A necessidade de dispositivos analíticos para detecção precoce de câncer tem motivado pesquisas em nanomateriais de baixo custo, com busca de sinergia para obter alta sensibilidade e seletividade em biossensores. Neste trabalho, o ácido 11-mercaptoundecanóico, o polímero natural quitosana e a proteína concanavalina A (Con A) foram usados como plataforma para imobilizar anticorpos anti-CA 19-9 e construir biossensores para detecção de câncer de pâncreas. Esses biossensores foram produzidos com uma matriz de filmes automontados por adsorção química (self-assembled monolayers, SAM) e por adsorção física (layer-by-layer, LbL). A caracterização com técnicas espectroscópicas e gravimétricas permitiu selecionar as arquiteturas com quitosana/ Con A 2:1 (sensor A), quitosana/ Con A 1:1 (sensor B) e 11-MUA (sensor E), como sendo mais favoráveis à imobilização do anticorpo anti-CA 19-9. Usando os biossensores com espectroscopia de impedância foi possível detectar baixas concentrações do biomarcador CA 19-9, com limites de detecção entre 0,17-0,69 U/mL, 0,31-0,91 U/mL e 0,56-0,91 U/mL para os sensores A, B e E, respectivamente. Esses limites são suficientes para detectar câncer de pâncreas nos estágios iniciais. A seletividade dos dispositivos foi inferida em uma série de experimentos de controle com amostras de células SW 620 e HT-29, ácido úrico, ácido ascórbico, glicose, manose, sérum e antígeno p24, indicando ausência de interferência não específica ao biomarcador. O uso de técnicas de visualização de informação permitiu facilmente distinguir essas amostras, classificando-as de acordo com a concentração do biomarcador em um mapa. Permitiu também quantificar a seletividade dos biossensores através do coeficiente de silhueta, com valores 0,853, 0,861 e 0,897 para os sensores A, B e E, respectivamente. Essa especificidade dos biossensores foi confirmada por medidas de PM-IRRAS, através das bandas de amida I e II em 1566 cm-1 e 1650 cm-1, indicando a interação específica entre anticorpo e antígeno, que pode ser modelada com uma isoterma de Langmuir-Freundlich. Quando a matriz de quitosana/ Con A foi substituída por um filme monocamada ou quando se empregou um biomarcador de maior peso molecular, a adsorção do biomarcador foi explicada por uma combinação de dois processos de Langmuir-Freundlich. Conclui-se que os biossensores de baixo custo podem ser eficientes para diagnóstico e prognóstico, e serem implementados na rede nacional de saúde com disseminação da tecnologia. / The need of analytical devices to detect cancer at early stages has motivated research into nanomaterials where synergy is sought to achieve high sensitivity and selectivity in biosensors. In this work, 11-mercaptoundecanoic acid, the polymer chitosan and the protein concanavalin A (Con A) were used as a platform to immobilize the anti-CA 19-9 antibody using the self-assembled monolayer (SAM) and the layer-by-layer (LbL) techniques. The characterization with spectroscopic and gravimetric techniques allowed us to select the architectures with chitosan/Con A 2:1 (Sensor A), chitosan/Con A 1:1 (Sensor B) and 11 MUA (Sensor E) as optimized for immobilization of anti-CA 19-9 antibodies. Using impedance spectroscopy, the biosensors were capable of detecting low concentrations of CA 19-9 biomarker, with limit of detection in the range 0.17-0.69 U/mL, 0.31-0.91 U/mL and 0.56-0.91 U/mL for sensors A, B and E, respectively. These limits are sufficient to detect pancreatic cancer at early stages. The selectivity of the biosensors was inferred in a series of control experiments with cell samples SW-620 and HT-29, uric acid, ascorbic acid, glucose, mannose, serum and p24 antigen, indicating the absence of non-specific interference. With information visualization techniques, these samples could be easily distinguished in a visual map, and be classified according to their content of CA 19-9. Furthermore, the selectivity could be quantified through the silhouette coefficient, with values 0.853, 0.861 and 0.897 for sensors A, B and E, respectively. This biosensor specificity was confirmed with PM-IRRAS measurements by monitoring the amide I and II bands at 1566 cm-1 and 1650 cm-1. The specific interaction between antibody and antigen was modeled with a Langmuir-Freundlich isotherm. When the chitosan/Con A matrix was replaced by a SAM monolayer or if a larger biomarker was employed, adsorption was explained by a combination of two Langmuir-Freundlich processes. In conclusion, low cost biosensors may be effective for diagnostics and prognostics, and may be further implemented in the Brazilian national health system with technology transfer.

Desde a descoberta dos nanotubos de carbono, tem sido grande o interesse em explorar suas aplicações, e uma delas é a modificação de eletrodos. Muitos trabalhos ilustram as vantagens da aplicação de eletrodos de carbono vítreo modificados com nanotubos de carbono e enzimas. Estes sistemas apresentam resposta amperométrica elevada, com diminuição nos potencias de oxidação ou redução do substrato ou produto enzimático, eliminando a resposta de interferentes. Apresentam bons limites de detecção, melhoras na sensibilidade e estabilidade à medida que oferecem um microambiente favorável à atividade da enzima. Todas estas vantagens tornam interessante o emprego de tais biossensores no monitoramento de pesticidas. Diante da escassez de trabalhos que descrevem esta aplicação, neste trabalho, objetivou-se explorá-la, com ganho em sensibilidade pelo uso dos nanotubos de carbono e em seletividade pelo uso das enzimas. Neste trabalho foi desenvolvido um nanobiossensor para a determinação de carbaril em amostras de tomate. Para isto, os nanotubos de carbono utilizados foram tratados quimicamente e em seguida caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão. O eletrodo de carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono foi caracterizado eletroquimicamente e por microscopia eletrônica de varredura. A enzima acetilcolinesterase utilizada teve sua atividade catalítica enzimática determinada pelo método espectrofotométrico. O nanobiossensor teve seus parâmetros de operação otimizados e foi utilizado na determinação de carbaril em amostras de tomate. A avaliação de reprodutibilidade de preparação do nanobiossensor apresentou desvio padrão relativo de 4,02%. Os desvios padrão relativos para a repetibilidade e reprodutibilidade de medidas são, respectivamente, 1,18 e 3,27%. Duas amostras de tomate foram dopadas com 0,500 µmol L-1 e 6,00 µmol L-1 de carbaril, e as respectivas recuperações foram de 96,00 e 95,08%. Os limites de detecção e quantificação obtidos com o nanobiossensor foram LD = 8,96 nmol L-1 e LQ = 29,9 nmol L-1. / Since the discovery of carbon nanotubes, a great interest in exploring their applications has raised, being one of those the modification of electrodes. Many works has shown the advantages of applying glassy carbon electrodes modified with carbon nanotubes and enzymes. These systems present elevated amperometric response with decreased potentials of oxidation or reduction of either the substract or the enzymatic product, eliminating the response of interferences as well. Moreover, these systems present good detection limits, as well as sensibility and stability improvements in consequence of a favorable microenvironment for the enzyme action. All these advantages make interesting the employment of such biosensors in pesticides monitoring. Due to the scarcity of works describing this kind of application, the aim of this work is its exploration, focusing on sensibility increasing caused by the use of carbon nanotubes, as well as selectivity increasing caused by the use of enzymes. In this work a nanobiosensor was developed to carbaryl determination in tomato samples. For this, the employed carbon nanotubes were chemically treated before their characterization by transmission electron microscopy. The glassy carbon electrode modified with carbon nanotubes was characterized both electrochemically and by scan electron microscopy. The employed acetylcholinesterase enzyme had its enzymatic activity measured by spectrophotometric means. The nanobiosensor had its operational parameters optimized and it was employed in the determination of carbaryl in tomato samples. The reproducibility of the nanobiosensor preparation was 4.02%. The relative standard deviation for the repeatability and reproducibility were, respectively, 1.18 and 3.27%. Two tomato samples were spiked with 0.500 µmol L-1 and 6.00 µmol L-1 of carbaryl, and their respective recoveries were 96.00 and 95.08%. The detection and quantitation limits obtained with the developed nanobiosensor were, respectively, 8.96 and 29.9 nmol L-1.

Essa tese de doutoramento utiliza a auto-organização dos filmes finos layer-by-layer (LbL), auto-organização por alcanotióis mistas (SAMmix) e monocamada de Langmuir no desenvolvimento de dispositivos e novas metodologias para aplicações em nanomedicina. Foram desenvolvidos e aplicados biossensores utilizando as técnicas de LbL e SAM. Dentre os biossensores construídos está o sensor para óxido nítrico (NO•), que é de grande importância no sistema fisiológico. O sensor foi construído por meio da modificação de ultramicroeletrodos de fibra de carbono pela técnica LbL. A caracterização do sensor foi realizada por voltametrias e espectroscopias de impedância eletroquímica. Os resultados revelaram que a difusão de NO• é dependente do número de bicamadas empregadas e da disposição das moléculas no filme. O sensor com arquitetura CF-(PAMAM/NiTsPc), fibra de carbono (CF), ftalocianina de níquel tetrasulfonada (NiTsPc) e dendrímero poliamidoamina (PAMAM), apresentou o melhor sinal analítico. Além disso, foi analisada a detecção de NO• com interferentes como nitrito, nitrato, peróxido de hidrogênio, ácido ascórbico, dopamina, epinefrina e a norepinefrina. Os resultados mostraram alta seletividade devido à utilização do dendrímero PAMAM. O segundo biossensor utilizou a enzima acetilcolinesterase imobilizada em monocamadas auto-organizadas mistas (SAMmix) de alcanotióis. A detecção eletroquímica mostrou-se altamente sensível, uma vez que não há o uso do glutaraldeído como agente reticulante. Com essa plataforma foi possível desenvolver um biossensor de acetilcolina estável e robusto, sendo calculado o valor de Km app = 0,46x10-3 mol L-1, limite de detecção LD=3,32x10-10 mol L-1 e limite de quantificação LQ=1,11x10-9 mol L-1, valores inferiores aos encontrados na literatura, ressaltando a eficiencia da nova plataforma. Seguindo a mesma idéia de auto-organização, foram realizados estudos de nanotoxicidade utilizando modelos de membrana a partir de filmes de Langmuir. O principal objetivo foi elucidar a ação dos nanotubos de carbono (SWCNT), PAMAM e do nanocomplexo entre os dois materiais (SWCNT-PAMAM) nas membranas celulares, a nível molecular, usando um sistema modelo de membrana. A penetração de SWCNT e dos nanocomplexos em monocamadas lipídicas foi estudada utilizando microscopia de ângulo de Brewster (BAM) simultaneamente com cinética de absorção e pressão de superfície. Os resultados confirmaram a interação entre os nanomateriais e a membrana, indicando que a presença dos nanomateriais afeta o empacotamento dos lipídios. Foram realizados ainda estudos de citotoxicidade dos mesmos nanomateriais em sistemas celulares in vitro. Os resultados de citometria, proliferação celular, morfologia e inibição de adesão apresentaram-se evidenciaram que a combinação entre SWCNT e PAMAM, proporciona um maior índice de toxicidade em relação ao SWCNT, um comportamento diferente do que relatado nos componentes individuais. A toxicidade de nanocomplexos de SWCNT-PAMAM e de seus componentes individuais podem estar fortemente ligados ao tipo de material e como estes estão disponíveis no meio de cultura. Os estudos contidos nessa tese mostram a versatilidade dos filmes finos em sistemas auto-organizados e biomiméticos, e podem ser relevantes para o avanço de pesquisas sobre interação de nanomateriais e biossistemas. / In this thesis we employed the concept of self-organization, including the layer-by-layer (LbL) technique, alkanethiols self-assembled monolayers (SAMmix) and Langmuir monolayers, to develop new methods for materials and devices manipulation for application in nanomedicine. Two different types of biosensors were developed. The first one was based on the LbL technique to detect nitric oxide (NO•), which is of great importance in the medicine. The second biosensor was based on SAM monolayers supporting acetylcholinesterase for pesticide monitoring. The NO• was constructed by modified carbon fiber (CF) assembled with nickel phtalocyanine tetrasulfonade (NiTsPc) and polyamidoamine dendrimer (PAMAM) in the form of ultramicroelectrodes (UMEs) by the LbL technique. The sensor was characterized using differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. The results showed that NO• diffusion is dependent on the number of bilayers employed and the arrangement of molecules in the film. The sensor architecture with CF-(PAMAM/NiTsPc) presented the best analytical signal. In addition, we analyzed the detection of interfering with NO• as nitrite, nitrate, hydrogen peroxide, ascorbic acid, dopamine, epinephrine and norepinephrine. The results showed high selectivity due to the use of PAMAM dendrimer as selective layer. The second biosensor used the enzyme acetylcholinesterase immobilized on SAMmix. The electrochemical detection of carbaryl was highly sensitive, since there is no use of glutaraldehyde as crosslinking agent. Using acetylcholine as a probe, Kmapp value was determined at 0.46x10-3 mol L-1, with detection limit of 3.32x10-10 mol L-1 and quantification limit of 1.11x10-9 mol L-1, values lower than those found in the literature, highlighting the efficiency of the new platform. Langmuir films made of lipids were employed as cell membrane models, in order to investigate the interactions between single-wall carbon nanotubes (SWCNT), PAMAM and their nanocomplex (SWCNT-PAMAM) at the molecular level. The interation of SWCNT and nanocomplexes in lipid monolayers was studies using Brewster angle microscopy (BAM) in conjunction with absorption kinetics and surface pressure. The results confirmed the interaction between nanomaterials and the membrane, indicating that the presence of nanomaterials affects the packing of the lipids. Cytotoxicity studies were also employed to investigate the interaction of nanomaterials in in vitro cell systems. The results of flow cytometry, cell proliferation, morphology and inhibition of adhesion revealed the toxicological aspects of the materials, demonstrating a higher toxicity to the nanocomplex, compared to SWCNT, differently of the individual components. The toxicity of SWCNT nanocomplex and its individual components can be related to the type of material and how these materials are available in the culture medium. The studies in this thesis show the versatility of self-assembly thin films on biomimetic systems and may be relevant to the advance of research on the interaction of nanomaterials and biosystems.

Neste projeto estudou-se a interação da enzima peroxidase de raiz forte (HRP) em interfaces nanoestruturadas e sua possível aplicação em biossensores de peróxido de hidrogênio. Foram utilizadas as técnicas de Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) e automontagem por adsorção física para formar filmes nanoestruturados. A interação da enzima com espécies em interfaces foi investigada com materiais que serviram de matrizes de adsorção, ou seja, a quitosana (Ch) e o fosfolipídio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)] (sal de sódio) (DPPG). Os filmes de Langmuir foram caracterizados com medidas de pressão e potencial de superfície, espectroscopia no infravermelho, e tensão superficial dinâmica. Para os filmes LB e automontados, empregaram-se espectroscopias de fluorescência, ultravioleta-visível e infravermelho e microgravimetria por cristal de quartzo. A peroxidase de raiz forte apresentou forte interação com DPPG, confirmada em filmes de Langmuir por medidas de pressão de superfície, elasticidade dinâmica e de espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho, com modulação por polarização (PM-IRRAS). A massa de peroxidase transferida em filmes Langmuir-Blodgett (LB) mistos com DPPG foi de aproximadamente 200 ng, de acordo com medidas com uma microbalança de cristal de quartzo. A atividade da HRP foi mantida no filme LB, inclusive com atividade catalítica maior do que em meio homogêneo e nos filmes automontados com quitosana. As medidas de atividade não afetaram a morfologia dos filmes LB, estudada com microscopia de força atômica (AFM), ao contrário dos filmes automontados. Conclui-se que a imobilização de HRP é mais eficiente num filme LB, com matriz fosfolipídica, apresentando boas perspectivas de emprego em biossensores de peróxido de hidrogênio. / A study has been performed on the interaction of the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in nanostructured interfaces and their possible application in biosensors for hydrogen peroxide. The nanostructured films were obtained with the Langmuir, Langmuir-Blodgett (LB) and layer-by-layer (LbL) methods. The interaction between HRP and species at interfaces was investigated using materials that served as matrix for immobilization, viz. chitosan (Ch) and the phospholipid 1,2-dipalmytoil-sn-glycero-3-[phosphatidyl-rac-(1-glycerol)] (sodium salt) (DPPG). The Langmuir films were characterized with surface pressure, surface potential, elasticity measurements and polarization-modulation reflection and absorption infrared spectroscopy (PM-IRRAS). For LB and LbL films, use was made of fluorescence, absorption in the UV-vis. and infrared spectroscopy. HRP displayed strong interaction with DPPG, which was confirmed in Langmuir films with measurements of surface pressure, dynamic elasticity and PM-IRRAS. The mass of HRP transferred onto a solid support in a mixed LB film with DPPG was 200 ng, according to data from a quartz crystal microbalance. The HRP activity was preserved in the mixed LB film, with a catalytic activity that was even higher than in solution or in LbL films of HRP/Ch. The catalytic activity measurements did not affect the morphology of the LB films, studied with atomic force microscopy (AFM), in contrast to the LbL films. The main conclusion is that HRP immobilization is more efficient in an LB film with a phospholipid matrix, with good prospects for developing biosensors for hydrogen peroxide.

Nesta dissertação, foram estudados os métodos de síntese de filmes poliméricos como matrizes hospedeiras da enzima tirosinase vislumbrando o desenvolvimento de biossensores mais seletivos e duradouros na detecção de compostos fenólicos. Os polímeros utilizados e preparados por cronoamperometria em acetonitrila foram: polipirrol (PPI), polimetiltiofeno (PMET) e copolímero PPI-PMET. Os filmes PPI-PMET apresentaram características intermediárias às dos filmes PPI e PMET, conforme se verificaram em espectros na região do infravermelho (FTIR), voltametria cíclica e microscopia de força atômica (AFM), evidenciando, assim, a formação de uma nova matriz polimérica. O processo de superoxidação do filme PPI-PMET foi estudado visando a uma imobilização mais eficiente da enzima, quando se obteve uma condição na qual a superoxidação ocorre somente nas cadeias de PPI. Biossensores amperométricos foram preparados a partir do uso da tirosinase extraída do abacate como fonte enzimática por imobilização física e realizada de maneiras diferentes em filmes não superoxidados e superoxidados. Foi feita a otimização das respostas dos filmes variando-se o pH, potencial de trabalho, concentração da enzima e tempo de imobilização da enzima para a detecção de catecol. Os resultados indicaram que a superoxidação do PPI nos filmes PPI-PMET favoreceu a imobilização da enzima, embora não fosse tão eficiente quando se comparou aos filmes com o PPI não superoxidado. Contudo, os biossensores, em geral, apresentaram grande sensibilidade ao catecol, com um limite de detecção baixo, da ordem de 0,12 µmol/L. / The synthesis methods of polymer films as host matrices of the enzyme tyrosinase were studied in this dissertation. It was expected the development of selective and everlasting biosensors for the detection of phenolic compounds. The used polymers were prepared by chronoamperometry in acetonitrile as followed: polypyrrole (PPI), polymethylthiophene (PMET) and copolymer PPI-PMET. The PPI-PMET films showed intermediate characteristics as the PPI and PMET films, as observed in the infrared spectra (FTIR), cyclic voltammetry and atomic force microscopy (AFM), thus indicating the formation of a new polymeric matrix . The process of overoxidized of PPI-PMET film was studied in order to achieve a more efficient immobilization of the enzyme, whilst it was achieved a condition in which overoxidized occurs only in the PPI chain. Amperometric biosensors were prepared from the use of tyrosinase extracted from avocado as an enzyme source by physical immobilization and performed in different ways in both overoxidized and non-overoxidized films. It was performed the optimization of the responses of the films by varying pH, operacuonial potential, enzyme concentration and time in the enzyme immobilization for the detection of catechol. The results showed that the overoxidized PPI in the films PPI-PMET favored the immobilization of the enzyme, although not as efficient when compared to the films with nom overoxidized PPI. Neverthless, the catechol biosensors showed a high sensitivity with a low detection limit in the order of 0.12 µmol/L.

Orientadora: Mônica Alonso Cotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-31T00:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AldelianeMariada_M.pdf: 11574559 bytes, checksum: 5c39733d3a4441b98e7edbef8adbd795 (MD5) Previous issue date: 2016 / Resumo: Este trabalho apresenta resultados de nossa investigação sobre as propriedades elétricas do biossensor do tipo transistor de efeito de campo (FET, do inglês Field Effect Transistor) baseado em fosfeto de índio (InP). A estrutura deste biossensor consiste em um filme fino de InP do tipo-n crescido por Epitaxia de Feixe Químico (CBE, do inglês Chemical Beam Epitaxy) sobre um substrato de InP semi-isolante. No nosso biosensor, o contato da porta foi substituído por uma camada de biomoléculas carregadas de interesse para a detecção, funcionalizadas na camada de óxido do InP. O campo elétrico associado a estas biomoléculas pode modular o canal de condução. O sistema de interação específica utilizado foi a hibridização de fitas de ssDNA (single stranded DNA) complementares, onde os oligonucleotídeos receptores (probe) ssDNA foram imobilizados covalentemente na superfície da amostra. Este procedimento foi realizado através da oxidação com plasma de O2, seguida da funcionalização utilizando etanolamina e polietileno glicol (PEG), que serve como linker para a imobilização de receptores na superfície. As medidas elétricas de detecção foram feitas com as moléculas de target diluídas em buffer TRIS. A hibridização do DNA provoca um aumento na densidade de cargas na superfície, que consequentemente aumenta a largura da região de depleção no semicondutor, variando a resistência medida. A resposta do biossensor corresponde à variação da resistência em função da concentração de target. O biossensor apresentou sensibilidade para medidas de concentrações entre 10 pM e 30 pM, onde ocorre a saturação, e o tempo de resposta, no qual encontramos a estabilização do sinal medido, foi de aproximadamente 20 min. Variando a concentração de portadores e a espessura da camada semicondutora, verificamos alterações no limite de saturação (até ?M) e na sensibilidade do dispositivo. O controle destas propriedades, porém, mostrou-se limitado devido à variações na dopagem residual do semicondutor, e por isso discutimos aqui alternativas à geometria do dispositivo. Analisamos também a camada funcionalizada através de medidas de topografia e potencial de superfície usando métodos de microscopia de varredura por sonda (SPM, do inglês Scanning Probe Microscopy). Pudemos identificar a variação no potencial de superfície associada à imobilização do PEG e do DNA probe, mas não obtivemos resolução para o DNA target. Esta técnica permitiu porém verificar a estratificação de quatro níveis de potencial de superfície, no caso onde a funcionalização resultou em camadas mais espessas do que os valores típicos (~2 nm de espessura), em pequenas áreas do semicondutor / Abstract: This dissertation presents our results for the electrical properties investigation of Indium Phosphide (InP) based Field Effect Transistor (FET) biosensor. The structure of this biosensor consists of a thin n-type InP film grown by Chemical Beam Epitaxy (CBE) on a semi-insulating InP substrate. In our biosensor, the gate contact has been replaced by charged biomolecules of interest for detection, functionalized to the InP oxide layer. The electric field associated with these biomolecules provides the conduction channel modulation. The specific interaction system used here was the hybridization of single stranded-DNA (ssDNA) complementary oligonucleotides, for which the ssDNA receivers (probes) were covalently immobilized on the sample surface. The functionalization was carried out by oxidation with O2 plasma, followed by grafting biomolecules using ethanolamine and polyethylene glycol (PEG), which act as a linker for immobilizing the receptors on the surface. Electrical detection measurements were made with the target molecules diluted in TRIS buffer. DNA hybridization causes an increase in the surface charge density; consequently the semiconductor depletion width increases, affecting the measured resistance. The biosensor response function corresponds to the resistance variation as a function of target concentration. Our biosensor showed measured sensitivity to concentrations between 10 pM and 30 pM, for which signal saturation occurs. The response time, for which the measured signal stabilization was observed, was approximately 20 min. By varying the carrier concentration and the thickness of the semiconductor layer, we observed changes in the saturation limit (up ?M) and device sensitivity. The control of these properties, however, is limited due to variations in the residual doping of the semiconductor. Therefore we discuss here alternative device geometries. We also analyzed the functionalized layer by topography and surface potential measurements obtained using scanning probe microscopy (SPM) methods. We were able to identify the change in surface potential associated with the immobilization of PEG and probe DNA, but not for the target DNA. These techniques have however shown four surface potential levels in the case when the functionalization resulted in non-uniform layers, thicker than the typical values (~ 2 nm), in small areas of the semiconductor / Mestrado / Física / Mestra em Física / 165741/2014-7 / CNPQ

Neste trabalho, foram fabricados biossensores amperométricos a partir do uso da polifenol oxidase (PFO), obtida do abacate como fonte enzimática, imobilizada em filmes de polipirrol (PPI) e que foram eletrossintetizados em meio de três diferentes eletrólitos de suporte (NaCl e NaClO4 e NaDDS). O método de imobilização enzimática foi o da adsorção, sendo a solução de enzima adicionada à solução com o pirrol e o eletrólito durante o processo de eletropolimerização. Os filmes de PPI/PFO foram caracterizados por técnicas eletroquímicas, principalmente por voltametria cíclica. A detecção de compostos fenólicos (catecol e pirogalol) foi realizada pela técnica de cronoamperometria após se variar a concentração do analito. A morfologia dos filmes foi estudada por microscopia de força atômica (AFM), sendo observado que a presença da enzima no filme polimérico assim como o uso de diferentes eletrólitos de suporte levou a diferenças na superfície dos filmes. Além disto, verificou-se que o biossensor construído a partir do uso do NaCl, apresentava uma resposta mais eficiente, ou seja, ele foi capaz de detectar catecol e pirogalol em um menor limite de detecção. / In this study amperometric biosensors were manufactured from the use of polyphenol oxidase (PPO) obtained from avocado as a source of enzyme immobilized in polypyrrole (PPY) films that were electrosynthesized with three different support electrolytes (NaCl, NaClO4 and NaDDS). The method of enzyme immobilization was the adsorption. The PPO was added in the solution containing pyrrole and electrolyte during electropolymerization. The PPY/PPO films were characterized by electrochemical techniques mainly by cyclic voltammetry. Detection of phenolic compounds (catechol and pyrogallol) was performed by the technique of chronoamperometry after varying the concentration of the analyte. The morphology of the films was studied by the atomic force microscopy (AFM) and observed that the presence of the enzyme in the polymer film and the use of different electrolytes support led to differences in the surface of films. However it was found that the biosensor constructed from the use of NaCl showed more efficient response and it was able to detect catechol and pyrogallol in a lower limit of detection.

Este trabalho tem como principal objetivo comparar as respostas de biossensores amperomé-tricos preparados a partir do uso de uma enzima, a tirosinase (polifenoloxidase, PFO), quando nas formas purificada e adquirida comercialmente e de extrato bruto enzimático do fruto do abacate (Persea Americana). As soluções de PFO apresentaram valores de atividades enzimá-ticas de 479 unidades de enzimas ativas por mililitro (UA mL-1) (purificada) e 259 UA mL-1 (extrato bruto). A enzima nas duas formas (pura e como extrato bruto) foi imobilizada quimi-camente em substratos de Au modificados com monocamadas automontadas (self-assembly monolayers, SAMs) de ácido mercaptopropiônico (MPA) pela técnica de impressão por mi-crocontato (CP). Os biossensores foram preparados sobre substratos de Au modificados por CP com um molde elastomérico de polidimetilsiloxano (PDMS), cujas trilhas paralelas de 100 m foram produzidas pela cura polimérica sobre um molde mestre de GaAs. A réplica de PDMS se mostrou fiel em relação ao molde mestre nos picos e vales, mas apresentou defeitos na borda dos moldes. Com o objetivo de otimizar o funcionamento dos biossensores, eles fo-ram caracterizados pelas técnicas de voltametria cíclica e cronoamperometria com um sistema de análise de injeção em fluxo (FIA) em meio de catecol a diferentes concentrações. Os po-tenciais de oxidação do catecol nos eletrodos de Au modificados foram observados em 418 e 365 mV, em pHs ótimos de funcionamento de 7,0 e 7,2, e com limites de detecção de 6,65 nmol L-1 e 4,65 nmol L-1 para os biossensores com a enzima purificada e com o extrato bruto, respectivamente. A saturação dos sensores teve início a uma concentração de catecol de 0,02 mol L-1. Com estes resultados, mostramos que é possível o preparo de biosensores com um baixo custo, eficientes e miniaturizadas a partir do uso da PFO na forma extrato bruto do fruto do abacate para a detecção de compostos fenólicos, tal como catecol, abrindo assim a possibi-lidade de uso destes biossensores na análise e no monitoramento de pesticidas presentes no solo e na água. / The main objective of this master thesis is to compare the performance of amperometric biosensors prepared using the purified tirosinase (PPO) enzyme, (commercially acquired) and the PPO present in the enzymatic crude extract from the avocado fruit (Persea Americana). The PPO solutions had 479 units of active enzyme per milliliter (UA mL-1) (purified) and 259 UA mL-1 (crude extract). Both forms of the enzyme (purified and crude extract) were chemically immobilized on gold substrates patterned with 3-mercaptopropionic acid (MPA) self assembled monolayers (SAMs), using the microcontact printing (CP) technique. The biosensors were prepared on gold subtracts patterned using CP with a polydimethylsiloxane (PDMS) elastomeric mold, that was shaped in the form as tracks using a gallium arsenate master mold. The PDMS mold was quite similar to the master mold in its peaks and valleys, but defects were found on the edges. In order to optimize the parameters of the biosensors , they were characterized using cyclic voltammetry and chronoamperometry techniques in a FIA system by cathecol injections at different concentrations. The oxidation potentials for the cathecol analysis using the patterned biosensors were observed at 418 and 365 mV, the optimum pH were 7,0 and 7,0, with detection limits of 6,65 nmol L-1 and 4,65 nmol L-1 for the purified enzyme and crude extract biosensors, respectively. The biosensors saturation point started at 0,02 mol L-1 of cathecol concentration. With this results, we demonstrate that it is possible to use miniaturized, efficient, low cost biosensors based on tyrosine from the avocado´s fruit crude extract to detect phenolic compounds, as the cathecol. This expands the possibility of using this biosensors in the analysis and monitoring pesticides in water and soil.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O câncer do ovário é um tipo de câncer ginecológico que se origina nos órgãos reprodutores femininos. Geralmente o diagnóstico é realizado tardiamente, quando a doença já está em um estágio avançado, e que reflete na alta taxa de mortalidade. É uma doença silenciosa, assim como a Hepatite B, doença causada pelo vírus da hepatite B (VHB), altamente infecciosa e de difícil tratamento devido à inflamação no fígado. Realizar o diagnóstico precoce e o monitoramento é de extrema importância uma vez que ambas as doenças levam à morte inúmeras pessoas anualmente. Contudo, os diagnósticos tradicionais são caros, demorados e não confirmativos, e, portanto, o desenvolvimento de novas estratégias de detecção e monitoramento é interesse para a Saúde Pública. Uma das melhores alternativas são os biossensores, que são sensores químicos cujo sistema de reconhecimento é dotado de biomoléculas que realizam reações bioquímicas. Apresentam vantagens sobre os métodos existentes, como o baixo custo, elevada seletividade e sensibilidade, detecção em tempo real e resposta rápida. Avaliando a gravidade dos casos de cânceres de ovários e as altas taxas de infecção da hepatite B, este trabalho teve como objetivo desenvolver dois biossensores eletroquímicos com características únicas e inovadoras. Para a detecção do CA 125 (antígeno carboidrato 125), marcador tumoral usado no diagnóstico e monitoramento do câncer de ovário, foi construído um imunossensor eletroquímico empregando eletrodos screen-printed funcionalizados com o poli (3-hidroxifenilacético) e solução de ferrocianeto de potássio. O sensor demonstrou ser uma plataforma versátil, com alta seletividade e interessante para diagnóstico e monitoramento do câncer. Para a análise de Hepatite B foi construído um genossensor tendo como plataforma eletrodos de grafite funcionalizados com poli (4-aminofenol) e brometo de etídio como indicador eletroquímico de hibridização. A plataforma desenvolvida teve características únicas e inovadoras, apresentando vantagens inerentes à sua aplicabilidade em amostras de plasma, importante no diagnóstico precoce da doença. / The ovarian cancer is a gynecologic cancer that originates in the female reproductive organs. Usually the diagnosis is made late, when the disease is already at an advanced stage, which reflects in the high rate of mortality. It is a silent disease, such as hepatitis B disease caused by hepatitis B virus (HBV), highly infectious and difficult to treat due to liver inflammation. Perform early diagnosis and monitoring is extremely important since both diseases lead to death numerous people annually. However, traditional diagnostic tests are expensive, time consuming and not confirmatory, and therefore the development of new detection and monitoring strategies is relevant to public health. One of the best alternatives are biosensors, chemical sensors which are recognition system is provided with biomolecules performing biochemical reactions. They have advantages over existing methods, such as low cost, high selectivity and sensitivity, real-time detection and immediate response. Assessing the severity of cases of ovarian cancer and high rates of hepatitis B infection, this study aimed to develop two electrochemical biosensors with unique and innovative features. To CA125 (carbohydrate antigen 125) detection, tumor marker used in the diagnosis and monitoring of ovarian cancer, was built an electrochemical immunosensor employing screen-printed electrodes functionalized with poly (3-hydroxyphenylacetic) and potassium ferrocyanide solution. The sensor has proven to be a versatile platform with high selectivity, interesting for diagnosis and monitoring of cancer. For the analysis of hepatitis B was built a genosensor using graphite electrodes functionalized with poly (4-aminophenol) as platform and ethidium bromide as electrochemical indicator of hybridization. The developed platform has unique and innovative features with advantages inherent to its applicability in plasma samples, important in the early diagnosis of the disease. / Tese (Doutorado)

O trabalho descrito nesta tese mostra a aplicação de um sistema de detecção condutométrica sem contato acoplado capacitivamente (C4D) para monitorar interações biomoleculares em microssistemas analíticos. Inicialmente, o desempenho analítico de microssistemas fabricados em vidro, poli(dimetilsiloxano) (PDMS) e poliéster-toner (PT) foi avaliado de modo a escolher o melhor material (em termos de facilidades de fabricação, custo e repetibilidade) para os ensaios biomoleculares. Dentre os materiais estudados, os dispositivos fabricados em PT mostraram-se mais adequados para testes rápidos, onde a repetibilidade analítica não é o parâmetro mais importante. Os dispositivos fabricados em PDMS e selados contra uma placa de vidro apresentaram os melhores resultados em termos de repetibilidade e o desempenho analítico foi similar aos dispositivos de vidro. Dessa maneira, os dispositivos fabricados em PDMS/vidro foram escolhidos para a demonstração dos objetivos da tese. Por outro lado, os dispositivos fabricados em PT foram explorados para estudar a configuração geométrica do sistema de C4D. A instrumentação para monitoramento dos ensaios de ligação foi composta basicamente de dois sistemas de C4D, um software escrito em LabVIEW e um sistema de bombeamento das soluções. De modo a encontrar a configuração ideal da cela de detecção, geometrias contendo três, quatro e cinco eletrodos foram avaliadas em dispositivos de PT. A configuração ótima foi composta de três eletrodos, espaçados simetricamente. Nesta geometria, um eletrodo é utilizado para aplicar o sinal senoidal de excitação e os outros dois são utilizados para capturar o sinal resultante. As dimensões dos eletrodos (largura e espaçamento entre eles) foram otimizados usando ferramentas quimométricas. O complexo avidina-biotina foi utilizado como modelo de ligação para mostrar a aplicabilidade do sistema proposto. Para os microssistemas biomoleculares, os eletrodos (com geometria otimizada) foram fabricados sobre a superfície de uma placa de vidro por fotolitografia, sputtering e lift-off. Os eletrodos de detecção foram isolados com uma camada de óxido de silício com espessura de 50 nm, depositada pelo processo de deposição química em fase de vapor assistida por plasma. A camada de SiO2 foi modificada quimicamente com solução de 3-amino-propil-trietóxi-silano em etanol. Para imobilização covalente de biotina, uma alíquota de 10 ?L de fotobiotina dissolvida em água (0,1 mg/mL) foi adicionada à superfície e exposta a radiação ultravioleta (365 nm, 10 mW/cm2) durante 15 min. A detecção foi realizada aplicando um sinal senoidal, a partir de um gerador de funções, ao eletrodo de excitação registrando o sinal resultante nos dois eletrodos receptores. Para minimizar a captura de ruído elétrico, os experimentos foram realizados em uma gaiola de Faraday. O controle e a aquisição de dados foi feito mediante um software escrito em LabVIEW monitorando os sensorgramas de condutividade em tempo real. Os canais microfluídicos foram fabricados em PDMS por litografia suave e selados irrevesivelmente contra a placa de vidro contendo os eletrodos isolados e modificados quimicamente. As soluções (tampão e amostra) foram manuseadas com auxílio de uma bomba peristáltica ou duas bombas seringas. Soluções contendo tampão e avidina foram introduzidas nos microcanais e as mudanças de conductividade foram monitoradas em função do tempo. As soluções contendo avidina permaneceram em contato com a superfície modificada até o sinal de condutividade atingir um patamar de equilíbrio. Depois disso, solução tampão foi introduzida no microcanal para remover os analitos adsorvidos à superfície. Duas válvulas solenóides foram utilizadas para permitir um controle automático da distribuição das soluções nos microcanais. O limite de detecção obtido para a interação entre avidina e biotina foi de 75 nmol L-1. / The study reported in this thesis shows the application of a capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) for monitoring biomolecular interactions on analytical microsystems. Initially, the analytical performance of the microsystems fabricated in glass, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and polyester-toner (PT) was investigated in order to choose the best material (in terms of fabrication facilities, costs and repeatability) for the biomolecular assays. Among all substrate materials studied, devices fabricated in PT showed suitability for quick experiments, in which the analytical repeatability is not the most important parameter. The devices fabricated in PDMS and sealed against a glass plate presented the best results in terms of repeatability and the analytical performance was similar to that one of glass devices. For this reason, PDMS/glass devices were chosen for showing the goals of this thesis. On the other hand, PT devices were employed to study the geometrical design of the C4D system. The instrumentation for monitoring binding assays was basically composed of two C4D systems, a software written in LabVIEW and a solution pumping system. In order to find the suitable detection cell configuration for this dual-C4D system, designs containing three, four and five electrodes were evaluated on PT devices. The optimal design was composed of three electrodes symmetrically spaced. In this configuration, one electrode is used for applying an excitation sinusoidal wave and the other two for picking up the resulting signal. The dimensions of the electrodes (width and gap) were optimized by chemometric tools. The avidin-biotin complex was used as a binding model for showing the feasibility of the proposed system. For the biomolecular microsystems, electrodes were fabricated on glass surface using photolithographic, sputtering and lift-off processes. Detection electrodes were insulated with a 50-nm silicon oxide layer deposited by plasmaenhanced chemical vapor deposition. The SiO2 layer was functionalized by immersing the cleaned surface in a 3-aminopropyltriethoxy-silane solution in ethanol for 3 h. For biotinylation of the amino-silane layer, 10 ?L of photobiotin dissolved in deionized water (0.1 mg/mL) was dropped on the modified glass surface and exposed to a 365 nm UV radiation at intensity of 10 mW/cm2 for 15 min. Detection was carried out by passing a sinusoidal excitation signal from the function signal generator to the first electrode and picking up the resulting signal at the two receiver electrodes. To reduce electrical noise pickup, all measurements were carried out in a Faraday cage. The data acquisition was obtained in a software written in LabVIEW and the conductivity sensorgrams were recorded in real-time. The microfluidic network was fabricated in PDMS by soft lithography and irreversibly sealed against the electrodes plate. Solutions were handled into microfluidic channels using a peristaltic pump or two syringe pumps. Buffer and avidin-containing solution was injected into the microchannels and conductivity changes were monitored over time. Avidin solutions were allowed to remain in contact with the surface until a stable conductivity had reached equilibrium. Avidin-free buffer solutions were then injected to rinse off non-specifically bound analytes. Two solenoid valves were used to allow an automatic dispensing of the sample/buffer solution into microchannels. The limit of detection found for avidin-biotin system was 75 nmol L-1.