La aprobación sucesiva de normativas acerca de la contaminación de suelos (RD 9/2005) y los cambios en el uso del suelo, están aumentando la demanda en la descontaminación de suelos. Sin embargo, aún existen áreas necesitadas de investigación como son el estudio de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación; estudiar el destino de los contaminantes y evaluar la ecotoxicidad de los procesos de biorremediación. Se ha llevado a cabo una caracterización catabólica de tres consorcios microbianos no definidos, obtenidos mediante procesos de enriquecimiento con diferentes familias de hidrocarburos, para su utilización en la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Para ello, se han incubado tres consorcios (TD, F1AA y AM) con crudo de petróleo ligero (Casablanca). Los resultados obtenidos muestran que la capacidad catabólica de los tres consorcios está en consonancia con el sustrato utilizado para su obtención. Asimismo, la amplificación de los consorcios en medio rico para su utilización en experiencias reales de bioaumento, no disminuye su potencial degradador. La adición de los ramnolípidos MAT10, producidos por Pseudomonas aeruginosa AT10 incrementa la biodegradación del crudo Casablanca por el consorcio AM, tanto la tasa de biodegradación como la degradación de algunos componentes como los isoprenoides de la fracción saturada y los HAPs alquilados de la fracción aromática.. Se ha realizado una caracterización de la diversidad microbiana del consorcio AM, degradador de HAPs, mediante métodos dependientes e independientes de cultivo. Para ello se han aislado cepas heterotrofas y degradadoras de HAPs, se han construido librerías de clones de genes 16S y 18S rRNA y se ha estudiado la población de genes 16S rRNA por DGGE. Se han identificado un total de 19 componentes microbianos diferentes pertenecientes al grupo filogenético de las Proteobacterias (16/19), Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB) (2/19) y Ascomicota (1/19). Los resultados obtenidos indican que es necesario realizar estudios polifásicos para conocer más profundamente la composición de un consorcio microbiano.Se ha diseñado un protocolo de ensayos de biotratabilidad, a escala de laboratorio, previo a la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, que consta de 2 fases de estudio. La primera fase evalúa la presencia de poblaciones microbianas, su actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes presentes en el suelo. La segunda fase estudia la optimización de las condiciones fisicoquímicas (humedad, aireación, nutrientes inorgánicos, biodisponibilidad) y biológicas (posibilidad de inocular poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación durante la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Se han aplicado los ensayos de biotratabilidad para la biorremediación de un suelo contaminado por creosota y se ha profundizando en la caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica del proceso de biodegradación. Los resultados obtenidos en la fase I, indican que el suelo es apto para la aplicación de la biorremediación. La aireación y la humedad del 40% de la capacidad de campo han sido los factores claves para alcanzar una importante biodegradación de los TPH y de los HAPs de 3 y 4 anillos, por parte de la población autóctona del suelo. El análisis por DGGE combinado con el análisis de componentes principales muestra que la estructura y la composición de las comunidades microbianas cambia de forma muy distinta con la adición de nutrientes, así como también a lo largo de todo el proceso de biodegradación. El proceso de biorremediación disminuye la toxicidad y la teratogenicidad de los lixiviados evaluados por los ensayos de Microtox® y FETAX, así como también la genotoxicidad potencial de los TPH analizada por microscopía de fuerzas atómicas (AFM), pero no disminuye la letalidad del suelo entero frente a Eisenia foetida. ENGLISH / Successful application of bioremediation technology to contaminated soil requires knowledge of the characteristics of the site and the parameters that affect the microbial biodegradation of pollutants.Three microbial consortia were obtained by sequential enrichment using a variety of oil products. The three consortia (TD, AM, F1AA) were incubated with a crude oil to assess their metabolic capacity and to identify possible differences in their pattern of biodegradation. Metabolic capacity was found to depend on the carbon source used in the enrichment procedures. Amplification of the consortia by subculture in rich media did not affect this capacity. Addition of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 increased biodegradation by consortium AM,. A microbial consortium (AM) used for the aerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs) was examined by a triple approach based on various cultivation strategies, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and screening of 16S and 18S rRNA gene clone libraries. 19 microbial components were identified. Proteobacteria were the dominant group (16/19), whilst the Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group (CFB) was 2/19, and the ascomycota fungi 1/19. The results indicate that polyphasic assessment is necessary for a proper understanding of the composition of a microbial consortium. A protocol for biotreatability assays in two phases was proposed. In the first phase we examined the type and metabolic activity of the soil indigenous microorganisms, the presence of possible inhibitors and the biodegradability of contaminants. In the second phase several parameters affecting bioremediation were evaluated in microcosms. The application of this protocol to 2 hydrocarbon-contaminated soils is described. The information obtained from the results in the first phase of the protocol indicates whether a biological treatment of contaminated soil is appropriate, whereas in the second phase the most appropriate treatment is evaluated. Biotreatability assays, bacterial community dynamics and biodegradation processes were investigated in a highly creosote-contaminated soil. Moisture content and aeration were established as the key factors of PAH bioremediation. TPH, three- and four-ringed PAHs were degraded significantly in all treatments (72-79% and 83-87% respectively). Enumeration of heterotrophic and PAH-degrading populations, DGGE analysis and Principal Component Analysis corroborated a dramatic shift in bacterial community, due to both the addition of nutrients and the biodegradation process. Acute toxicity and teratogenicity were evaluated by MicrotoxTM, Eisenia foetida and FETAX assays, and potential genotoxicity was assayed by atomic force microscopy (AFM).

La presente tesis doctoral tiene como principal objetivo aportar conocimiento en el área de la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, mediante el estudio a escala real y de laboratorio de tratamientos enfocados a mejorar la degradación de los contaminantes y el uso de técnicas moleculares para determinar la biodiversidad microbiana presente en el suelo, así como su evolución a lo largo de dichos tratamientos. Los estudios llevados a cabo pretenden abordar aspectos todavía no resueltos y por tanto necesitados de investigación. En primer lugar la presencia de hidrocarburos de elevado peso molecular como las fracciones alifáticas pesadas o los HAPs de 4 y 5 anillos, en concentraciones excesivamente elevadas después de aplicar la biotecnología de la biorremediación con técnicas convencionales como la aireación y la adición de nutrientes. Otro aspecto a resolver es la falta de accesibilidad de estas moléculas de excesivo tamaño molecular a aquellos microrganismos capaces de metabolizarlas. Cabe resaltar que mientras el grupo de investigación logró muy buenos resultados en la utilización de biosurfactantes para mejorar la biodisponibilidad de hidrocarburos de elevado peso molecular en medio líquido, los intentos llevados a cabo en distintos suelos, no condujeron a ninguna mejora de la biodegradación. Finalmente el reto más importante que actualmente tiene la comunidad científica, es aumentar el conocimiento de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación. Deberíamos dejar la pura descripción para alcanzar el objetivo último que sería conocer qué función está llevando a cabo cada microorganismo identificado. Por suerte, las metodologías moleculares que están evolucionando vertiginosamente nos están ofreciendo el camino. Relacionado con este aspecto, y que quizás no ha sido abordado suficientemente, estaría el conocimiento de las interacciones entre bacterias y hongos o entre poblaciones autóctonas y aquellas introducidas como inóculos en procesos de bioaumentación. El presente trabajo de tesis doctoral aborda todos estos aspectos que se exponen en seis capítulos: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil y (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil. / The main objective of the present thesis work is to provide knowledge in the field of bioremediation of hydrocarbon contaminated soils, by performing field-scale and lab-scale treatments focused on improving the degradation of organic pollutants and the use of molecular techniques to determine the microbial biodiversity present in the soil and their evolution due to the treatment effect. The studies carried out intended to address unresolved issues and therefore in need of investigation. Firstly, the presence of high molecular weight hydrocarbon fractions such as heavy aliphatic or 4 and 5-ring PAHs, in excessively high concentrations after application of bioremediation biotechnology techniques as aeration and addition of nutrients. Another issue to address is the lack of accessibility of these high molecular weight compounds for those microorganisms able to metabolize them. It is noteworthy that while our research group obtained very good results using biosurfactants to improve bioavailability of PAHs in liquid medium, the attempts made in different soils did not lead to any improvement in biodegradation. Finally, the most important challenge that currently has the scientific community in our research field is to increase the knowledge of microbial populations involved in bioremediation processes. We should achieve the objective of knowing what function is conducting each organism identified and try to forget the simply ecological description. Fortunately, molecular methodologies are faster than before. Related to this aspect, it is important to highlight the paramount importance for bioremediation success of the interactions between bacteria and fungi or between indigenous communities and those introduced as inoculum in bioaugmentation processes. The present doctoral thesis deal with all these issues, which are presented in six chapters: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil and (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil.

Pollution by toxic compounds is one of the most relevant environmental damages to ecosystems produced by human activity and, therefore, it must be considered in environmental protection and restoration of contaminated sites. According to this purposes, the main goal of this doctoral thesis has been to analyse the impact of several chlorophenols and heavy metals on the microbial communities of two typical Mediterranean soils. The ecological risk concentrations of each pollutant, which have been determined according to respirometric activity and changes in the microbial community composition, and the factors that influence on their effective toxic concentrations (bioavailable pollutants) have been analysed in order to predict their potential impact on different soil ecosystems and provide scientific data for the regulation of the soil protection policies. Moreover, resistant microorganisms with pollutant removal capacities have been isolated from artificially contaminated soil microcosms and tested in axenic cultures, to infer their potential usefulness for bioremediation. / La contaminació amb compostos tòxics antropogènics és un dels perjudicis ambientals més rellevants per als ecosistemes i, per tant, cal tenir-ho en compte en la protecció ambiental i la restauració de llocs contaminats. Amb aquests propòsits, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat analitzar l’impacte de clorofenols i metalls pesants sobre la microbiota de dos sòls típicament mediterranis. S’han analitzat les concentracions de risc ecològic de cada contaminant, determinades segons activitat respiromètrica i canvis en la composició de la comunitat microbiana, i els factors que influeixen en les seves concentracions tòxiques efectives (contaminants biodisponibles), per predir l’impacte potencial sobre diferents ecosistemes edàfics i proporcionar evidències científiques per a les polítiques de protecció del sòl. D’altra banda, a partir de microcosmos edàfics contaminats artificialment, es van aïllar també microorganismes resistents amb capacitat per eliminar els contaminants, que van ser analitzats en cultius purs per avaluar-ne la utilitat potencial en bioremediació.