Abstract Biopharmaceuticals are growing in medical and economical significance, replacing several chemically synthesized pharmaceuticals and providing new treatments for serious diseases. Research within the biopharmaceutical field is expensive and labor intensive with the majority of work featuring diverse bioprocesses. Miniaturization of bioprocesses into microbioreactors, miniaturized bioprocess vessels for diverse experiments, reduces the amount of necessary reagents as well as time and labor due to the possibility of multiplexing. A crucial step of research is analytics, commonly performed by expensive and time consuming standard laboratory based analytical tools that require larger sample volumes that than microbioreactors can provide. Biosensors are analytical devices that can provide highly sensitive and selective online detection (in situ) and lend themselves to miniaturization. Biosensors detecting glucose, lactate, pyruvate and galactose were developed and investigated herein. 3D printing and laser ablation were used as fabrication techniques, enabling development of unit operations (mixing and pumping) necessary for biosensor integration into microbioreactors. A 3D printed microbioreactor was developed with integrated glucose and optical density sensors for the cultivation of yeast where the biosensor was found to provide critical online data of glucose concentration, thus enabling bioprocess control. Additionally, molecularly imprinted polymers were investigated as novel recognition components due to their increased stability compared to biological molecules within bioprocess environments. A molecular imprinted polymer for folic acid was developed and tested as a sorbent in a microfluidic solid phase extraction system for detection. / Tiivistelmä Biofarmaseuttisten valmisteiden lääketieteellinen ja taloudellinen merkitys kasvavat. Valmisteet korvaavat kemiallisesti valmistettuja yhdisteitä ja tarjoavat uusia hoitoja vakaviin sairauksiin. Biofarmaseuttinen tutkimus on kallista, ja erityisesti bioprosessien kehittäminen vaatii paljon työtä. Bioprosessien miniatyrisointi mikrobioreaktoreita käyttäen vähentää tutkimuksessa tarvittavaa reagenssien kulutusta, lyhentää aikaa ja pienentää työmäärää, koska mikrobioreaktoreiden avulla voidaan tehdä useita rinnakkaisia kokeita samanaikaisesti. Keskeinen osa bioprosessien tutkimusta on niiden seuraamiseen tarvittava analytiikka. Yleensä seuranta tehdään kalliilla ja aikaa vievillä analyyttisen kemian menetelmillä, jotka vaativat suurempia näytetilavuuksia kuin mitä mikrobioreaktoreista saadaan. Biosensorit ovat erittäin herkkiä ja mittauskohteen tarkasti tunnistavia analytiikkavälineitä, joilla voidaan saada online-mittaustietoa suoraan mittauskohteessa. Ne pystytään myös miniatyrisoimaan. Tässä tutkimuksessa kehitettiin aluksi glukoosin, laktaatin, pyruvaatin ja galaktoosin biosensorimittaukset. Sensorilaitteiden valmistustekniikkoina käytettiin 3D-tulostusta ja laserleikkausta. Näin pystyttiin kehittämään yksiköt myös näytteen sekoittamiseen ja pumppaamiseen. Lopuksi hiivasolujen kasvatusta varten valmistettiin 3D-tulostettu mikrobioreaktori, johon yhdistettiin glukoosisensori ja optisen tiheyden mittaus. Glukoosin mittaus tuotti glukoosin pitoisuudesta onlinetietoa, mikä on erittäin tärkeää prosessin valvonnalle ja ohjaukselle. Lisäksi tutkittiin molekyylipainettujen polymeerien käyttöä mitattavia analyyttejä tunnistavina yhdisteinä. Perinteisiä sensoreissa käytettäviä biomolekyylejä kestävämpinä yhdisteinä ne voisivat soveltua etenkin bioprosessien jatkuvaan seuraamiseen. Tutkimuksessa kehitettiin myös foolihapon tunnistava molekyylipainettu polymeeri, jota käytettiin kiinteän faasin sitoja-aineena mikrofluidisessa detektio- ja uuttojärjestelmässä.

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Thesis (MScEng)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: Recombinant glycoproteins are important biopharmaceuticals, providing solutions for numerous previously untreatable illnesses, in everything from cancer to infertility. Most recombinant biopharmaceuticals are produced in mammalian cells due to their ability to provide the correct post-translational processing for use in humans. The post-translation processing influences many of the protein’s properties including pharmacokinetics, bioactivity, secretion, half-life, solubility, recognition and antigenicity. The aim of this thesis is to further study the upstream production of a glycosylated recombinant protein produced by Chinese hamster ovary (CHO) cells on production scale within the confines of an existing process. The process in question uses adherent CHO cells to produce a glycosylated recombinant hormone. As with most recombinant protein production processes, this process has two sections to the upstream production: a seed train to grow enough cells to inoculate production, and a production section, which focuses on the production of a recombinant protein. The seed train is predominantly conducted in roller bottles, while the production section takes place in perfusion bioreactors, where the cells are attached to microcarriers, with spin-filters for cell retention. The whole process uses medium with serum. There are two process challenges regarding an existing recombinant-protein production process: 1. The gradual increase, over the past several campaigns, of the final population doubling level of the cells (which must remain within certain specified limits) at the end of the seed train. 2. The low glycosylation levels of the product seen in certain campaigns, which meant that a certain number of final product batches were below the specified acceptable glycosylation limits. Following a literature survey several controlled process variables were chosen for investigation and hypotheses made on their effect on the seed train or glycosylation. To investigate their effect on the PDL and cell growth in the seed train: - Medium volume: decreasing the medium volume will yield a lower PDL due to slower cell growth caused by lower glucose availability. - Seeding density: if cells obtain confluence by the time they are harvested, decreasing the seeding density will yield a higher PDL. - Cultivation temperature: decreasing the temperature ought to decrease the growth rate. - Medium feed temperature: there will be no significant difference to the cell culture when pre-heated or cold medium is used. Aeration: using vent caps will increase the oxygen content of the medium in the roller bottles and the cell growth, yielding a higher PDL. To investigate their effect on glycosylation during production: - pH: better glycosylation will be seen at pH 6.9, than at pH 6.7. - Perfusion rate: a higher perfusion rate will lead to better glycosylation due to increased glucose and glutamine concentrations. In the seed train, the only factor that significantly influenced the final PDL was the seeding density. Cell growth was inhibited once cells reached confluence, so lowering the seeding density lead to a higher PDL. It is recommended to use a high seeding density to ensure a lower PDL. Historic data indicated that the seeding density was not the cause of the apparent increase of the final PDL, as all previous campaigns had been seeded with a high seeding density. What then became apparent was that the final PDL remained relatively constant during a campaign and that the increase in final PDL occurred between campaigns. It appears that the apparent increase in the final PDL is due to differences in cell counting between operators as each new campaign was managed by different operators. It is recommended that a mechanical cell counter be used to verify cells counts and to maintain a standard between campaigns. In the bioreactors, varying the pH proved to have no significant effect on the glycosylation levels. However, both the initial perfusion rate and the specific perfusion rate proved to be important from both historical data and the data generated during these experiments. Lower levels of the initial perfusion rate lead to better glycosylation and it is recommended that an initial perfusion rate of 1.0 volumes/day be used. The relationship between the specific perfusion rate and the glycosylation appears to be non-linear and requires further study, for now it is recommended that the specific perfusion rate be kept below 0.3 volumes/day/109 cells. Probable reasons for the unsatisfactory glycosylation seen in certain runs could also be proposed from these two factors: • RP33-133 : Very high specific perfusion rate • RP32-135 : High initial perfusion rate and very high specific perfusion rate • RP32-138 : High initial perfusion rate • RP33-139 : High initial perfusion rate Further research is recommended into the effect of the specific perfusion rate as well as the specific glucose consumption rate and the specific glutamine concentration on the glycosylation. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Rekombinante glikoproteïene is baie belangrike biofarmaseutiese produkte wat oplossings bied vir talle voorheen ongeneeslike siektes in alles van kanker tot onvrugbaarheid. Meeste rekombinante farmaseutiese produkte word gemaak deur diere-selle as gevolg van hulle bevoegtheid om die korrekte na-translasie stappe te volg sodat die produkte in mense gebruik kan word. Die na-translasie stappe beïnvloed baie van die proteïene se karaktertreke insluitende die farmakokinetika, bioaktiwiteit, uitskeiding, half-leeftyd, oplosbaarheid, herkenbaarheid and antigeniciteit. Die doel van hierdie tesis is om die stroomop produksie van ‘n rekombinante glikoproteïene vervaardig deur Chinese hamster ovariale (CHO) selle verder te bestudeer binne die grense van ‘n bestaande proses op grootskaalse vlak. Die huidige proses gebruik CHO selle om ‘n rekombinante glikohormoon te produseer. Soos meeste prosesse wat rekombinante proteïene produseer bestaan die stroomop gedeelte van die proses uit twee dele: ‘n saad trein wat genoeg selle maak vir produksie en ‘n produksie gedeelte wat fokus op die vervaardiging van die glikoproteïen. Die saad trein bestaan hoofsaaklik uit roller bottels terwyl produksie plaasvind in perfusie bioreaktors waar die selle op “microcarriers” groei, met spin-filters om die selle binne die bioreaktors te hou; die hele proses gebruik medium met serum. Daar is twee probleme in die stroomop gedeelte van die bestaande proses: 1. Die geleidelike toename oor die afgelope paar jaar van die finale verdubbelingsvlak van die selle aan die einde van die saad trein 2. Die lae glukosilering van die eindproduk wat veroorsaak dat sekere lotnommers buite spesifikasie is Na ‘n literatuur studie, was seker beheerde proses parameters gekies om verder te bestudeer en hipotesisse gemaak oor hulle effek op die saad trein of die vlak van glukosilering. Die volgende faktore is bestudeer vir hulle effek op die finale verdubbelingsvlak van die selle in die saad trein: - Medium volume: ‘n laer medium volume sal lei tot a laer verdubbelingsvlak van die selle as gevolg van stadige groei - Konsentrasie van selle vir inokulasie: as die selle konfluent is teen die tyd wat hulle versamel word sal ‘n laer konsentrasie selle lei tot ’n hoër verdubellingsvlak. - Temperatuur: laer temperatuur behoort te lei tot ‘n stadiger groei koers van die selle - Medium voer-temperatuur: die voer-temperatuur van die medium sal geen beduidende verskil maak - Belugting: die gebruik van “vent-caps” sal die suurstof inhoud van die roller bottels verhoog Die volgende faktore is bestudeer vir hulle effek op die glukosilering tydens produksie: - pH: beter glukosilering word verwag by by pH 6.9 dan by pH 6.7 - Perfusie koers: ‘n hoër perfusie koers sal lei tot beter glukosilering as gevolg van hoër glukose en glutamien konsentrasies Die konsentrasie van die selle wat gebruik word vir inokulasie blyk die enigste faktor te wees wat die finale verdubbelingsvlak van die selle en die groei van die selle in die saad trein beïnvloed het. Die groei van die selle was beprek wanneer die selle konfluent geraak het en dus het ‘n laër sel konsentrasie by inokulasie gelei tot ‘n hoër sel verdubbelingsvlak. Dit word aanbeveel dat ‘n hoë sel konsentrasie by inokulasie gebruik word. Die geleidelike toename van die finale verdubbelingsvlak van die selle in die saad trein is waarskynlik as gevolg van die variasie in sel tellings tussen verskillende operateurs eerder as as gevolg van die beheerde proses parameters. Dit word aanbeveel dat ‘n meganiese sel-teller gebruik word om die verskil in sel tellings tussen operateurs te kontroleer en om ‘n standaard te handhaaf tussen produksie lotte. In die bioreaktors, het die pH geen beduidende invloed gehad op die glukosilering maar uit historiese data en die huidige data van hierdie eksperimente blyk albei die begin perfusie koers en die spesifieke perfusie koers ‘n belangrike invloed te hê op die glukosilering. Laër vlakke van die begin perfusie koers lei tot beter glikosilsie en dit word aanbeveel dat elke produksielot ‘n begin perfusie koers het van 1.0 volume/dag. Die verhouding tussen die glukosilering en die spesifieke perfusie koers blyk om nie-liniêr te wees nie. Nog navorsing hieroor word aanbeveel, maar vir nou word dit aanbeveel dat die spesifieke perfusie koers onder 0.3 volumes/dag/109 selle gehou word. Hierde twee faktore blyk die oorsaak te wees vir die lae glukosilering wat in sekere produksielopies gevind was: • RP33-133 : baie hoë spesifieke perfusie koers • RP32-135 : hoë begin perfusie koers en baie hoe spesifieke perfusie koers • RP32-138 : hoë begin perfusie koers • RP33-139 : hoë begin perfusie koers Dit word aanbeveel dat verdere navorsing gedoen word op die effek van die spesifieke perfusie koers asook die spesifieke koers van glukose verbruik en die spesifieke glutamien konsentrasie op die glukosilering van die produk.

O acetato de ciproterona é um esteróide sexual sintético com atividade antiandrogênica, antigonadotrópica e progestagênica. O objetivo deste estudo foi avaliar a bioequivalência de duas marcas comerciais de comprimidos contendo 100 mg de acetato de ciproterona em voluntários sadios. O ensaio foi do tipo quantitativo direto, com delineamento aleatório, cruzado e aberto, formando-se dois grupos de voluntários, A e B. Entre as fases houve um período de \"wash out\" de 27 dias, correspondente a, no mínimo, 10 vezes o valor de meia-vida de eliminação de acetato de ciproterona. Amostras de sangue foram coletadas em tubo heparinizado até 216 horas após a administração dos produtos. A bioequivalência dos produtos foi avaliada quantificando-se o fármaco em plasma, através de metodologia bioanalítica desenvolvida e previamente validada. As curvas médias de decaimento plasmático obtidas para os produtos teste (Androsteron® 100 mg - Bergamo, lote PI0004) e referência (Androcur® 100 mg Schering, lote 14616A) foram semelhantes, da mesma forma que as médias dos parâmetros farmacocinéticos Cmax (referência: 159,05 ng/mL; teste: 170,40 ng/mL), tmax (referência: 3,59 h; teste: 3,50 h) e ASC0-t (referência: 5563,03 ngxh/mL; teste: 5453,80 ngxh/mL) e ASC0-∞ (referência: 6266,22 ngxh/mL; teste: 6218,31 ngxh/mL). No presente estudo, a análise de variância (ANOVA) realizada para avaliação do efeito de produto, grupo e período em relação aos parâmetros farmacocinéticos avaliados demonstrou ausência destes efeitos em ASC0-t e ASC0-∞ para os valores calculados com todos os picos da curva plasmática. A ANOVA indicou ainda ausência de efeito de produto e período para Cmax, mas presença de efeito grupo para este parâmetro. Entretanto a constatação do efeito grupo não significa que as formulações avaliadas não sejam bioequivalentes, apenas que há uma diferença entre os grupos de indivíduos. Os valores do intervalo de confiança 90% para a razão de Cmax, (91,0 a 117,9%), ASC0-t (88,4 a 107,8%) e ASC0-∞. (90,6 a 107,8%) encontram-se entre 80 a 125 %, intervalo proposto pelo FDA e ANVISA. Desta forma, a avaliação dos resultados obtidos permite concluir que não houve diferença significativa entre as formulações teste e referência, ou seja, as duas formulações possuem biodisponibilidades estatisticamente equivalentes, em termos de velocidade e extensão da absorção. / Cyproterone acetate (6-chloro-1β,2βα-dihydro-17-hydroxy-3\'H-cyclopropa[1,2] pregna - 1,4,6-triene-3,20-dione acetate) (CPA) is a synthetic steroid with antiandrogenic and progestogenic properties. The aim of the present study was to evaluate the bioequivalence of two cyproterone acetate formulations. The bioequivalence of cyproterone acetate 100 mg tablets was determined in healthy volunteers after a single dose in a randomized crossover study, with a 27 days washout period between the doses. Reference (Androcur®) and test (Androsteron®) products were administered to twenty-four volunteers with 200 mL water after overnight fasting. Blood samples were taken up to 216 h post dose, the plasma was separated and the concentrations of cyproterone acetate were measured using a simple and rapid chromatographic method (HPLC). The pharmacokinetic parameters AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax and t(1/2)el were calculated for both formulations from plasma concentration time profiles. The calculated pharmacokinetic parameters were compared statistically to evaluate bioequivalence between the two brands and no significant differences between the two studied formulations were found. The 90% geometric confidence intervals of the mean ratio of In-transformed Cmax, AUC0-t and AUC0-∞ values were between 91,0 and 117,9% (Cmax), 88,4 and 107,8% (AUC0-t) ando 90,6 and 107,8% (AUC0-∞), and thus within the acceptance ranges, satisfying the bioequivalence criteria of the European Committee for Proprietary Medicinal Products and the US Food and Drug Administration Guidelines. In the Iight of the present study it can be concluded that the two evaluated cyproterone acetate formulations are bioequivalent in terms of the rate and extent of absorption.

Anticorpos são moléculas de grande interesse científico e farmacêutico, principalmente, devido a sua alta especificidade contra antígenos determinados. Atualmente, anticorpos monoclonais estão entre os medicamentos (biofármacos) mais vendidos do mundo. São utilizados para o tratamento das mais diversas doenças, como câncer, retinopatias, doenças inflamatórias e do sistema imune, entre outras. Nos últimos 30 anos, as tecnologias para a obtenção de anticorpos monoclonais evoluíram muito, desde a tecnologia do hibridoma, até os processos de humanização de anticorpos murinos. Entre os métodos mais utilizados para a produção de anticorpos humanos, destaca-se a tecnologia do Phage Display. Nesta técnica, os genes que codificam as regiões variáveis de imunoglobulinas são inseridos no genoma de um bacteriófago, resultando na produção de partículas virais híbridas que contém fragmentos de anticorpos em fusão com uma das proteínas do capsídeo viral. Neste trabalho, desenvolvemos novos vetores para a apresentação de fragmentos ScFv em fusão com duas proteínas das proteínas do capsídeo viral, a pIII e pVIII. Os oligonucleotídeos utilizados para amplificar os genes de imunoglobulinas foram redesenhados e para minimizar a perda do repertório durante a produção da biblioteca, avaliamos em bancos de dados enzimas de restrição que não apresentam sítios de restrição nas sequencias gênicas. Esses sítios de restrição foram utilizados para construir as regiões de clonagem do vetor Phagemid. Outra etapa crítica na produção de bibliotecas de anticorpos é a reação do PCR de overlap, que pode restringir a diversidade de anticorpos e resultar na produção de amplicons codificando anticorpos truncados. Por isso, nossos vetores foram desenhados para permitir a clonagem direta das regiões variáveis das imunoglobulinas humanas ou murinas, sem a necessidade do PCR de overlap. Nossa expectativa, é que estes novos reagentes serão mais efetivos para a produção de novas bibliotecas de anticorpos pelo sistema do Phage Display. / Antibodies are molecules of great scientific and pharmaceutical interest, mainly because of their high specificity against certain antigens. Currently, monoclonal antibodies are among the best selling drugs (biopharmaceuticals) in the world. They are used for the treatment of the most diverse disorders, such as cancer, retinopathies, inflammatory and immune system diseases, among others. In the past 30 years, technologies for obtaining monoclonal antibodies has greatly evolved from hybridoma technology to the humanization processes of murine antibodies. Among the methods used for the production of human antibodies, the technology of Phage Display stands out. In this technique, the genes encoding the immunoglobulin variable regions are inserted into the genome of a bacteriophage, resulting in the production of hybrid virus particles which contain fragments of antibodies in fusion with one of the viral capsid proteins. In this work, we developed new vectors for the presentation of ScFv fragments in fusion with two proteins of viral capsid proteins, pIII and pVIII. The oligonucleotides used to amplify the immunoglobulin genes were redesigned and to minimize repertory loss during library production, we evaluated restriction enzymes in databases that lack restriction sites in the gene sequences. These restriction sites were used to construct the cloning regions of the Phagemid vector. Another critical step in the production of antibody libraries is the overlap PCR reaction, which may restrict the diversity of antibodies and result in the production of amplicons encoding truncated antibodies. Therefore, our vectors were designed to allow the direct cloning of human or murine Immunoglobulins variable regions without the need for overlap PCR. Our expectation is that these new reagents will be more effective for the production of new antibody libraries by the Phage Display system.

A biodisponibilidade é definida pelos parâmetros de velocidade e extensão com que o fármaco atinge a circulação sistêmica a partir da forma farmacêutica, sendo uma propriedade não somente do fármaco, mas também da formulação, representando o desempenho in vivo da qualidade do medicamento. O medicamento genérico, para ser intercambiável com sua referência (geralmente o inovador registrado após comprovação de eficácia e segurança), deve ser considerado pelas autoridades regulatórias como seu equivalente terapêutico. A bioequivalência é o estudo comparativo das biodisponibilidades entre medicamentos, empregado para comprovação de equivalência terapêutica, baseada no princípio de que a similaridade dos perfis sanguíneos de concentração-tempo proporciona similares resultados quanto à eficácia e segurança. O presente trabalho compreendeu uma abordagem sobre os estudos de biodisponibilidade e bioequivalência com alimentação, com objetivo de sistematização dos fundamentos científicos e critérios normativos nacionais e internacionais, avaliação da necessidade e elaboração de diretrizes para condução destes estudos. Foi pesquisada a literatura científica sobre o tema, com ênfase nas publicações dos últimos dez anos, e também as diretrizes regulatórias nacionais e internacionais vigentes. Foram avaliados os efeitos do alimento na absorção gastrintestinal de fármacos, os fatores envolvidos na interação fármaco-alimento e os mecanismos físico-químicos e fisiológicos envolvidos. O alimento pode influenciar a absorção dos fármacos e promover aumento, retardo ou redução de absorção, devido a diferentes efeitos, por exemplo: prolongamento do tempo de esvaziamento gástrico, interação direta do fármaco com constituintes do alimento, aumento da viscosidade do conteúdo intestinal, alteração do pH, aumento do fluxo sanguíneo esplâncnico e interação com transportadores. A interação fármaco-alimento pode resultar em alterações farmacocinéticas e farmacodinâmicas. O efeito do alimento é mais significativo nas fases de absorção e metabolismo do fármaco, podendo resultar em perda de eficácia ou toxicidade. As interações fármaco-alimento são influenciadas pela natureza do alimento, constituição e quantidade da refeição, tempo entre alimentação e medicação e pela formulação. A refeição altamente gordurosa tem maior potencial de alteração da fisiologia gastrintestinal, principalmente aumentando o tempo de esvaziamento gástrico, o fluxo sanguíneo e a secreção biliar. Esses efeitos podem afetar significativamente a absorção de fármacos, sendo especialmente críticos para as formulações de liberação modificada. O efeito total do alimento na farmacocinética é resultante da interação de múltiplos efeitos relacionados ao fármaco, à formulação, à fisiologia gastrintestinal e à refeição. Devido à variabilidade e difícil previsibilidade dos efeitos do alimento sobre a velocidade e extensão de absorção dos fármacos, devem ser conduzidos estudos de efeito do alimento para novos fármacos e novas formulações. A pesquisa resultou na compilação das diretrizes para avaliação do efeito do alimento na biodisponibilidade, incluindo-se os desenhos dos estudos. É apresentado um esquema para avaliação da necessidade dos estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, com base nas características do fármaco e nos tipos de formulações. As diretrizes para requerimento e condução dos estudos foram sistematizadas em uma proposta de guia para estudos de biodisponibilidade e bioequivalência com alimentação a ser empregado no caso de registro e alterações pós-registro para medicamentos novos, genéricos e similares no Brasil. / Bioavailability is defined by rate and extension parameters with which the drug reaches the systemic circulation from its dosage form, being not only a property of such drug, but also of the formulation, representing the in vivo quality of the medicine. In order to be interchangeable with its reference drug (usually the innovative drug registered after efficacy and safety proof), the generic drug must be considered as its therapeutic equivalent. Bioequivalence is the comparative study between drugs\' bioavailabilities, used for the proving of therapeutic equivalence, based on the principle that the similarity between blood concentration-time profiles generates similar efficacy and safety results. This work is a discussion about the food-effect bioavailability and fed bioequivalence studies, aiming at systematizing the scientific fundaments and national and international regulatory criteria, necessity evaluation and elaboration of de guidelines for studies execution. Research was done on scientific literature on the subject, with emphasis on publications over the last ten years, and also on current regulatory guidelines. The effects of food on the gastrointestinal absorption of the drugs, the factors related to the food-drug interaction and the physical-chemical and physiological mechanisms involved were evaluated. Food may influence the drug absorption and cause drug absorption increase, delay or reduction due to different factors, for example: gastric emptying time increase, direct drug interaction with food constituents, intestinal content viscosity increase, pH alterations, spleen blood flow increase and transporter interaction. The food-drug interaction may cause pharmacokinectic and pharmacodynamics alterations. Food\'s effect is most significant during the absorption and metabolic phases of the drug and may result in efficacy loss or toxicity. The food-drug interaction is influenced by the nature of the food, meal constitution and quantity, feeding and medication interval time and formulation. A high-fat meal has greater gastrointestinal physiology alteration potential, especially increasing the gastric emptying time, the blood flow and bile secretion. These effects may significantly impact the drugs\' absorption being especially critical for the modified-release formulations. Toe total food effect on pharmacokinectic is the result of the interaction of multiple effects related to the drug, the formulation, the gastrointestinal physiology and the meal. Due to its variability and the difficulty to predict the effects of food on the rate and extension of drugs\' absorption effect studies must be carried out for new drugs and new formulations. The research resulted in the compilation of the guidelines for the evaluation of food effects on bioavailability, including the studies\' designs. A scheme is presented for the evaluation of the necessity of bioavailability and bioequivalence studies based on the drug\'s characteristics and the types of formulations. The guidelines for the requirement and conduction of the studies were systematized in a guide proposal for bioavailability and bioequivalence studies of medicines with feeding to be used in the case of registration, and post-registration changes for new, generic and similar drugs in Brazil.

A biodisponibilidade é definida pelos parâmetros de velocidade e extensão com que o fármaco atinge a circulação sistêmica a partir da forma farmacêutica, sendo uma propriedade não somente do fármaco, mas também da formulação, representando o desempenho in vivo da qualidade do medicamento. O medicamento genérico, para ser intercambiável com sua referência (geralmente o inovador registrado após comprovação de eficácia e segurança), deve ser considerado pelas autoridades regulatórias como seu equivalente terapêutico. A bioequivalência é o estudo comparativo das biodisponibilidades entre medicamentos, empregado para comprovação de equivalência terapêutica, baseada no princípio de que a similaridade dos perfis sanguíneos de concentração-tempo proporciona similares resultados quanto à eficácia e segurança. O presente trabalho compreendeu uma abordagem sobre os estudos de biodisponibilidade e bioequivalência com alimentação, com objetivo de sistematização dos fundamentos científicos e critérios normativos nacionais e internacionais, avaliação da necessidade e elaboração de diretrizes para condução destes estudos. Foi pesquisada a literatura científica sobre o tema, com ênfase nas publicações dos últimos dez anos, e também as diretrizes regulatórias nacionais e internacionais vigentes. Foram avaliados os efeitos do alimento na absorção gastrintestinal de fármacos, os fatores envolvidos na interação fármaco-alimento e os mecanismos físico-químicos e fisiológicos envolvidos. O alimento pode influenciar a absorção dos fármacos e promover aumento, retardo ou redução de absorção, devido a diferentes efeitos, por exemplo: prolongamento do tempo de esvaziamento gástrico, interação direta do fármaco com constituintes do alimento, aumento da viscosidade do conteúdo intestinal, alteração do pH, aumento do fluxo sanguíneo esplâncnico e interação com transportadores. A interação fármaco-alimento pode resultar em alterações farmacocinéticas e farmacodinâmicas. O efeito do alimento é mais significativo nas fases de absorção e metabolismo do fármaco, podendo resultar em perda de eficácia ou toxicidade. As interações fármaco-alimento são influenciadas pela natureza do alimento, constituição e quantidade da refeição, tempo entre alimentação e medicação e pela formulação. A refeição altamente gordurosa tem maior potencial de alteração da fisiologia gastrintestinal, principalmente aumentando o tempo de esvaziamento gástrico, o fluxo sanguíneo e a secreção biliar. Esses efeitos podem afetar significativamente a absorção de fármacos, sendo especialmente críticos para as formulações de liberação modificada. O efeito total do alimento na farmacocinética é resultante da interação de múltiplos efeitos relacionados ao fármaco, à formulação, à fisiologia gastrintestinal e à refeição. Devido à variabilidade e difícil previsibilidade dos efeitos do alimento sobre a velocidade e extensão de absorção dos fármacos, devem ser conduzidos estudos de efeito do alimento para novos fármacos e novas formulações. A pesquisa resultou na compilação das diretrizes para avaliação do efeito do alimento na biodisponibilidade, incluindo-se os desenhos dos estudos. É apresentado um esquema para avaliação da necessidade dos estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, com base nas características do fármaco e nos tipos de formulações. As diretrizes para requerimento e condução dos estudos foram sistematizadas em uma proposta de guia para estudos de biodisponibilidade e bioequivalência com alimentação a ser empregado no caso de registro e alterações pós-registro para medicamentos novos, genéricos e similares no Brasil. / Bioavailability is defined by rate and extension parameters with which the drug reaches the systemic circulation from its dosage form, being not only a property of such drug, but also of the formulation, representing the in vivo quality of the medicine. In order to be interchangeable with its reference drug (usually the innovative drug registered after efficacy and safety proof), the generic drug must be considered as its therapeutic equivalent. Bioequivalence is the comparative study between drugs\' bioavailabilities, used for the proving of therapeutic equivalence, based on the principle that the similarity between blood concentration-time profiles generates similar efficacy and safety results. This work is a discussion about the food-effect bioavailability and fed bioequivalence studies, aiming at systematizing the scientific fundaments and national and international regulatory criteria, necessity evaluation and elaboration of de guidelines for studies execution. Research was done on scientific literature on the subject, with emphasis on publications over the last ten years, and also on current regulatory guidelines. The effects of food on the gastrointestinal absorption of the drugs, the factors related to the food-drug interaction and the physical-chemical and physiological mechanisms involved were evaluated. Food may influence the drug absorption and cause drug absorption increase, delay or reduction due to different factors, for example: gastric emptying time increase, direct drug interaction with food constituents, intestinal content viscosity increase, pH alterations, spleen blood flow increase and transporter interaction. The food-drug interaction may cause pharmacokinectic and pharmacodynamics alterations. Food\'s effect is most significant during the absorption and metabolic phases of the drug and may result in efficacy loss or toxicity. The food-drug interaction is influenced by the nature of the food, meal constitution and quantity, feeding and medication interval time and formulation. A high-fat meal has greater gastrointestinal physiology alteration potential, especially increasing the gastric emptying time, the blood flow and bile secretion. These effects may significantly impact the drugs\' absorption being especially critical for the modified-release formulations. Toe total food effect on pharmacokinectic is the result of the interaction of multiple effects related to the drug, the formulation, the gastrointestinal physiology and the meal. Due to its variability and the difficulty to predict the effects of food on the rate and extension of drugs\' absorption effect studies must be carried out for new drugs and new formulations. The research resulted in the compilation of the guidelines for the evaluation of food effects on bioavailability, including the studies\' designs. A scheme is presented for the evaluation of the necessity of bioavailability and bioequivalence studies based on the drug\'s characteristics and the types of formulations. The guidelines for the requirement and conduction of the studies were systematized in a guide proposal for bioavailability and bioequivalence studies of medicines with feeding to be used in the case of registration, and post-registration changes for new, generic and similar drugs in Brazil.

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins. / A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas.

Affibody® molecules are small therapeutic proteins which mimics antibody functionality. This is a report of several methods for increasing productivity and yield in recombinant production of Affibody® molecules. This literature study shows several steps in the production line which can be optimised, several novel methods for cultivating and harvesting cells and purication of proteins. There is also a section about validation of therapeutic protein production according to The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) are presented.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T17:12:41Z No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T17:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana-carreiras-norte.pdf: 1395438 bytes, checksum: 31a432f41d7dee6ad0313c1c37736102 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Nesta avaliação, realizaram-se ensaios cromatográficos de purificação de eritropoetina humana recombinante, a partir do sobrenadante de cultura de células de mamíferos da linhagem CHO (células de ovário de hamster chinês), produtoras deste biofármaco. Compararam-se as membranas comerciais de troca iônica Sartobind (MA) Q e D, com o objetivo de avaliar a sua aplicabilidade a processos de purificação de EPO. Ambas as membranas apresentaram-se capazes de adsorver EPO nas condições avaliadas. EPO foi detectada nas amostrasde eluído de ambas as membranas, tendo-se verificado que o imunoensaio dotipo dot-blotfoi aquele que forneceu as informações mais conclusivas. Já nas análises de eletroforese, verificou-se um perfil difuso das bandas do eluído das membranas, o que foi creditado à heterogeneidade glicídica da EPO, como anteriormente demonstrado na literatura. / In the present work, the purification of recombinant human erythropoietin (rhEPO) from CHO (Chinese hamster ovary) cell culture supernatant was investigated using anion-exchange chromatography. Commercial membrane adsorbers (Sartobind D and Q) were compared, with the aim of evaluating their aplicability to EPO purification processes. Both membranes were able to adsorb EPO under the conditions evaluated in this work. EPO was detected in the eluate of both membranes. The immunoassay dot-blot was the most interesting analytical tool, giving the most conclusive results. Electrophoretic analyses showeda diffuse band, probably due to glycan heterogeneity in the EPO molecules, as previously reported in the literature.