular biology. They are parts of the molecular neo-Darwinian paradigm. From this multiple outset, behavioral genetics has inherited two major areas of research, quantitative genetics and molecular genetics. They each have different purposes and methodologies. The study of researches on IQ, aggressive behaviors, addictive behaviors and sexual orientation illustrate these differences. It also permits to make an overview of results provided in this field that is sometimes highly controversial. In fact, behavioral genetics is marked by two epistemological eras, the genomic era that began in the 1980s and the postgenomic era that began by the early 2000s. The results provided by all these researches lead to one conclusion, the theoretical and technical approaches of the genomic era is insufficient to show the complexity of developmental phenomena associated with behaviors. The postgenomic era attempts to correct the weaknesses of the previous era. Thus, developmental biology comes back in the foreground and the necessity of this return has been defended by a major philosophical theory born in 1990, the Developmental Systems Theory. The postgenomic era is also characterized by a theoretical and experimental pragmatic pluralism. The complexity of the developmental patterns of behaviors is recognized and tends to be assumed. The latest results produce by researches on IQ, aggressive behaviors, addiction and sexual orientation illustrate these epistemological changes. The opposition between nature and nurture fails to properly apprehend the developmental dynamism of behavioral phenotypes. / Doctorat en Philosophie / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Rôle de l'auxine et de sa signalisation dans la dynamique et la robustesse des patrons développementaux dans le méristème apical caulinaire / The role of auxin and its signaling pathways in the dynamics and robustness of developmental patterns at the shoot apical meristemOliva Freitas Santos, Marina 17 January 2014 (has links)
Les végétaux, contrairement aux animaux, génèrent la plupart de leurs organes et tissus au cours de leur développement post-embryonnaire et ce, grâce à des tissus contenant de petits amas de cellules souches appelés méristèmes. Le méristème apical caulinaire (MAC), situé à l’extrémité de la tige, génère toute la partie aérienne de la plante. A sa périphérie, les organes latéraux (fleurs ou feuilles) sont générés selon un patron spatio-temporel précis appelé phyllotaxie. De nombreuses données accumulées ces 20 dernières années ont démontré qu’une hormone végétale, l’auxine, joue un rôle prépondérant dans le contrôle du devenir des cellules dans le MAC. Un ensemble de données expérimentales couplées à des modèles mathématiques suggère que l’auxine s’accumule successivement dans les sites d’organogenèse grâce à l’auto-organisation de ses transporteurs membranaires et instruit les cellules à se différencier en organes.Fautes d’outils appropriés, il était impossible jusqu’alors de visualiser l’auxine in vivo et d’étudier sa dynamique temporelle. Nous avons généré un nouveau senseur de la signalisation de l’auxine, appelé DII-Venus, qui permet de visualiser de manière indirecte mais spécifique les niveaux relatifs d’auxine in planta avec une excellente résolution spatio-temporelle. Cet outil a permis de mettre en évidence pour la première fois des oscillations circadiennes d’auxine au niveau du MAC. Une analyse complète de la structure de la voie de réponse transcriptionelle à l’auxine, couplée à des approches de modélisation, a permis de mettre en évidence des propriétés « tampon » de la voie transcriptionnelle qui la rendent relativement insensible aux fluctuations d’auxine, et contribuent à la robustesse du programme organogénétique. En revanche, la voie non-transriptionnelle de réponse à l’auxine, sensible à ces oscillations, génère des rythmicités de croissance au niveau du MAC qui contribuent à déterminer la temporalité de l’émergence de nouveaux organes. Ces résultats démontrent ainsi pour la première fois que la rythmicité de l’émergence de nouveaux organes au niveau du MAC n’est pas uniquement une conséquence des capacités d’auto-organisation du tissu mais est aussi contrôlée, au moins partiellement, par une horloge biologique. / Plants, contrarily to animals, are able to generate new organs and tissues throughout their lives thanks to the activity of specialized tissues containing stem cells called meristems. The shoot apical meristem (SAM), located at the shoot tip, generates all the aerial parts of the plant that arise after germination. At its periphery, organ production occurs following precise spatio-temporal patterns also known as phyllotaxis. During the past twenty years, the phytohormone auxin has been demonstrated to play a major role in this process. Indeed, both experimental and theoretical studies strongly suggest that auxin accumulates successively in sites of organogenesis thanks to its efflux carriers, and instructs cells to differentiate into organs.However, so far, very little is known about the actual temporal dynamics of auxin in tissues, because of the lack of appropriate tool to visualize auxin in vivo. We developed a new auxin signaling sensor, called DII-VENUS, that allows for monitoring auxin levels in planta with a good spatio-temporal resolution. Using this new tool, we were able to demonstrate that for the first time that the SAM is subjected to circadian oscillations of auxin levels. Our data suggest that these oscillations are not perceived by the auxin transcriptional pathway, which is predicted, according to our mathematical models, to exhibit buffering properties. However, they are perceived by the non-transcriptional putative receptor ABP1 and translated into rhythmic growth patterns at the SAM. These growth oscillations seem to regulate organ initiation in the meristem thus demonstrating for the first time the rhythmic emergence of organs at the SAM does not only result from the self-organizing properties of the tissue but is also controlled, at least partially, by a biological clock.
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Aléatoire et variabilité dans l’embryogenèse animale, une approche multi-échelle / Randomness and variability in animal embryogenesis, a multi-scale approachVilloutreix, Paul 03 July 2015 (has links)
Nous proposons dans cette thèse de caractériser quantitativement la variabilité à différentes échelles au cours de l'embryogenèse. Pour ce faire, nous utilisons une combinaison de modèles mathématiques et de résultats expérimentaux. Dans la première partie, nous utilisons une petite cohorte d'oursins digitaux pour construire une représentation prototypique du lignage cellulaire, reliant les caractéristiques des cellules individuelles avec les dynamiques à l'échelle de l'embryon tout entier. Ce modèle probabiliste multi-niveau et empirique repose sur les symétries des embryons et sur les identités cellulaires; cela permet d'identifier un niveau de granularité générique pour observer les distributions de caractéristiques cellulaires individuelles. Le prototype est défini comme le barycentre de la cohorte dans la variété statistique correspondante. Parmi plusieurs résultats, nous montrons que la variabilité intra-individuelle est impliquée dans la reproductibilité du développement embryonnaire. Dans la seconde partie, nous considérons les mécanismes sources de variabilité au cours du développement et leurs relations à l'évolution. En nous appuyant sur des résultats expérimentaux montrant une pénétrance incomplète et une expressivité variable de phénotype dans une lignée mutante du poisson zèbre, nous proposons une clarification des différents niveaux de variabilité biologique reposant sur une analogie formelle avec le cadre mathématique de la mécanique quantique. Nous trouvons notamment une analogie formelle entre l'intrication quantique et le schéma Mendélien de transmission héréditaire. Dans la troisième partie, nous étudions l'organisation biologique et ses relations aux trajectoires développementales. En adaptant les outils de la topologie algébrique, nous caractérisons des invariants du réseaux de contacts cellulaires extrait d'images de microscopie confocale d'épithéliums de différentes espèces et de différents fonds génétiques. En particulier, nous montrons l'influence des histoires individuelles sur la distribution spatiales des cellules dans un tissu épithélial. / We propose in this thesis to characterize variability quantitatively at various scales during embryogenesis. We use a combination of mathematical models and experimental results. In the first part, we use a small cohort of digital sea urchin embryos to construct a prototypical representation of the cell lineage, which relates individual cell features with embryo-level dynamics. This multi-level data-driven probabilistic model relies on symmetries of the embryo and known cell types, which provide a generic coarse-grained level of observation for distributions of individual cell features. The prototype is defined as the centroid of the cohort in the corresponding statistical manifold. Among several results, we show that intra-individual variability is involved in the reproducibility of the developmental process. In the second part, we consider the mechanisms sources of variability during development and their relations to evolution. Building on experimental results showing variable phenotypic expression and incomplete penetrance in a zebrafish mutant line, we propose a clarification of the various levels of biological variability using a formal analogy with quantum mechanics mathematical framework. Surprisingly, we find a formal analogy between quantum entanglement and Mendel’s idealized scheme of inheritance. In the third part, we study biological organization and its relations to developmental paths. By adapting the tools of algebraic topology, we compute invariants of the network of cellular contacts extracted from confocal microscopy images of epithelia from different species and genetic backgrounds. In particular, we show the influence of individual histories on the spatial distribution of cells in epithelial tissues.
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Exploring the structural and functional dynamics of the X-inactivation centre locus during development / Exploration de la dynamique fonctionnelle de l’architecture du locus Xic lors du développement / Investigação da dinâmica funcional e estrutural do locus Xic durante o desenvolvimento embrionário de ratinhoGalupa, Rafael 19 September 2017 (has links)
La régulation de l’expression génique chez les mammifères dépend de l’organisation tridimensionnelle des chromosomes, en particulier à l’échelle des communications entre les séquences régulatrices et leurs promoteurs cibles. Ainsi, les chromosomes sont organisés en une nouvelle architecture consistant en domaines d’interactions topologiques (TADs, acronyme anglais). Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans cette architecture et leurs importances au cours du développement embryonnaire, pour un locus bien particulier, le Xic (acronyme anglais pour X-inactivation centre). Le Xic contient les éléments régulateurs nécessaires pour initier l’inactivation du chromosome X (ICX), un phénomène épigénétique spécifique du développement des mammifères femelles, rendant l’un des deux chromosomes X inactif du point de vue transcriptionnelle. L’ICX permet d’égaliser l’expression des gènes liés au X entre les sexes chez les mammifères. Le Xic est organisé au moins en deux TADs mais une partie du locus reste encore non identifiée. Je présente ici une analyse fonctionnelle approfondie des différents éléments régulateurs au sein du Xic, comprenant des enhancers, des gènes d’ARNs non codants et des éléments structurels. Après avoir créé une série d’allèles mutés chez la souris et les cellules souches embryonnaires murines, j’ai caractérisé l’impact de ces réarrangements génomiques sur le paysage structurel et transcriptionnel du Xic. J’ai identifié des nouveaux acteurs dans la régulation de ce locus, en particulier des séquences régulatrices conservées chez les mammifères placentaires et des éléments structurels importants pour la formation d’une frontière entre les deux TADs du Xic, importante pour leur séparation et régulation. Je décris aussi la découverte de communication entre ces TADs, ce qui constitue un mécanisme inédit de régulation génique pendant le développement. Ce travail contribue à un nouveau niveau de compréhension des lois qui régissent l’organisation des TADs dans le contexte de la régulation génique chez les mammifères. / Mammalian gene regulatory landscapes rely on the folding of chromosomes in the recently discovered topologically associating domains (TADs), which ensure appropriate communication between cis-regulatory elements and their target promoters. The aim of my PhD project was to characterise the molecular mechanisms that govern this novel architecture and its functional importance in the context of a critical and developmentally regulated locus, the X-inactivation centre (Xic). The Xic contains the necessary elements to trigger X-chromosome inactivation, an epigenetic phenomenon that occurs during the development of female mammals to transcriptionally silence one of the X-chromosomes and equalise X-linked gene expression between sexes. The Xic is partitioned into at least two TADs, but its full extent is unknown. Here, I present a comprehensive functional analysis of different cis-regulatory elements within the Xic, including enhancer-like regions, long noncoding RNA loci and structural elements. Upon generating a series of mutant alleles in mice and murine embryonic stem cells, I characterised the impact of these genomic rearrangements in the structural and transcriptional landscape of the Xic and identified novel players in the regulation of this locus, including cis-acting elements conserved across placental mammals and structural elements critical for the insulation between the Xic TADs. I also found evidence for communication across TADs at this locus, which provides new insights into how regulatory landscapes can work during development. This study also extends our understanding of the rules governing the organisation of TADs and their chromatin loops in the context of mammalian gene regulation. / Nos mamíferos, a regulação da expressão genética depende da organização tridimensional dos cromosomas, em particular ao nível da comunicação regulatória entre promotores e enhancers. A esta escala, descobriu-se recentemente que os cromossomas estão organizados em domínios de interações topológicas (conhecidos como TADs, no acrónimo inglês) que se pensa providenciarem uma base estrutural para as paisagens de regulação transcricional dos genes. O meu projecto de tese teve como objectivo caracterizar os mecanismos moleculares responsáveis por esta arquitectura e a sua importância funcional no contexto de um locus crítico para o desenvolvimento embrionário, o centro de inactivação do cromossoma X (Xic, acrónimo inglês). O Xic contém os elementos genéticos necessários e suficientes para iniciar a inactivação do cromossoma X, um fenómeno epigenético que ocorre durante o desenvolvimento das fêmeas de mamíferos para silenciar um dos cromosomas X e igualar a expressão dos genes do X entre indivíduos XX e XY. O Xic está organizado em pelo menos dois TADs, mas o seu intervalo genético completo permanece desconhecido. Apresento nesta tese uma análise funcional e detalhada de diferentes sequências reguladoras presentes no Xic, incluindo regiões do tipo enhancer, genes de ARNs não codificantes e elementos estruturais. Após a criação de diversos alelos mutantes (deleções, inserções, inversões) em ratinho e em células estaminais embrionárias, através das recentes técnicas de engenharia genética, TALENs e CRISPR/Cas9, caracterizei o impacto destes rearranjos genéticos na paisagem topológica e transcricional do Xic, o que permitiu a identificação de novos actores moleculares na regulação deste locus. Em particular, descobrimos sequências de regulação transcricional altamente conservadas em mamíferos placentários e elementos estruturais importantes para a formação da fronteira entre os dois TADs do Xic. Descrevo também evidência de que há comunicação entre os dois TADs neste locus, o que compromete os modelos actuais do modus operandis dos TADs, e por isso contribui para um novo nível de compreensão dos mecanismos que regulam a expressão genética durante o desenvolvimento.
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