L’ATP est bien connue pour son rôle de transporteur d'énergie à l’intérieur des cellules, mais en dehors de la cellule, elle agit en tant que molécule de signalisation extracellulaire. En se liant aux récepteurs purinergiques, l’ATP extracellulaire amorce la signalisation purinergique afin de réguler certains processus physiologiques et pathophysiologiques. Dans les poumons, l’ATP stimule la sécrétion de surfactant et promeut la clairance mucociliaire. Compte tenu du rôle critique de l’ATP extracellulaire dans les poumons, il est important de comprendre le mécanisme du relargage d’ATP cellulaire — la première étape de la signalisation purinergique. Parce que les forces mécaniques constituent le déclencheur principal du relargage d’ATP, cette thèse a pour but d’investiguer le(s) mécanisme(s) physiologique(s) et les sources cellulaires d’un tel relargage d’ATP mécanosensible. Cet ouvrage est divisé en trois parties : 1) Pour étudier les caractéristiques spatiales et temporelles du relargage d’ATP, j’ai développé une technique d’imagerie hautement sensible basée sur la bioluminescence de la luciférine-luciférase couplée avec un système de lentilles à grand champ de vision (WFOV, wide field of view) optimisant l’apport de lumière. Pour évaluer notre approche d’imagerie, j’ai soumis des cellules A549, dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire humain, à un étirement ou un choc hypotonique de 50% pour déclencher un relargage d’ATP. J’ai démontré que notre technique nous permet de quantifier précisément la quantité et le taux (ou l’efflux) d’ATP s’échappant des cellules. Le WFOV constitue un outil essentiel utilisé dans les études décrites dans cette thèse pour déterminer le mécanisme et la source cellulaire du relargage d’ATP dans l’alvéole. 2) Afin d’examiner le mécanisme physiologique du relargage d’ATP induit par l’étirement dans les cellulaires alvéolaires primaires, j’ai déterminé les contributions individuelles des cellules alvéolaires de type 1 (AT1) en comparaison des cellules alvéolaires de type 2 (AT2). Pour ce faire, des cellules AT2 fraîchement isolées de poumons de rats ont été ensemencées sur une chambre flexible en silicone et cultivées jusqu’à sept jours, ce qui permettait aux cellules AT2 de se transdifférencier progressivement en cellules semblables aux cellules AT1. Le ratio des cellules alvéolaires (AT2:AT1), étant de 4:1 au jour 3, est devenu 1:4 au jour 7. La quantité d'ATP libérée diminuait avec le nombre décroissant de cellules AT2, les impliquant en tant que principale source pour le relargage d’ATP en réponse à un étirement. Alors que les modulateurs pharmacologiques des canaux d’ATP, carbenoxolone et probénécide, ne diminuaient pas la quantité d’ATP libérée, le BAPTA, un chélateur de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), l’a significativement réduite. De même, ces trois modulateurs exercent des effets similaires sur les réponses calciques intracellulaires mesurées par le Fura-2, suggérant une connexion entre le relargage d’ATP et les niveaux de [Ca2+]i. 3) Pour explorer le rôle qu’ont les propriétés viscoélastiques de la membrane dans le relargage d’ATP mécanosensible, j’ai démontré qu’une déformation de 30% induisait un relargage d’ATP transitoire qui était accompagné d’une absorption d’iodure de propidium (PI, propidium iodide) chez des cellules AT2. Ceci est cohérent avec une rupture membranaire transitoire induite par une déformation, assez large pour le passage d’ATP et de PI. L’efflux d’ATP augmente aussi selon le taux de déformation, et la durée de déformation prolonge la demi-vie du relargage d’ATP. Donc, ces résultats fournissent des indices sur la manière dont l’étirement de la membrane viscoélastique peut mener au relargage d’ATP par un mécanisme alternatif impliquant une mécanoporation de la membrane cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le relargage d’ATP ne se produit pas à travers les canaux conduisant l’ATP mais plutôt par une mécanoporation transitoire de la membrane. D’autres études sur les dommages membranaires sont nécessaires pour mieux comprendre sa contribution dans le relargage d’ATP mécanosensible et les signaux de [Ca2+]i. De telles études élucideront la signalisation purinergique dans les organes qui sont constamment exposés à des contraintes physiques. Ceci pourrait suggérer des cibles/approches thérapeutiques pour moduler les impacts négatifs d’un relargage d’ATP excessif observés lors de certaines conditions pathologiques, telles que les lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique. / ATP is widely known to be an energy carrier within cells, but outside of the cell, it acts as an extracellular signaling molecule. Upon binding to purinergic receptors, extracellular ATP initiates the purinergic signaling to regulate certain physiological and pathophysiological processes. In the lungs, ATP stimulates surfactant secretion and promotes mucociliary clearance. Given the critical role of extracellular ATP in the lungs, it is important to understand the mechanism of cellular ATP release — the first step of purinergic signaling. Because mechanical forces constitute the primary trigger of ATP release, this thesis aims to investigate the physiological mechanism(s) and cellular sources of such mechanosensitive ATP release. This work is divided into three parts: 1) To study the spatial and temporal characteristics of ATP release, I developed a highly sensitive imaging technique based on luciferin-luciferase bioluminescence coupled with a custom-designed lens system, which combined a wide field of view (WFOV) and high light-gathering power. To evaluate our imaging approach, I subjected A549 cells, derived from human lung adenocarcinoma, to stretch or 50% hypotonic shock to trigger ATP release. I demonstrated that our technique allows us to precisely quantify the amount and the rate (or efflux) of ATP escaping from cells. The WFOV constitutes an essential tool used in the studies described in this thesis to determine the mechanism and cellular source of ATP release in the alveolus. 2) To examine the physiological mechanism of stretch-induced ATP release in primary alveolar cells, I determined the individual contributions of alveolar type 1 (AT1) in comparison with alveolar type 2 (AT2) cells. To this end, freshly isolated AT2 cells from rat lungs were seeded on a flexible silicone chamber and were cultured for up to seven days, which allowed AT2 cells to progressively transdifferentiate into AT1-like cells. The ratio of alveolar cells (AT2:AT1), being 4:1 on day 3, became 1:4 on day 7. The quantity of released ATP decreased with the decreasing numbers of AT2 cells, implicating them as the main source of ATP release in response to stretch. While pharmacological ATP channel modulators, carbenoxolone and probenecid, did not diminish the amount of ATP release, BAPTA, an intracellular calcium ([Ca2+]i) chelator, significantly reduced it. Likewise, these three modulators had similar effects on intracellular calcium responses measured by Fura-2, suggesting a connection between ATP release and [Ca2+]i levels. 3) To explore the role of membrane viscoelastic properties in mechanosensitive ATP release, I demonstrated that a 30% strain induced transient ATP release that was accompanied by uptake of propidium iodide (PI) in AT2 cells. This is consistent with a strain-induced transient membrane rupture, big enough for the passage of ATP and PI. ATP efflux also increases with strain rate, and hold time prolongs the half-life of ATP release. Thus, these results provide clues on how stretching of the viscoelastic membrane may lead to ATP release via an alternate mechanism involving transient mechanoporation of the cell membrane. Overall, these findings demonstrate that stretch-induced ATP release does not occur through ATP-conducting channels but rather a transient membrane mechanoporation. Further studies on membrane injury induced by strain are needed to better understand its contribution to mechanosensitive ATP release and [Ca2+]i signaling. Such studies will elucidate purinergic signaling in organs that are constantly exposed to physical stresses. This could suggest novel therapeutic targets/approach to modulate the negative impacts of excessive ATP release observed under certain pathological conditions, such as ventilator-induced lung injury.

G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les bioréacteurs de grandes dimensions, en raison de phénomènes de transfert limitant, sont le siège d’hétérogénéités se traduisant par des gradients locaux de concentration et température. Les microorganismes circulant au sein de ces bioréacteurs subissent donc des fluctuations environnementales qui peuvent affecter leur comportement aux niveaux métaboliques et/ou moléculaires. La réponse microbienne est fonction de la nature, de l’intensité, de la fréquence et de la durée de la perturbation. L’objectif de ce travail est l’étude quantitative de l’impact de l’intensité, la fréquence et l’amplitude d’un stress nutritionnel sur le comportement dynamique d’Escherichia coli, à savoir des ajouts pulsés de glucose lors de cultures continues en régime permanent. Un effort particulier est consacré au développement et à la validation des outils expérimentaux indispensables pour une caractérisation rigoureuse des dynamiques de réponses transitoires sur des échelles de temps allant de secondes à quelques minutes. Pour permettre le suivi in situ et en temps réel des changements métaboliques et moléculaires, une souche bioluminescente est mise en œuvre. Les réponses transitoires sont caractérisées par les vitesses spécifiques, les rendements, les profils d’induction transcriptionnelle, les temps caractéristiques. Selon les différents scenarii réalisés, l’ajustement du métabolisme face aux hétérogénéités de substrat est quantifié selon des échelles de temps aux niveaux macroscopiques et/ou moléculaires ; ces résultats originaux contribuent ainsi à l’implémentation des connaissances sur les interactions dynamiques entre les phénomènes biologiques et les phénomènes physiques ; l’enjeu réside à terme en l’amélioration des processus d’optimisation et d’extrapolation des bioprocédés par l’identification et la quantification des dynamiques des phénomènes limitants / Ineffective mixing entailing heterogeneity issues within industrial bioreactors have been reported to affect microbial metabolisms at cellular and/or molecular levels. Substrate gradients inside large-scale bioreactors are common environmental fluctuations that microorganisms would have to encouter along with the bioprocess. Depending on intensity, frequency and duration of those fluctuations, microorganisms may respond in a different manner. The objective of this work is to study the impact of intensity, frequency and amplitude of glucose perturbations on the dynamics of Escherichia coli responses. An E. coli bioluminescent strain is used for in situ and real-time monitoring of both metabolic and transcriptional changes. For this purpose, short-term glucose excess was simulated, using pulse-based experiments into glucose-limited chemostat cultures. In addition, an important effort is devoted to the development and validation of technical and mathematical tools in order to acquire quantitative and kinetic data on time scales from seconds to minutes. The transient responses are characterized, using specific rates, yields, transcriptional induction profiles and characteristic response times, and are compared in the different defined perturbation scenarios. The results reflected the fact that short-term heterogeneities of substrate affect both cell metabolism and regulation at macroscopic and/or molecular levels. Quantitative understandings of the dynamics during transient responses to environmental perturbations can thus shed light on the bioprocess optimization

Ces dernières années, grâce aux progrès réalisés dans l'humanisation des anticorps monoclonaux recombinants (Acm-r), ceux-ci ont vu leur utilisation thérapeutique s'accroître, notamment dans le traitement du cancer. Parmi ces Acm-r, le rituximab (MabThera®, Rituxan®) est le premier à avoir obtenu une autorisation de mise sur le marché en Europe et aux Etats-Unis. Il s'agit d'un anticorps chimérique de type IgG1 kappa dirigé contre l'antigène de surface CD20 exprimé par plus de 95% des cellules lymphoïdes B. Le rituximab utilisé seul ou en association avec de la chimiothérapie a montré son efficacité dans le traitement des lymphomes de faible et de haute malignité. Néanmoins, lorsqu'il est utilisé en monothérapie, 30 à 50% des patients ne répondent pas au traitement. Plusieurs hypothèses ont été évoquées pour expliquer cette variabilité de réponse, parmi lesquelles l'importance de la masse tumorale, un faible niveau d'expression du CD20, la présence de formes solubles de CD20 ou encore de faibles concentrations sériques de rituximab. Ainsi, l'exposition au médicament et la masse tumorale pourraient être des facteurs de variabilité thérapeutique à prendre en compte pour optimiser individuellement le traitement des patients atteints de lymphome malin non hodgkinien.<br /><br />L'objectif général de ce travail de thèse a été d'analyser les rôles respectifs du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d'imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie.<br /><br />Dans une première partie de mise au point du modèle, nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (EL4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain que nous avons transfectée avec le gène de la luciférase (EL4-huCD20-Luc). Nous avons ensuite défini les conditions expérimentales (nombre de cellules, voie d'administration, dose de luciférine de potassium, fond génétique, périodicité des examens) permettant de reproduire chez la souris le développement d'un lymphome agressif et disséminé à larges cellules B létal dans un délai de 30 à 40 jours après inoculation. Nous avons mis au point une méthode de quantification de l'intensité de bioluminescence des foyers tumoraux en prenant en compte le coefficient d'absorption de la lumière propre à la localisation anatomique de chaque tumeur lymphomateuse. <br /><br />Dans une seconde partie nous avons étudié l'effet thérapeutique du rituximab sur ce lymphome. Une seule injection de rituximab à dose progressivement croissante (de 150 µg à 1000 µg) a été réalisée 13 jours après l'inoculation des cellules lymphomateuses (temps nécessaire au développement d'un lymphome quantifiable par imagerie de bioluminescence). La concentration de rituximab circulant a été évaluée par une méthode ELISA adaptée à l'analyse de faibles volumes de plasma et à un modèle murin. Dans ce modèle, nous avons montré qu'il existait une relation entre la dose administrée et la survie des souris, la totalité des souris étant survivantes à la dose de 1000 µg. C'est à 500 µg que nous avons retrouvé la plus grande variabilité de réponse au rituximab avec environ 23% de souris totalement guéries, 59% en réponse partielle et 18% avec une maladie en progression. Pour l'ensemble des souris recevant cette dose, nous avons déterminé précisément le volume tumoral au moment de l'injection du rituximab et évalué les concentrations de rituximab au décours du traitement. Nous avons ainsi montré qu'il existait une relation significative entre le volume tumoral au moment de l'injection et la réponse au rituximab ; les souris présentant les plus faibles volumes tumoraux ayant une meilleure réponse et une survie prolongée. L'analyse de l'évolution des concentrations de rituximab au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d'exposition à l'anticorps semblable à l'observation faite chez l'homme. Nous avons modélisé les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d'un modèle concentration/effet (PK-PD) nous ayant permis de démontrer l'existence d'une relation entre l'efficacité du rituximab et le volume tumoral avant traitement.<br /><br />Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire EL4-huCD20-Luc afin d'évaluer in vitro l'usage de particules d'oxydes de gadolinium ou de particules d'oxydes de gadolinium et de bore. Nous avons montré les qualités d'agents de contraste de ces particules pour l'imagerie à résonance magnétique. Nous avons aussi analysé l'important effet rayonnant de ces particules lors d'une irradiation sous un faisceau de neutrons après une étape d'internalisation des particules au sein des cellules.

Thesis (Ph.D.); Submitted to Iowa State Univ., Ames, IA (US); 12 Dec 2003. / Published through the Information Bridge: DOE Scientific and Technical Information. "IS-T 2604" Jason Alan Gruenhagen. 12/12/2003. Report is also available in paper and microfiche from NTIS.

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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism.