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Clonación del CDNA y expresión del Gen de una proteina de la cromatina de embrión de guisante.Castillo Aliaga, Josefa 19 December 2001 (has links)
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El complejo mayor de histocompatibilidad humano: polimorfismo genómico del HLA-B35Chertkoff, Lilien Patricia January 1992 (has links)
La asociación diferencial del HLA-B35 con ciertas patologías en diversos grupos étnicos y su complejo patrón serológico, condujeron a postular, como hipótesis de trabajo, la eventual existencia de variantes polimórficas no distinguibles por serología que estarían presentes con frecuencias diferentes en los distintos grupos étnicos. Resultaba de particular interés su asociación con hepatitis crónica activa (secundaria a la infección por HBV) en nuestra población de origen latino. El objetivo de este trabajo de tesis fue, entonces, estudiar la naturaleza polimórfica de este alelo. Para alcanzar este objetivo se propuso:
a) En una primera etapa, la búsqueda de posibles patrones polimórficos de fragmentos de restricción (RFLP) del alelo HLA-B35 mediante hibridización genómica de Southern. Este estudio se realizó en el contexto del X Taller Internacional de Histocompatibilidad donde varios laboratorios analizaron en forma cooperativa los patrones de RFLP de los genes HLA en diferentes grupos étnicos. Este trabajo permitió definir correlaciones entre determinados RFLP y ciertas especificidades HLA de clase I. Así, hemos hallado un polimorfismo del gen B35, detectado con la enzima EcoRV, que permite distinguir a dos alelos serológicamente idénticos, uno de ellos ligado en haplotipo extendido al HLA-Cw4 y el otro a otros alelos del locus C.
b) Encarar el aislamiento y caracterización de un gen HLA-B35 a partir de un individuo caucasoide latinoamericano con ancestros españoles. El polimorfismo genómico arriba mencionado constituyó un excelente marcador que permitió investigar la presencia de este gen en los clones aislados.
La determinación de la secuencia nucleotídica de uno de dichos clones durante el presente trabajo de tesis, coincidió con la documentación de la secuencia de un gen B35 aislado de un individuo japonés.
Ambos alelos difieren entré sí en sólo 3 nucleótidos que ocasionan substituciones aminoácidicas, dos de ellas localizadas en el bolsillo de presentación antigénica. La naturaleza de estos cambios afecta la funcionalidad de ambos alelos como moléculas presentadoras de péptidos y sustenta la hipótesis antes mencionada para explicar la asociación diferencial. / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).
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Novos inibidores peptídicos de topoisomerases bacterianas estruturalmente derivados da proteína CcdBGarrido, Saulo Santesso [UNESP] 20 September 2007 (has links) (PDF)
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garrido_ss_dr_araiq.pdf: 1028585 bytes, checksum: e89c831c561b8a3f32e4e5f09d4310d6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A maioria das bactérias possui dois tipos de topoisomerases IIA, DNA girase e topoisomerase IV (topo IV), que juntas ajudam a administrar a integridade e a topologia do DNA. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação do DNA e transcrição. Isso faz da girase e da topo IV alvos importantes para diversas drogas antibacterianas. Estruturalmente, ambas operam como um heterotetrâmero composto por duas proteínas GyrA e duas proteínas GyrB, para a girase, e duas proteínas ParC e duas ParE, na topo IV. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a girase e a topo IV, tais como as quinolonas, cumarinas e algumas toxinas naturais, incluindo o CcdB. A toxina bacteriana CcdB, é uma pequena proteína de 11,7 kDa, contendo 101 resíduos de aminoácidos que, juntamente com o CcdA, faz parte de um sistema de morte celular programada do plasmídeo F, um fator de conjugação muito estudado em Escherichia coli. CcdB atua como uma toxina e o CcdA como a antitoxina. Na ausência de CcdA, CcdB pode matar a bactéria através de um mecanismo, ainda pouco conhecido, que envolve a girase e/ou a topo IV, assim como a região C-terminal da toxina CcdB (Trp-99 a Ile-101). Neste trabalho está descrita a obtenção de uma série de seqüências peptídicas miméticas, racionalmente projetadas, baseadas na estrutura primária do CcdB natural, com o objetivo de melhor entender o mecanismo de inibição da atividade de ambas, DNA girase e topo IV, pelo CcdB, e também propor um novo grupo de moléculas com potencial atividade antibacteriana. / Most bacteria posses two type IIA topisomerases, DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV), that together help manage DNA integrity and topology. Gyrase primarily introduces negative supercoils into DNA, and the topo IV, although closely related to gyrase, preferentially decatenates DNA and relaxes positive supercoils, essential functions for bacterial DNA replication and transcription. This makes of the gyrase and topo IV important targets for antibacterial drugs. Structurally both operate as a heterotetramer formed by two GyrA and two GyrB proteins for girase, and two ParC and two ParE proteins for topo IV. A large number of antibacterial agents act in the inhibition of the gyrase and topo IV, such as quinolones, coumarins, and some natural toxins including the protein CcdB. The bacterial toxin CcdB is a 11.7 kDa protein with 101 amino acids that with CcdA form a programmed cell death system of F plasmid, a conjugation factor widely studied in E. coli. CcdB acts like a toxin and CcdA as the antitoxin. In the CcdA absence, CcdB can kill the cell by an unclear mechanism that involves gyrase and/or topo IV, as well as the CcdB C-terminal region (Trp-99 to Ile-101). In this work it is described the obtaining of a several peptides mimics, rationally design, based on the primary structure of natural CcdB toxin, to a better understanding the inhibition mechanism of the activity of the gyrase and topo IV, by CcdB toxin, and also propose a new molecules group with potential antibacterial activity. The peptides mimics were synthesized by Solid Phase methodology (SPPS), purified and analyzed by liquid chromatography (HPLC) and identified by LC/ESI-MS and by amino acid analysis. The inhibition capacity of the peptide mimics was tested by electrophoresis agarose gels and by bacterial growth in liquid medium assays.
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Polissacarídeos do cogumelo Macroocybe titans : caracterização estrutural e atividade biológicaSilva, Shayane da January 2017 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Marcello Iacomini / Coorientadora : Profª. Drª. Fhernanda Ribeiro Smiderle / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 21/08/2017 / Inclui referências : f. 86-100 / Resumo: O cogumelo gigante Macrocybe titans assim como os demais basidiomicetos, desperta o interesse científico devido a sua possível bioatividade, em parte decorrente da presença de polissacarídeos com variadas características estruturais. Com base nisto, o presente trabalho teve por objetivo elucidar a estrutura química de alguns polissacarídeos presentes no basidioma de M. titans, bem como verificar seu efeito biológico frente a células de melanoma murino B16F10. Para isto, o corpo de frutificação do basidiomiceto seco, moído e deslipidificado foi submetido à processos sucessivos de extrações aquosas (a frio e a quente) e alcalina (NaOH 5%). Os extratos aquosos foram precipitados com etanol e dialisados contra água destilada, enquanto que o extrato alcalino foi neutralizado e dialisado contra água corrente. O extrato obtido a frio foi purificado por tratamento com ?-amilase, congelamento e degelo e diálise em membrana (1.000 kDa). O extrato a quente foi fracionado por congelamento e degelo, tratamento com ?-amilase e tratamento com Me2SO. O extrato alcalino, por sua vez, foi purificado por congelamento e degelo, tratamento com solução de Fehling ou NaOH 2% seguido de precipitação com ácido acético. A fração E1000, obtida do extrato a frio apresentou-se homogênea, sendo composta por galactose e fucose e contendo uma massa molar estimada em 14,2 x 103 g/mol. As análises de espectroscopia e metilação sugerem que esta molécula seja uma fucogalactana com uma cadeia principal composta por ?-D-Galp ligadas (1?6), substituída a cada 2 ou 3 unidades em O-2 por terminais não redutores de ?-L-Fucp. A atividade biológica desta molécula, bem como da fração bruta R6CW obtida do extrato a frio, foi avaliada em células de melanoma murino B16F10, sendo que a fração R6CW aumentou a capacidade endocítica do corante vermelho neutro pelas células em 48 h na concentrações de 10 e 50 ?g/mL, enquanto que a proliferação celular foi aumentada em todas as concentrações testadas em 48 h. A fucogalactana, por sua vez, não causou alteração na viabilidade celular e alterou a proliferação célular apenas na concentração de 50 ?g/mL em 72 h de tratamento. A fração SSD, obtida do extrato a quente, apresentou-se composta por mais de uma molécula, contendo principalmente glucose, galactose, manose e fucose. A análise espectroscópica indicou a presença de ?-D-Glcp, ?-D-Manp, ?-L-Fucp e ?-D-Galp nesta fração, que será submetida a outras etapas de fracionamento visando a purificação da mesma. As frações SFSEA e SSIEA, obtidas do extrato alcalino, apresentaram principalmente glucose em sua composição monossacarídica. Ambas as frações ao serem analisadas por espectroscopia, apresentaram sinais correspondentes à uma ?-D-Glucana contendo uma cadeia principal formada por unidades de ?-D-Glcp ligadas (1?3), ramificada em O-6 por ?-D-Glcp, o que foi confirmado pela degradação controlada de Smith, em que o material resistente à degradação apresentou sinais correspondentes à ?-D-Glcp ligada (1?3). A análise de metilação da fração SSIEA mostrou que a glucana presente nesta fração é substituída em O-6 na proporção de 1:1, podendo estas substituições serem tanto por unidades de ?-D-Glcp quanto por cadeias laterais de ?-D-Glcp ligadas (1?6). A fração SFSEA será submetida a análise de metilação visando a elucidação da sua estrutura química. Palavras-chaves: Macrocybe titans; Glucana; Fucogalactana; Atividade biológica. / Abstract: The giant mushroom Macrocybe titans, as well as the other basidiomycetes, arouse the scientific interest due to its possible bioactivity, in part due to the presence of polysaccharides with a varied chemical structures. Based on this, this work aimed to elucidate the chemical structure of some polysaccharides of M. titans fruiting bodies, as well as evaluate its biological activity on murine melanoma cells (B16F10). Therefore, the dried, powdered and defatted fruiting bodies were submitted to successive aqueous (cold and hot) and alkaline (NaOH 5%) extractions. The aqueous extracts were precipitated with ethanol and dialyzed against distilled water, while the alkaline extract was neutralized and dialyzed against tap water. The cold water extract was purified by ƒ¿-amylase treatment, freeze and thawing process and dialysis through membrane (1,000 kDa). The hot water extract was fractionated by freeze and thawing process, ƒ¿-amylase treatment and Me2SO treatment. The alkaline extract, on its turn, was purified by freeze and thawing, treatment with Fehling solution or with NaOH 2% followed by precipitation with acetic acid. The E1000 fraction, obtained from cold water extract, was pure and contained galactose and fucose, and an estimated molar mass of 14.2 x 103 g/mol. The spectroscopy and methylation analyses suggest that this molecule is a fucogalactan with a main chain composed of ƒ¿-D-Galp (1¨6) linked, branched at O-2 position by non reducing end units of ƒ¿-L-Fucp in the proportion of 2 to 3 units. The biological activity of this molecule, as well as the crude fraction R6CW obtained from the cold water extract, was evaluated in B16F10 cells. The R6CW fraction increased the cell endocytic capacity in 48 h at 10 and 50 ƒÊg/mL, while the cell proliferation was increased in 48 h at all concentrations tested. On the other hand, the fucogalactan did not cause changes in the cell viability, and altered the proliferation only at 50 ƒÊg/mL in 72 h of treatment. The SSD fraction, obtained of hot water extract was composed of more than one molecule and contained maily glucose, galactose, mannose, and fucose. The spectroscopic analyses indicated the presence of ƒÀ-D-Glcp, ƒ¿-D-Manp, ƒ¿-L-Fucp and ƒ¿-D-Galp in this fraction, that will be submitted to other purification steps aiming its purification. The fractions SFSEA and SSIEA, obtained from alkaline extract, presented mainly glucose as monosaccharides. Both fractions, when analyzed by spectroscopy showed signals corresponding to a ƒÀ-D-glucan containing a main chain composed of ƒÀ-D-Glcp (1¨3) linked, branched at O-6 position by ƒÀ-D-Glcp, which was confirmed after Smith degradation, which generated a resistant fraction with signals corresponding to the ƒÀ-D-Glcp (1¨3)-linked. The methylation analysis of SSIEA suggested that the ƒÀ-glucan present in this fraction is branched at a rate of 1:1, and the side chains can be composed by ƒÀ-D-Glcp units or ƒÀ-D-Glcp (1¨6)-linked chains. The SFSEA fraction will be subjected to methylation analysis to determine its chemical structure.
Keywords: Macrocybe titans; Glucan; Fucogalactan; Biological activity.
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Caracterização de uma fosforribohidrolase do tipo lonely guy de Azospirillum brasilense, com uma possível ação na biossíntese de citocininasRodrigues, Isabela Cavalcante January 2017 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/09/2017 / Inclui referências : f. 67-73 / Resumo: O gene "LONELY GUY" (LOG) de Arabidopsis thaliana codifica uma das enzimas associadas à biossíntese de citocininas. As citocininas são fito-hormônios reguladores do crescimento e desenvolvimentos de plantas. Por meio de ferramentas de bioinformática foram encontrados dois genes homólogos a LOG de Arabidopsis thaliana no genoma de Azospirillum brasilense FP2. A. brasilense é uma bactéria associativa de plantas, fixadora de nitrogênio e promotora de crescimento vegetal. A produção de fito-hormônios, entre eles as citocininas, está ligada a capacidade de promover o crescimento vegetal através da inoculação com bactérias. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar as proteínas Log1 e Log2 de A. brasilense. Os genes log1 e log2 foram amplificados através de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos de PCR foram clonados no plasmídeo pBlueScript II KS, sequenciados para confirmar a integridade da sequência de bases e subclonados nos plasmídeos pET28a e pET29a para expressão em E. coli BL21(DE3). As enzimas superexpressas com cauda de histidinas N-terminal ou C-terminal foram purificadas por cromatografia de afinidade a Ni2+. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que ambas as enzimas possuem atividade fosforribohidrolase, ou seja, clivam a ligação N-glicosídica entre a adenina e a fosforribose quando o AMP foi utilizado como substrato. Outros ensaios revelaram que a presença de fosfato ligado a posição 5' da ribose foi importante para a atividade das enzimas Log1 e Log2, já que não foi detectada atividade contra adenosina. A descoberta de enzimas homólogas as LOGs anteriormente descritas em plantas, tais como A. thaliana, contribuirá para o desenvolvimento de linhagens de bactérias que produzam quantidades elevadas de citocininas. Especificamente no caso de A. brasilense tal característica poderia ser utilizada para gerar estirpes mais eficientes no processo de promoção do crescimento vegetal. Palavra-chave: Citocininas, Azospirillum brasilense, fosforribohidrolases. / Abstract: The LONELY GUY gene (LOG) of Arabidopsis thaliana codes one of the enzymes associated with cytokinin biosynthesis. Cytokinins are phytohormones that regulate growth and development of plants. Azospirillum brasilense FP2 has two genes homologous to LOG of A. thaliana as revealed by genome searching through computational analysis with amino acid sequences of LOGs previously described. A. brasilense is a plant associate bacterium, nitrogen-fixing and plant growth promoter. The production of phytohormones, among them cytokinins, is linked to the ability to promote plant growth through inoculation with bacteria. Thus, the objective of this work was to characterise the A. brasilense Log1 and Log2 enzymes. The log1 and log2 genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were cloned into the plasmid pBlueScript II KS, sequenced to confirm their integrities and subcloned into plasmids pET28a and pET29a for expression in E. coli BL21 (DE3). The enzymes were over-expressed with an N-terminal or C-terminal six histidines-tag and were purified by Ni2+ affinity chromatography. Enzyme activity assays revealed that both enzymes have phosphoribohydrolase activity since they cleave the N-glycosidic bond between adenine and phosphoribose when AMP was used as the substrate. Other assays showed that the presence of a phosphate group bound to the 5'-carbon of ribose was essential for the activity of Log1 and Log2 enzymes since they did not cleave adenosine. The discovery of homologous enzymes to the LOGs previously described in plants, such as A. thaliana, will contribute to the development of lineages of bacteria that produce high amounts of cytokinins. Specifically, in the case of A. brasilense, this characteristic could be used to generate more efficient strains in the process of promoting plant growth. Keywords: Cytokinin, Azospirillum brasilense, phytohormones
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Cristalização de proteínas utilizando filme proteico organizado por campo elétricoWalter, Tássia Karina January 2017 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Elaine Machado Benelli / Coorientadora : Profª. Drª. Cecília Fabiana da Gama Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/03/2017 / Inclui referências : f. 33-34 / Resumo: A análise estrutural de proteínas é uma ferramenta de grande importância na biologia moderna, uma vez que possibilita o estudo do mecanismo de ação de diversas doenças e o desenvolvimento de novos medicamentos. Atualmente, a principal técnica utilizada no estudo da estrutura tridimensional de proteínas é a cristalografia de raios-X, sendo responsável pela resolução de cerca de 90% das estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB). Contudo, a difração de raios-X requer a obtenção de um cristal de proteína de alta qualidade. A cristalização de proteínas é um processo que exige condições específicas, envolvendo uma transição de fase na qual as moléculas de proteína deixam de ser solúveis e passam a formar núcleos organizados. Assim, esse processo é limitado pela nucleação, que requer o choque ordenado das moléculas de proteína para dar início ao crescimento do cristal. Esta, por sua vez, necessita que seja atingida a supersaturação das proteínas em solução. Para atingir essa condição utiliza-se mais comumente a técnica de difusão de vapor, na qual ocorre um aumento de concentração de proteína na gota por meio da difusão lenta de água para um reservatório com maior concentração salina. Quando a condição de supersaturação for atingida muito rapidamente, forma-se um precipitado amorfo em vez de cristais ordenados. Além disso, um nível de saturação muito alto pode levar a formação de inúmeros núcleos, desfavorecendo o crescimento dos cristais e prevalecendo cristais pequenos e de baixa qualidade. Na literatura são propostas diversas alternativas para facilitar a nucleação e crescimento dos cristais, que demandam concentrações menores de proteína e menos tempo. Uma alternativa comum é a chamada nucleação heterogênea, em que o meio cristalizante é semeado com materiais minerais ou orgânicos, como micro-cristais da própria proteína. Outra alternativa é a utilização de um campo elétrico, magnético ou eletromagnético para promover a organização das moléculas na solução de proteína. No entanto, muitas dessas metodologias ainda apresentam limitações, sobretudo com relação a qualidade dos cristais formados. Neste contexto, o presente trabalho apresenta uma nova abordagem para promover a nucleação, empregando a aplicação de um campo elétrico externo durante a formação de um filme protéico e a utilização deste filme organizado como centro de nucleação na cristalização por vapor-difusão. Como modelo de estudo foi utilizada a lisozima de clara de ovo de galinha. Através de imagens de microscopia de força atômica foi possível confirmar a estrutura organizada destes filmes e, por espectroscopia de infra-vermelho por transformada de Fourier foram verificadas pequenas alterações na estrutura secundária da proteína diante da aplicação do campo elétrico. Essa alterações, contudo, não comprometeram a estrutura final da proteína, permitindo um aumento no número de cristais formados, e, em alguns casos, uma melhora da morfologia e aumento do tamanho destes cristais. A análise por difração de raios-X indicou uma melhoria na qualidade da estrutura cristalina, sobretudo em condições nas quais tradicionalmente não se obtêm bons cristais de lisozima. Palavras-chave: cristalização de proteínas, filme organizado de proteína, lisozima, nucleação. / Abstract: Structural analysis of proteins is a tool of great importance in modern biology, since it allows the study of the mechanism of action of several diseases and the design of new drugs. Nowadays, the main technique used in the study of the three-dimensional structure of proteins is X-ray crystallography, being responsible for the resolution of about 90% of the structures deposited in the Protein Data Bank (PDB). However, X-ray diffraction requires a protein crystal of high quality. The protein crystallization is a process that demands specific conditions involving a transition phase in which protein molecules are no longer soluble and start to form organized nuclei. Thus, this process is limited by nucleation, which requires ordered shock of protein molecules to initiate crystal growth. This, in turn, needs to achieve supersaturation of proteins in solution. In order to reach this condition, the technique of vapor diffusion is used, in which an increase of protein concentration in the drop occurs through the slow diffusion of water to a reservoir with higher salt concentration. When the supersaturation condition is reached very quickly, an amorphous precipitate is formed instead of ordered crystals. In addition, a very high saturation level can lead to the formation of numerous nuclei, disfavoring the growth of crystals and prevailing small and low quality crystals. In the literature, several alternatives are proposed to facilitate nucleation and crystal growth, requiring lower protein concentrations and less time. A common alternative is the so-called heterogeneous nucleation, where the crystallizing medium is seeded with mineral or organic materials, such as microcrystals of the protein itself. Another alternative is the use of an electric, magnetic or electromagnetic field to promote the organization of molecules in the protein solution. However, many of these methods still have limitations, especially regarding to the quality of the crystals formed. In this context, the present work presents a new approach to promote nucleation, employing the application of an external electric field during the formation of a protein film and the use of this organized film as nucleation center in the vapor diffusion crystallization. The chicken egg white lysozyme was used as the study model. Through atomic force microscopy images it was possible to confirm the organized structure of these films, and with Fourier transform infrared spectroscopy were observed small changes in protein secondary structure when the electric field was applied. These changes, however, did not compromise the final structure of the protein, allowing an increase in the number of crystals formed, and, in some cases, an improvement in the morphology and size increase of these crystals. The X-ray diffraction analysis indicated an improvement in the quality of the crystalline structure, especially under conditions in which good crystals of lysozyme are traditionally not obtained. Keywords: protein crystallization, protein organized film, lysozyme, nucleation.
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Peptídeos inibidores de topoisomerases bacterianas : síntese e estudos de transporte através da membrana celular empregando moléculas peptídicas carreadoras /Barros, Ronaldo Souza de. January 2009 (has links)
Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Wilson Rogerio Lustri / Banca: Antonio de Miranda / Resumo: CcdB é uma proteína de 11,7 kDa, com 101 resíduos de aminoácidos, produzida pelo plasmídeo F, como parte de um sistema de morte programada, de dois componentes, para a manutenção do número de cópias do plasmídeo. Neste sistema, CcdB age como uma toxina e o CcdA como um antídoto. Na ausência do CcdA, devido à perda do plasmídeo durante a replicação celular, CcdB pode matar bactéria pela inibição das enzimas DNA-girase e topoisomerase IV (topo IV). Girase e a topo IV são topoisomerases, ATP dependentes, responsáveis pelos processos de replicação e transcrição do DNA bacteriano, de modo que exercem papel fundamental na viabilidade dos microrganismos procariotos. Peptídeos derivados do CcdB têm demonstrado grande capacidade de inibição enzimática in vitro, porém a baixa permeabilidade da membrana celular bacteriana a estes derivados tem prejudicado a atividade in vivo. No intuito de criar um meio para facilitar a inserção de derivados sintéticos do CcdB em células bacterianas, uma série de peptídeos, constituídos de quatros seqüências carreadoras fundidas ao derivado peptídico CcdB1, foi sintetizada pela metodologia da fase sólida. Estes peptídeos foram testados quanto à inibição da girase e topo IV em solução. Dois peptídeos apresentaram inibição, com valores de IC100 abaixo de 100 μM, para ambas as enzimas. Estudos de dicroísmo circular associado aos ensaios de inibição evidenciaram forte dependência da atividade com a presença da hélice C-terminal. O derivado CPP1-CcdB1 apresentou atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis, a uma concentração de 50 μM, mostrando que a inserção de uma seqüência carreadora, pode facilitar o transporte de derivados do CcdB através da membrana celular. Além disso, a molécula de CcdB1 pode servir como um bom modelo para o desenvolvimento de novos CPPs. / Abstract: CcdB is an 11.7 kDa protein with 101 amino acid residues, produced by the F plasmid as part of a two-component system of programmed cell death for maintaining plasmid copy number. In this system, CcdB acts as a toxin and CcdA as an antidote. In the absence of the CcdA, due to loss of plasmid during cell replication, CcdB can kill bacteria by inhibition of the DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV) enzymes. Gyrase and topo IV are ATP dependent topoisomerases, responsible for the transcription and replication processes in bacterial DNA, so that carries key role in the viability of prokaryotes microorganisms. Peptides derived from CcdB have shown great capacity for in vitro enzyme inhibition, but the low permeability of the bacterial cell membrane to these derivatives has damaged the activity in vivo. In order to create a form to facilitate the insertion of synthetic derivatives of CcdB in bacterial cells, a series of peptides, consisting of four carrier peptide sequences fused to the derived CcdB1, was synthesized by the solid phase methodology. These peptides were tested about inhibition of Gyrase and topo IV activities, in solution. Two peptides showed inhibition, with values of IC100 below 100 mM for both enzymes. Circular dicroism studies associated with inhibition tests showed strong dependence of activity with the presence of the C-terminal helix. The CPP1-CcdB1 derivative showed antimicrobial activity against Bacillus subtilis at a concentration of 50 mM, showing that the insertion of a carrier sequence can facilitate the transport of derivatives of CcdB through the cell membrane. In addition, the CcdB1 molecule is a good model to develop new CPPs. / Mestre
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Identificación y validación de biomarcadores ómicos involucrados en el pronóstico de recurrencia bioquímica de cáncer de próstataEspinoza Portocarrero, Miguel Arturo 22 October 2018 (has links)
El cáncer de próstata es la segunda neoplasia más común en la población masculina del
mundo. El comportamiento clínico del cáncer de próstata localizado es muy variable;
mientras que algunos casos tienen un tipo agresivo de cáncer que resulta en metástasis
y muerte del paciente, otros tendrán un tipo indolente que se puede curar con terapias o
monitorear cuidadosamente. Existen múltiples sistemas de estratificación de riesgo de
mortalidad que usan parámetros clínicos, como los niveles de PSA y la Puntuación de
Gleason. No obstante, estos criterios no pueden predecir adecuadamente el riesgo de
recurrencia bioquímica.
Los pacientes con cáncer de próstata no pueden ser dicotomizados con precisión en
grupos de recurrencia bioquímica de bajo o alto riesgo mediante el uso de parámetros
clínicos. Por este motivo se integró información genómica y clínica con el objetivo de
identificar potenciales biomarcadores predictivos y generar firmas pronóstico que
permitan una dicotomía más acertada de los pacientes. Se empleó una metodología de
análisis estadístico predictivo de la recurrencia bioquímica utilizando genes relacionados
con la regeneración de células madre de relevancia para la recurrencia bioquímica de
cánceres, como la vía de señalización Wnt y la pluripotencia de células madre; y la
contribución del parámetro clínico de la Puntuación de Gleason, de manera que se
generó un firma pronóstico integrada.
La firma integrada fue validada en cohortes independientes de pacientes disponibles en
repositorios internacionales para ser dicotomizados en grupos de riesgo que puedan
asociarse con un pronóstico bueno o malo. De esta manera, se tendrá un mejor
pronóstico de los pacientes y la asignación adecuada de terapias para su tratamiento.
Queda claro que el desarrollo y validación de nuevos biomarcadores para evaluar el
pronóstico de recurrencia en cáncer de próstata contribuiría a mejorar la salud en la
mayoría de los países independientemente de sus características sociales, económicas,
culturales y epidemiológicas. / Tesis
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Funciones Catalíticas de las Oxidasas de Giberelinas en Fusarium KonzumPonce López, Iván Alexis January 2008 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / El hongo filamentoso Fusarium konzum pertenece al complejo taxonómico
Gibberella fujikuroi formado por 9 especies biológicas que se han aislado desde
distintas plantas y que sintetizan diversos metabolitos secundarios. Dos especies
del complejo, F. fujikuroi y F. konzum, producen giberelinas (GAs), diterpenos
activos como fitohormonas. Las demás especies no producen GAs aunque
contienen los genes respectivos o parte de ellos.
En este trabajo se caracterizó la biosíntesis de GAs en la cepa I3 de F.
konzum tanto a nivel de las reacciones químicas como de las enzimas que las
catalizan y se comparó con la especie bien estudiada, F. fujikuroi. El análisis de
GAs endógenas en distintas cepas de F. konzum indicó que el producto principal
de la vía metabólica es la lactona 3,13-dihidroxilada GA1. También se encontró
ácido giberélico (GA3) aunque en menor cantidad. Mediante la administración de
precursores marcados con 14C a los cultivos líquidos, se determinó la secuencia
biosintética para GA1 en la que participan como intermediarios el ácido entkaurenoico,
el GA12 aldehído, y las giberelinas 3b-hidroxiladas GA14 (C20) y GA4
(C19). La vía 3b-hidroxilada es la principal y la vía no hidroxilada es menor. La
reacción de hidroxilación en C13 ocurre al final de la secuencia, sobre el GA4 en
cambio la hidroxilación en C3b ocurre en una etapa temprana, a nivel del GA12
aldehído.
En las incubaciones con ácido ent-14C-kaurenoico se acumularon los
intermediarios 14C-GA14 y 14C-GA4 en tanto que a partir del precursor 14C-GA12 se
formó el C20 alcohol (14C-GA15) y el C20 aldehído (14C-GA24) además del
producto lactónico 14C-GA9. Esto sugiere que las oxidasas de GAs presentan
eficiencias reducidas en F. konzum lo que se confirmó determinando en los
cultivos las velocidades de las reacciones respectivas. Se encontró que en la cepa
I3 de F. konzum la GA14 sintasa oxida al ácido ent-14C-kaurenoico con una
velocidad 397 veces menor que en la cepa ACC917 de F. fujikuroi mientras que la
C20 oxidasa metaboliza el 14C-GA12 con una velocidad reducida en un factor de
216. La reacción final de la secuencia, la 13-hidroxilación, es la etapa limitante de la biosíntesis de GA1 y presentó en F. konzum, una velocidad 48 veces menor
que en F. fujikuroi.
Utilizando fracciones microsomales obtenidas del micelio de la cepa I3 de F.
konzum se demostró que la fuente de electrones para las reacciones de
hidroxilación en 3b y oxidación en C7 del GA12 aldehído es exclusivamente el
NADPH, lo que sugiere que la citocromo P450 reductasa sería la proteína
transportadora de electrones asociada a la GA14 sintasa en este organismo y
probablemente también estaría asociada a las demás monooxigenasas de GAs.
Tanto la C20 oxidasa como la 13-hidroxilasa de F. konzum presentaron eficiencias
similares en presencia y en ausencia de NH4NO3 lo que sugiere que en esta
especie de Fusarium el mecanismo de regulación por nitrógeno descrito en F.
fujikuroi no es funcional o presenta una baja eficiencia. Esto generaría una baja
expresión de los genes de la biosíntesis de GAs explicando la velocidad reducida
de las reacciones estudiadas.
La secuencia de biosíntesis de giberelinas desde el ácido ent-kaurenoico
hasta GA1 y GA3 en F. konzum es similar a la de F. fujikuroi pero ambos sistemas
difieren en la eficiencia de las oxidasas y en el mecanismo de inducción lo que
explicaría la generación de distintos productos finales y la acumulación de
intermediarios en F. konzum / The filamentous fungus Fusarium konzum belongs to the taxonomic
complex Gibberella fujikuroi formed by nine biological species isolated from
different plants which synthesize various secondary metabolites. Two species of
the complex, F. fujikuroi and F. kozum produce gibberellins (GAs), diterpene
metabolites active as phytohormones. The other species do not produce GAs even
when they contain all or some of the GA-biosynthetic genes.
In this work gibberellin biosynthesis was characterized in F. konzum at the
level of the chemical reactions as well as of the respective enzymes and was
compared to the well known GA-producing species F. fujikuroi. Endogenous GAs
analysis indicated that the main product was the 3,13-dihydroxylated lactone GA1.
Gibberellic acid (3,13-dihydroxylated, D1,2; GA3) was also found in the cultures
although at a lower level. The metabolic sequence for GA1 biosynthesis was
determined by adding 14C-labelled precursors into liquid cultures of I3 F. konzum
strain which showed that ent-kaurenoic acid, GA12 aldehyde, GA14 (C20) and GA4
(C19) are intermediates of the sequence. The 3b-hydroxylated pathway is the
major pathway while the non-hydroxylated is a minor pathway. Hydroxylation at
C13 occurs in a late step of the sequence over GA4 or GA7 in contrast to 3b-
hydroxylation that occurs over GA12 aldehyde at an early step.
In incubations with ent-14C-kaurenoic acid, the 3b-hydroxylated products
14C-GA14 and 14C-GA4 accumulated while the C20 alcohol (14C-GA15) and the C20
aldehyde (14C-GA24) were formed from 14C-GA12 besides the lactonic product 14CGA9.
This result suggests that GA oxidases would have reduced catalytic
efficiencies in F. konzum which was confirmed by determining the rates of the
respective reactions in cultures of the strain I3. In this strain GA14 synthase oxidized
ent-14C-kaurenoic acid with a rate 397 times lower than in F. fujikuroi (ACC917
strain) while C20 oxidase metabolized 14C-GA12 with a rate reduced by a factor of 216. The last reaction of the sequence, 13-hydroxylation is the limiting step of GA
biosynthesis and showed in F. konzum a rate 48 times lower than in F. fujikuroi.
Microsomal fractions obtained from the mycelia of F. konzum catalyzed 3b-
hydroxylation and C7-oxidation of GA12 aldehyde exclusively in the presence of
NADPH. This suggests that cytochorome P450 reductase would be the electron
transport protein associated to GA14 synthase and probably to the other GA
monooxygenases in this Fusarium species. Gibberellin C20 oxidase as well as 13-
hydroxylase have similar catalytic efficiencies in cultures containing ammonium
nitrate or without this compound which suggests that nitrogen regulation of GA
biosynthesis is not functional in F. konzum or has a low efficiency. This would
explain the reduced rates found for the reactions catalyzed by GA
monooxygenases in I3.
The biosynthetic sequence from ent-kaurenoic acid to GA1 or to GA3 is
similar in F. konzum and in F. fujikuroi although both systems differ in the efficiency
of the GA oxidases and in the effect ammonium nitrate which would result in
different final products in both systems as well as in accumulation of intermediates
in F. konzum
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Regulación de la autofagia por el receptor del inositol trisfosfato (IP3R)Criollo Céspedes, Alfredo January 2009 (has links)
Doctor en Bioquímica / La macroautofagia, comúnmente referida como “autofagia” es la principal vía de degradación de proteínas, organelos y material citoplasmático, permitiendo de este modo el reciclaje del material intracelular. Este proceso consiste en el englobamiento de fracciones citosólicas por una estructura multimembranar llamada “autofagosoma”, el cual posteriormente se fusiona con el lisosoma para formar el “autofagolisosoma”. Luego el material comprendido en el autofagolisosoma es degradado por enzimas hidrolíticas. Un estudio mostró que la inhibición de la enzima inositolmonofosfatasa (IMPasa) usando litio y L690.330, inducía una disminución de los niveles basales del IP3 y en consecuencia la generación de autofagia. Nuestros resultados confirmaron estos datos previos, demostrando que el pre tratamiento con mio-inositol revierte la autofagia inducida por litio y L-690.330. Además se demuestra que el pre tratamiento con mio-inositol también revertía la autofagia inducida por privación de nutrientes. IP3 es ligando de su receptor de IP3 (IP3R), el cual es el principal canal de Ca2+ a nivel del retículo endoplásmico. El principal objetivo de esta tesis es evaluar el rol del IP3R en la regulación de la autofagia. Los resultados mostraron que la disminución de los niveles proteicos del IP3R usando siRNA específicos, así como el tratamiento con antagonistas químicos del IP3R, tales como xestosponginas B y C, estimulaban significativamente el aumento en los niveles de autofagia. Además, xestospongina B, así como también la privación de nutrientes, indujo una pérdida en la interacción entre Bcl-2 y Beclin-1, los cuales interactúan en condiciones basales. El tratamiento con xestospongina B no perturbó los niveles de Ca2+, tanto en retículo endoplásmico como en el citosol, concluyendo que la autofagia inducida por xestospongina B es independiente de una fluctuación del Ca2+. Los experimentos de inmunoprecipitación mostraron que Beclin-1 (regulador clave en la inducción de la autofagia) interactúa tanto con IP3R así como con Bcl-2 en condiciones basales, y la interacción de este complejo es atenuado bajo condiciones de privación de nutrientes o por tratamiento con ABT737, el cual es un mimetizador de dominios BH3. Este resultado sugiere la presencia de un complejo proteico en la regulación de la autofagia. El papel del retículo endoplásmico en el desarrollo de la autofagia toma gran significancia debido al reclutamiento de proteínas clave (IP3R, Beclin-1 and Bcl-2). La relación entre autofagia y estrés de retículo no es clara y por lo tanto se evaluó el efecto de agentes inductores de estrés de retículo en la inducción de la autofagia. Los resultados mostraron que tunicamicina, tapsigargina y brefeldina-A (agentes inductores de estrés de retículo) activaron el UPR (respuesta a proteínas mal plegadas) e indujeron autofagia. La disminución de los niveles de proteínas claves en el desarrollo de la autofagia (Atg5, Atg10, Atg12, Vps34 y Beclin-1) usando específicos RNAs interferentes atenuaron la autofagia inducida por agentes inductores de estrés de retículo y xestospongina B. Además, la sobreexpresión de Bcl-2 y Bcl-XL con destinación a retículo endoplásmico atenuó la autofagia inducida por xestospongina B e inhibidores de la IMPasa. Esta tesis muestra novedosos resultados, los cuales dan cuenta de un complejo proteico IP3R/Beclin-1/Bcl-2 en la regulación de la autofagia. / Macroautophagy (herein referred to as “autophagy”) is the major catabolic pathway for
entire organelles, long-lived/ aberrant proteins and superfluous portions of the cytosol. It
consists of the stepwise engulfment of substrate elements into distinctive
multimembraned “autophagosomes”, which after fusion with lysosomes form singlemembraned
autophagolysosomes. Into the autophagolysosome, the engulfed material
is degradated by lisosomal hidrolytic enzymes, leading the recyclage of intracellular
material. A study has suggested that myo-inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) could
regulate autophagy because inhibition of inositol monophosphatase (IMPasa) by lithium
or L-690.330 stimulates autophagy through the depletion of IP3. Our results have
confirmed that the reduction of intracellular IP3 levels by IMPasa inhibitors (lithium and
L.690.330) stimulates autophagy, whereas the enhancement of IP3 levels by pre
treatment whit mio-inositol inhibits the lithium and L.690.330 effect. Moreover we have
demostred that autophagy induced by nutrient privation was also inhibited by treatment
with mio-inositol, but the effect of nutrient privation in the intracellular IP3 basal levels
was not evaluated. IP3 acts on the IP3 receptor (IP3R), an IP3‑activated Ca2+ channel
of the endoplasmic reticulum membrane and consequently we wanted to evaluate de
roll of IP3R in the regulation of autophagy.
The results obtained in this thesis show that knockdown of the IP3 receptor (IP3R) with
specifics small interfering RNAs and pharmacological IP3R antagonist (xestospongin B
and C) are a strong stimulus for the induction of autophagy, in addition, xestospongin B
(like nutrient starvation) induced loss in the interaction between Beclin-1 and Bcl-2.
Moreover, the autophagy promoted by xestospongin B not produced alterations in the
steady-state Ca2+
levels in the ER or in the cytosol, therefore the autophagy induced by
xestospongin B was Ca2+-independent. Immunoprecipitation assays shown that Beclin-
1 (key protein in the regulation of autophagy) interacts with IP3R and Bcl-2 in basal
conditions, and this interaction may be attenuated both by nutrient starvation or ABT737 treatment, which is a mimetic compound of BH3. These results suggest the presence of
a protein complex in the regulation of autophagy. The treatment whit ER stressors such
as tunicamycin, thapsigargin and brepheldine A induced Unfolded Protein Responses
(UPR) and autophagy. The autophagy induced by these agents showed to be IRE1α
dependent, but the inhibition of autophagy showed an increase in the cell death,
indicating a pro survival function of the autophagy upon endoplasmic reticumum stress
conditions. The autophagy induced by treatment with xestospongin B and ER stressors
was inhibited by knockdown of Atg5, Atg10, Atg12, Vps34 and Beclin-1, which are keys
proteins in the autophagic process. We have also evaluated the roll of Bcl-2 and Bcl-XL
in the inhibition of autophgy, and the results showed that Autophagy triggered by
IMPasa inhibitors and xestospongin B was inhibited by Bcl-2 and Bcl-XL over expression
specifically targeted to ER but not Bcl-2 or Bcl-XL proteins targeted to mitocondria.
Altogether, these results suggest that IP3R form a regulator complex with Bcl-2 and
Beclin-1, which exerts a major role in the physiological control of autophagy
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