Mechano-chemical processes in biological systems play an important role during the morphogenesis of cells and tissues. In particular, they are responsible for the dynamic organisation of active stress, which itself results from non-equilibrium processes and leads to flows and deformations of material. The generation of active stress often occurs in thin biological structures, such as the cellular cortex or epithelial tissues, which motivates the theoretical concept of an active surface. In this thesis, we study the dynamics of curved and deforming active surfaces. More specifically, we are interested in the dynamics of mechano-chemical processes on these surfaces, as well as in their interaction with the surface shape and external forces. To study the interplay of mechano-chemical processes with shape changes of the material, we consider the fully self-organised shape dynamics using the theory of active fluids on deforming surfaces. We then develop a numerical approach to solve the corresponding force and torque balance equations. We further examine how the stability of surface shapes is affected by mechano-chemical processes. We show that the tight coupling between chemical processes and surface mechanics gives rise to the spontaneous generation of specific surface shapes, to shape oscillations and to directed surface flows that resemble peristaltic motion. In the following part, we explore the mechano-chemical self-organisation of active fluids on fixed surfaces, focussing on mechanical interactions with surrounding material. We introduce a description in which active surface flows set a surrounding passive fluid into motion. We then study two scenarios. First, inspired by the cellular cortex and its interactions with the cytoplasm, we consider a fluid that is enclosed by the surface. We find that mechanical interactions with the surrounding passive fluid enable an isotropic active surface to spontaneously generate patterns with polar asymmetry and to form a contractile ring in a fully self-organised fashion. Second, we consider the case where the passive fluid surrounds the active surface on the outside. This description leads to the model of a microswimmer, which is characterised by an onset of motion due to spontaneous symmetry breaking on the active surface. Most biological materials are viscoelastic, such that they show viscous and elastic responses if mechanical stress is applied on different time scales. In the final part of this thesis, we therefore consider a surface whose response to self-organised active stress is described by a Maxwell model. We identify a minimal time scale for the relaxation of elastic stress, beyond which spatio-temporal, mechano-chemical oscillations on the surface can spontaneously emerge. In summary, we identify and characterise in this thesis various processes that result from the self-organisation of active surfaces. The underlying coupling between surface mechanics and a chemical organisation of stress in the material represents a key feature of morphogenetic processes in biology. Furthermore, we develop several numerical approaches that will enable to study alternative constitutive relations of active surfaces in the future. Overall, we contribute theoretical insights and numerical tools to further the understanding of the emerging spatial organisation and shape generation of active surfaces. / Mechanochemische Prozesse spielen eine wichtige Rolle für die Morphogenese von biologischen Zellen und Geweben. Sie sind insbesondere verantwortlich für die dynamische Organisation von aktiver mechanischer Spannung, welche Nicht-Gleichgewichtsprozessen entstammt und zu Flüssen und Verformungen von Material führt. Aktive mechanische Spannung wird häufig in dünnen biologischen Strukturen erzeugt, wie zum Beispiel dem Zellkortex oder dem Epithelgewebe, was die Einführung von aktiven Flächen als theoretisches Konzept motiviert. In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Dynamik von gekrümmten und sich verformenden aktiven Flächen. Dabei interessieren wir uns insbesondere für die Dynamik mechanochemischer Prozesse auf diesen Flächen, sowie für deren Wechselwirkung mit der Flächenform und externen Kräften. Zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen mechanochemischen Prozessen und Flächenverformungen nutzen wir die hydrodynamische Theorie aktiver Fluide auf sich verformenden Flächen und betrachten eine vollständig selbstorganisierte Flächendynamik. Wir entwickeln eine Methode zur Bestimmung numerischer Lösungen des Kräfte- und Drehmomentgleichgewichts auf Flächen und untersuchen wie die Stabilität von Flächenformen durch mechanochemische Prozesse beeinflusst wird. Wir zeigen, dass die enge Kopplung zwischen chemischen Prozessen und der Mechanik von Flächen zur spontanen Erzeugung spezifischer Formen, zu Formoszillationen und zu gerichteten Flüssen führt, welche eine peristaltische Bewegung nachbilden. Im Folgenden untersuchen wir die mechanochemische Selbstorganisation aktiver Fluide auf festen Flächen und betrachten mechanische Wechselwirkungen mit umgebendem Material. Dazu beschreiben wir ein umgebendes passives Fluid, welches durch aktive Flüsse auf der Fläche in Bewegung versetzt wird. Im Rahmen dieser Beschreibung untersuchen wir zwei Szenarien. Inspiriert durch die Wechselwirkung des Zellkortex mit dem Zytoplasma, betrachten wir zuerst ein Fluid, welches durch die Fläche eingeschlossen wird. Wir zeigen, dass die mechanische Wechselwirkung einer isotropen, aktiven Fläche mit dem umgebenden Fluid es ermöglicht, Muster mit einer polaren Asymmetrie, sowie einen kontraktilen Ring spontan und selbstorganisiert zu bilden. Danach betrachten wir ein passives Fluid, welches die Fläche außen umgibt. Diese Beschreibung führt zu einem Modell für einen Mikroschwimmer, welcher durch eine spontane Symmetriebrechung auf der aktiven Fläche beginnt sich durch das passive Fluid zu bewegen. Die meisten biologischen Materialien verhalten sich viskoelastisch, sodass deren mechanische Antwort je nach Zeitskala einer applizierten mechanischen Spannung viskos und elastisch ausfallen kann. Im abschließenden Teil dieser Arbeit betrachten wir daher eine Fläche, deren mechanische Antwort auf aktive Spannung durch ein Maxwell-Modell beschrieben wird. Wir bestimmen eine minimale Zeitskala für die Relaxation von elastischer Spannung, welche das spontane Einsetzen räumlich-zeitlicher Oszillationen aktiver mechanischer Spannung kennzeichnet. Zusammengefasst identifizieren und charakterisieren wir in dieser Arbeit eine Reihe von Prozessen, welche der Selbstorganisation aktiver Flächen entspringen. Die zugrundeliegende Kopplung zwischen der Mechanik von Flächen und einer chemischen Organisation aktiver mechanischer Spannung stellen ein Schlüsselprinzip morphogenetischer Vorgänge in der Biologie dar. Zusätzlich entwickeln wir eine Reihe numerischer Methoden, welche es in Zukunft erlauben weitere Beschreibungen aktiver Flächen zu untersuchen. Damit trägt diese Arbeit neue theoretische Einsichten und numerische Algorithmen zur Verbesserung des Verständnisses der emergenten räumlichen Organisation und Formerzeugung aktiver Flächen bei.

Die exzitatorische Neurotransmission im gesamten Zentralnervensystem (ZNS) der Wirbeltiere wird weitgehend durch die α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure-Rezeptoren (AMPARs) vermittelt. AMPARs sind Glutamat-gesteuerte Ionenkanäle, die sich an der postsynaptischen Membran befinden, wo sie den Kern makromolekularer Komplexe mit einer Reihe von Hilfsproteinen bilden, die die Rezeptorfunktion konzertiert regulieren. Die bekanntesten dieser Proteine sind die transmembranen AMPA-Rezeptor-Regulierungsproteine (TARPs). TARPs zeigen eine verwirrende Reihe von Effekten auf den Handel, die synaptische Verankerung, die Gate-Kinetik und die Pharmakologie von AMPARs. Über die strukturellen Merkmale des AMPAR-TARP-Komplexes wurde zunehmendes Wissen gesammelt. Die molekularen Mechanismen, die der TARP-Modulation der AMPARs zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Studie wurden die AMPAR-TARP-Interaktionen mit Hilfe der Elektrophysiologie in 293 Zellen der menschlichen embryonalen Niere (HEK) untersucht. Die Rolle der extrazellulären TARP-Schleifen, Loop1 (L1) und Loop2 (L2), bei der Modulation der AMPAR-Ansteuerung wurde analysiert. Es wurde ein Modell für die TARP-Modulation vorgeschlagen, das auf vorhergesagten zustandsabhängigen Wechselwirkungen von TARP L1 und L2 mit dem AMPAR basiert. Da die nativen AMPARs im Gehirn hauptsächlich aus heterotetrameren Zusammensetzungen von vier verschiedenen Untereinheiten (GluA1-4) bestehen, wurden außerdem verschiedene Zusammensetzungen von AMPAR-Untereinheiten getestet. Es wurden sowohl gemeinsame als auch von den Untereinheiten abhängige Mechanismen der AMPAR-Modulation durch TARPs beobachtet. Zusammenfassend liefern diese Experimente den Nachweis, dass TARP L1 und L2 nicht an der Assoziation von AMPAR-TARP-Komplexen beteiligt sind und die Modulation der AMPAR-Ansteuerung durch TARPs vollständig erklären können. / Excitatory neurotransmission throughout the vertebrate central nervous system (CNS) is largely mediated by the α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPARs). AMPARs are glutamate-gated ion channels located at the postsynaptic membrane, where they compose the hub of macromolecular complexes with a number of auxiliary proteins that concertedly regulate the receptor function. Among these proteins the most known ones are the transmembrane AMPA receptor regulatory proteins (TARPs). TARPs show a bewildering array of effects on the trafficking, synaptic anchoring, gating kinetics and pharmacology of AMPARs. Growing knowledge has been gathered about the structural features of the AMPAR-TARP complex. However, the molecular mechanisms underlying TARP modulation of AMPARs have not been fully revealed yet. Given that higher brain functions rely upon AMPAR activity and dysregulation of AMPARs has been associated to life-threatening CNS disorders, big efforts are being made to unravel the molecular machinery behind AMPAR regulation and to identify AMPAR auxiliary proteins as potential pharmacological targets. In the present study, AMPAR-TARP interactions were investigated using electrophysiology in human embryonic kidney (HEK) 293 cells. The role of TARP extracellular loops, Loop1 (L1) and Loop2 (L2), in the modulation of AMPAR gating was analysed. A model for TARP modulation has been proposed, based on predicted state-dependent interactions of TARP L1 and L2 with the AMPAR. Moreover, considering that native AMPARs in the brain mainly consist of heterotetrameric assemblies of four distinct subunits (GluA1-4), different AMPAR subunit compositions were tested. Common as well as subunit-dependent mechanisms of AMPAR modulation by TARPs have been observed. In summary, these experiments provided evidence that TARP L1 and L2 are not involved in association of AMPAR-TARP complexes and can entirely account for the modulation of AMPAR gating by TARPs.

Das Peptid Amyloid-beta wird seit vielen Jahren mit der Alzheimer''schen Demenz in Verbindung gebracht, aber die Verbindung zwischen dem Peptid und der Herkunft der Symptome bleibt unklar. Eine neue Hypothese besagt, dass Wechselwirkungen von Mono- oder Oligomeren des Amyloid-beta mit neuronalen Zellmembranen zu Veränderungen der Membran-Doppelschichtsruktur führen und Störungen dynamischer Prozesse in den Membranen verursachen können. Mit Methoden der Röntgen- und Neutronenstreuung wurden die Struktur und Dynamik von Modellmembranen und Änderungen durch den Einfluss des Peptids Amyloid-beta auf die Modellmembranen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Monomere des Peptidfragments Amyloid-beta 22-40 in anionische Lipidmembranen eingebaut werden. Mittels quasielastischer-inkohärenter Neutronenstreuung wurde die Dynamik von Lipidmembran untersucht. Ein Anteil von 1,5 mol % Amyloid-beta 22-40 in einer Lipidmembran bei 30°C verursacht eine Verringerung der Diffusionskoeffizienten sowohl der Schwerpunktbewegung der Lipide im ns-Bereich als auch der Dynamik der Fettsäurereste im ps-Bereich. Andererseits wird in der Gelphase der Lipidmembran bei 15°C ein Anstieg der Diffusionskoeffizienten beider Prozesse beobachtet. Eine Serie von Lipidproben mit unterschiedlichem Cholesteringehalt und eingelagerten Peptiden Amyloid-beta 1-42 und Amyloid-beta 22-40 wurde Mittels Röntgendiffraktion charakterisiert. Für das Peptid Amyloid-beta 22-40 wurden zwei Positionen gefunden, eine auf der Oberfläche der Membran, eine zweite in der Membran eingelagert. Das Peptid Amyloid-beta 1-42 ist teilweise in die Membran eingelagert und ist in einer 40 mol % Cholesteringehaltige Membrane durch eine einzelne Position modelliert. Zusätzlich wird der Entwurf und die Inbetriebnahme der BerILL Feuchtekammer beschrieben. / The peptide amyloid-beta has long been associated with Alzheimer’s disease; however the link between the peptide and the origin of symptoms is poorly understood. An emerging hypothesis is that monomeric and oligomeric forms of the peptide interact with neuronal membranes, resulting in perturbations in the bilayer structure and in the dynamic processes which take place in the bilayer. Using X-ray and neutron scattering techniques, the structure and dynamics of model lipid membranes and the changes which arise in the presence of amyloid-beta peptide fragments have been studied. Monomers of the peptide fragment amyloid-beta 22-40 were found to intercalate into an anionic lipid bilayer. Through quasi-elastic neutron scattering, dynamics of bilayer lipids were observed. The presence of 1.5 mol % of the peptide results in a decrease in the diffusion coefficients for lipid centre of mass motion on the nanosecond time-scale, as well as for the lipid tail dynamics on the picosecond scale at 30°C. On the other hand, in the gel-phase of the lipid, at 15°C, an increase in the diffusion coefficients for both of these processes was observed. A series of samples with various cholesterol content and either the amyloid-beta 22-40 peptide fragment or the amyloid-beta 1-42 full length peptide was characterized using X-ray diffraction. The amyloid-beta 22-40 peptide was found to populate two positions, on the surface and embedded in the bilayer. The amyloid-beta 1-42 peptide embeds itself into the membrane, and is modelled by a single population for high cholesterol levels (40 mol % cholesterol). In addition, the design and commissioning of the BerILL humidity chamber, a sample environment with precise temperature and humidity control compatible with neutron scattering experiments is presented.

Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) und ihre zugehörigen (Cas) Proteine sind eine Reihe neuer Werkzeuge, die eine beispiellose Kontrolle über genetisches Material ermöglichen. Die meisten CRISPR-Cas-Systeme verwenden ein kurzes RNA-Molekül, das in ihre Struktur eingebunden ist, um sie zu einer spezifischen, komplementären DNA-Sequenz zu führen. Nach Erkennung der Komplementarität wird die DNA dann gespalten. Aufgrund der einfachen Reprogrammierbarkeit der Guide-RNA und ihrer hohen Spezifität für die Ziel-DNA-Sequenz haben diese Systeme ein enormes Potenzial in Bereichen wie Medizin, Landwirtschaft, Biotechnologie und Krankheitsforschung sowie in anderen Bereichen gezeigt und die Aufmerksamkeit von Wissenschaft und Industrie auf sich gezogen. Das gründliche Verständnis dieser Systeme ist entscheidend für ihre sichere Anwendung, insbesondere wenn man die ethischen Implikationen in Betracht zieht. In dieser Arbeit wurden komplexe Einzelmolekülexperimente unter Verwendung mehrerer hochmoderner Methoden eingesetzt, um einige bisher ungelöste Fragen bezüglich der Target-Suche und -spaltung dieser CRISPR-Cas-Systeme zu beantworten. • Direkte Beobachtung und Quantifizierung der Target-Suche durch den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Der Typ I-E CRISPR-Cas-Komplex Cascade ist ein Multiprotein-Komplex ohne inhärente Nukleaseaktivität, der doppelsträngige DNA bindet, indem er zuerst eine kurze Sequenz von zwei Nukleotiden namens Protospacer Adjacent Motif (PAM) erkennt und dann eine sogenannte R-Loop-Struktur mit dem benachbarten komplementären DNA-Strang bildet. Während der Prozess der R-Loop-Bildung vielfach untersucht wurde, bleibt der Mechanismus, wie Cascade bei potenziell sehr langen DNA-Sequenzen überhaupt zur richtigen Stelle gelangt unklar. Um Licht in diesen Prozess zu bringen, wurde ein kombiniertes Magnetpinzetten- und Fluoreszenzmikroskopie-Experiment etabliert, das die gleichzeitige Erfassung von DNA-Bindung und R-Loop-Bildung ermöglicht. Diese Experimente zeigten, dass Cascade für die Target-Suche einen Mechanismus namens Facilitated Diffusion verwendet. Dies bedeutet, dass Cascade nach einem dreidimensional Diffusionsprozess an einer zufälligen Stelle an DNA bindet und dann mit einem eindimensionalen Scannen um die Bindungsstelle beginnt. Wenn kein Target gefunden wird, wird der Prozess wiederholt. Bei einer nichterfolgreichen Suche dauert das eindimensionale Scannen etwa 150 ms und erstreckt sich über mehrere hundert potenzielle Targets. Das Verdrehen der DNA und damit das Anlegen von Supercoiling erleichtert oder behindert die R-Schleifen-Bildung, je nach Dreh-Richtung, und beeinflusst damit indirekt die Dauer der Suche. Die Experimente zeigten weiterhin, dass auch die Effizienz der Target-Suche, d.h. die Wahrscheinlichkeit, das richtige Ziel zu finden, sobald das eindimensionale Scannen begonnen hat, stark vom Supercoiling abhängt. Während Wahrscheinlichkeiten von über 40 % für negatives Supercoiling gefunden wurden, d.h. mit erleichterter R-Loop-Bildung, betrug sie in Abwesenheit von Supercoiling nur 5 %. • Entwicklung eines kinetischen Modells für den Such- und Erkennungsprozess für den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Als nächstes wurde ein kinetisches Modell entwickelt, das die Target-Suche als Random Walk auf DNA beschreibt, während dem sich der Cascade-Komplex von PAM zu PAM bewegt und die benachbarten Stellen auf Komplementarität prüft. Dieses Modell ermöglichte nicht nur Vorhersagen von Suchparametern wie Sucheffizienz und -dauer, sondern ermöglichte auch eine genaue Beschreibung der Erkennungswahrscheinlichkeiten, sobald das richtige PAM gefunden wurde. Es konnte herausgefunden werden, dass die Wahrscheinlichkeit, bei der Begegnung mit dem richtigen Ziel erfolgreich einen R-Loop zu bilden, gering ist, höchstwahrscheinlich um einen zu langen Aufenthalt an nur teilweise komplementären und damit falschen Targets zu verhindern. Das Modell sagt jedoch voraus, dass eine Stelle während eines eindimensionalen Scans bis zu 15 Mal besucht wird, um die geringe Erkennungswahrscheinlichkeit auszugleichen. Es wurde somit gezeigt, dass Target-Suche und -Erkennung in einem ausgefeilten Prozess eng miteinander verbunden sind, der die Zeit an falschen Targets minimiert aber dennoch eine schnelle Erkennung des richtigen Targets ermöglicht. • Untersuchung der Stabilität von CRISPR-Cas9 nach der Spaltung CRISPR-Cas9 ist ein einzelnes Protein, das doppelsträngige DNA in einem durch RNA gesteuerten Prozess ähnlich dem von Cascade anvisiert und bindet. Cas9 hat jedoch eine inhärente Nukleaseaktivität und spaltet die DNA nach der R-Loop-Bildung selbst. Dafür hat es zwei Nuklease-Domänen, die jeweils einen Strang der DNA spalten. Cas9 ist das derzeit am weitesten verbreitete Tool für Anwendungen in der Genomeditierung. Eine Erkenntnis, an dessen Erklärung weiterhin geforscht wird, ist, dass Cas9 auch nach der Spaltung für Stunden an sein DNA-Target gebunden bleibt, was es zu einem de-facto Single-Turnover-Enzym macht. Biologisch gesehen ist dies erstaunlich, da CRISPR-Cas-Systeme in einem engen Wettbewerb gegen ihre viralen Gegner stehen. Aus Anwendungssicht verbirgt und behindert Cas9 durch das lange Binden die zu bearbeitende DNA-Stelle vor den Reparatursystemen der Zellen. Für ein effizientes Gensystem ist es entscheidend, Möglichkeiten zu entwickeln, Cas9 kontrolliert von seinem Ziel zu entfernen. Dafür ist ein detailliertes Verständnis des Verhaltens von Cas9 nach der Reaktion erforderlich. Bisher wurde angenommen, dass Cas9 in eine einzelne, stabile post-Spaltungskonformation eintritt, deren Stabilität, insbesondere unter Einfluss von Torsion und Kraft, wie sie in der Zelle oft auftreten nicht gut untersucht ist. Unter Verwendung eines hochparallelen Magnetpinzetten-Experiments, das die gleichzeitige Beobachtung von bis zu Hunderten von DNA-Molekülen ermöglicht, wurde gezeigt, dass die post-Spaltungsstabilität von Cas9 und seinen mutierten Nickase-Varianten viel komplexer ist: Wenn der Non-Target- Strang (der Strang, der nicht an der R-Loop-Bildung beteiligt ist) gespalten wird, wie es bei Wildtyp-Cas9 und seiner Non-Target-Strang spaltenden Nickase-Variante der Fall ist, wird der gespaltene Non-Target-Strang über eine Drehbewegung um den anderen Strang herum unter Reibung freigesetzt. Auf diese Weise können diese Varianten hohe Torsionsspannungen aushalten und bleiben für Stunden an ihrem Ziel gebunden, was nachfolgende Zellreparaturmechanismen behindert. Für die Nickase-Variante, die nur den Target-Strang spaltet, kann der Non-Target-Strang bei ausreichend hohem Supercoiling-Niveau, wie es zum Beispiel während der Transkription in Zellen häufig vorkommt, nicht freigesetzt werden. Stattdessen kollabiert bei ausreichend hohen Supercoiling-Niveaus der R-Loop und die Cas9-Nickase dissoziiert von der DNA. Für diese Cas9-Variante deckten die Experimente mehrere verschiedene Stabilitätszustände mit Kollapszeiten von einigen Minuten bis hin zu Stunden auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nach der Spaltung hohe konformationelle Flexibilität mit komplexen Dynamiken zwischen verschiedenen Stabilitätszuständen gibt.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179 / Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated (Cas) proteins are new tools that allow unprecedented control over genetic material. Most CRISPR-Cas systems use a short RNA molecule incorporated into their structure to guide them to a specific, complementary sequence of DNA. Upon recognition of the complementarity, the DNA is then cleaved. Given the simple re-programmability of the guide RNA and high specificity for the targeted DNA sequence, these systems have shown immense potential in fields such as medicine, agriculture, biotechnology, and disease research, among others, and have attracted the attention of academia and industry. A thorough understanding of these systems on different scales is paramount to their safe usage, especially considering the ethical implications. In this work, complex single-molecule experiments combining several state-of-the-art methods were employed to shed light on some unresolved questions regarding target search and cleavage of these CRISPR-Cas systems. • Direct observation and quantification of the target search by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade The Type I-E CRISPR-Cas complex Cascade is a multi-protein complex without inherent nuclease activity that targets and binds double-stranded DNA by first detecting a short two-nucleotide long sequence called Protospacer Adjacent Motif (PAM) and then forming a so-called R-loop structure with the adjacent complementary DNA strand. While the process of R-loop formation has been studied extensively, the mechanism of how Cascade gets to the correct site in the first place - on potentially vast DNA sequences - remains unclear. To shed light on this process, a combined magnetic tweezers and fluorescence microscopy assay was established that allowed the simultaneous detection of DNA binding and R-loop formation. These experiments showed that Cascade employs a facilitated diffusion mechanism for target search. After a three-dimensional diffusion process, it randomly binds DNA and proceeds to one-dimensional scanning around the binding site. If no target is found, the process is repeated. If no target can be found, the one-dimensional scanning lasts approximately 150ms and spans several hundred potential targets. Twisting the DNA facilitates or hinders R-loop formation depending on the direction and thereby indirectly affects the duration. The experiments further showed that the efficiency of the target search, i.e., the probability of finding the correct target once a one-dimensional scanning event has started, also depends greatly on the level of supercoiling. While probabilities higher than 40% were found for negative supercoiling levels, i.e., with facilitated R-loop formation, it was as low as 5% in the absence of supercoiling. • Establishment of a kinetic model for the target search and recognition process employed by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Next, a kinetic model was developed, which described the target search as a random walk on DNA, during which the Cascade complex scans individual PAMs for adjacent targets. This model enabled predictions of target search parameters, such as search efficiency and duration, and also allowed the accurate description of target recognition probabilities once the correct PAM had been found under varying supercoiling levels. We found that upon encountering the correct target, the probability of successfully forming an R-loop is low, preventing stalling at only partially complementary sequences. However, our model predicts that the target site is revisited up to 15 times during one scanning process to compensate for the low recognition probability. It was thus shown that target search and recognition are tightly linked in a delicate process, minimizing time at off-targets while nonetheless enabling fast recognition. • Probing the stability of CRISPR-Cas9 after cleavage CRISPR-Cas9 is a single protein that targets and binds double-stranded DNA in an RNA-guided process similar to Cascade. In contrast to Cascade, Cas9 has inherent nuclease activity and cleaves the DNA upon R-loop formation. More specifically, Cas9 has two nuclease domains that each cleave one strand of the DNA. It is the currently most widely used tool for applications in genome editing. One finding that continues to puzzle researchers is that Cas9 stays bound to its DNA target for durations in the order of hours even after cleavage, making it a de facto single-turnover enzyme. From a biological standpoint, this is puzzling because CRISPR-Cas systems are in a tight arms race against their viral adversaries. From an application viewpoint, Cas9 conceals and obstructs the to-be-edited DNA site from the cells’ repair systems. For an efficient gene editing system, it is crucial to develop ways of removing Cas9 from its target in a controlled manner. For this, a detailed understanding of the post-reaction behavior of Cas9 is required. So far, Cas9 was believed to enter a single, stable post-cleavage conformation, the stability of which was not well understood, especially under the influence of force and twist. Employing a highly parallel magnetic tweezers experiment, allowing the simultaneous observation of up to hundreds of DNA molecules, the post-cleavage stability of Cas9 and its mutated nickase variants was shown to be much more complex: If the non-target strand (the strand not involved in the R-loop) is cleaved, as is the case for wild-type Cas9 and its non-target strand cleaving nickase variant, the cleaved non-target strand is released via a swiveling motion under friction. This way, these variants can release high torsional stress and stay bound to their target for hours, hindering subsequent cell repair machinery. The non-target strand cannot be released upon torsional stress for the nickase variant that only cleaves the target strand. Instead, if the supercoiling levels are high enough, as often applied in cells, for example during transcription, the R-loop collapses, and the Cas9 nickase dissociates from the DNA. We found several different stability states with collapse times of a few minutes up to hours. These results suggest high conformational flexibility after cleavage with complex dynamics between different stability states.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179

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Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79 / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79

Calcium imaging has been used as a promising technique to monitor the dynamic activity of neuronal populations. However, the calcium trace is temporally smeared which restricts the extraction of quantities of interest such as spike trains of individual neurons. To address this issue, spike reconstruction algorithms have been introduced. One limitation of such reconstructions is that the underlying models are not informed about the biophysics of spike and burst generations. Such existing prior knowledge might be useful for constraining the possible solutions of spikes. Here we describe, in a novel Bayesian approach, how principled knowledge about neuronal dynamics can be employed to infer biophysical variables and parameters from fluorescence traces. By using both synthetic and in vitro recorded fluorescence traces, we demonstrate that the new approach is able to reconstruct different repetitive spiking and/or bursting patterns with accurate single spike resolution. Furthermore, we show that the high inference precision of the new approach is preserved even if the fluorescence trace is rather noisy or if the fluorescence transients show slow rise kinetics lasting several hundred milliseconds, and inhomogeneous rise and decay times. In addition, we discuss the use of the new approach for inferring parameter changes, e.g. due to a pharmacological intervention, as well as for inferring complex characteristics of immature neuronal circuits.

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