Les phlorotannins, polymères du phloroglucinol, sont des composés phénoliques (CP) uniquement retrouvés chez les algues brunes (Phéophycées). Ces métabolites présentant des activités anti-oxydantes, interviendraient dans la formation de la paroi, mais à ce jour leur voie de biosynthèse reste non élucidée. L'annotation du génome de l'algue brune Ectocarpus, a permis d'identifier des gènes homologues codant pour des enzymes de la biosynthèse des CP chez les plantes terrestres. Une polyketide synthase de type III (PKSIII), a été caractérisée: elle synthétise le phloroglucinol. La recherche d'autres cibles a été poursuivie sur des gènes codant pour des chalcone-isomérases-like (CHIL), ainsi que pour des phénol-sulfotransférases homologues d'enzymes de sulfatation des flavonoïdes. Les CHIL se sont révélées être des fatty acid binding protein (FAP) impliquées dans le métabolisme des acides gras. L'intérêt pour cette nouvelle famille a justifié leur caractérisation biochimique puis fonctionnelle par complémentation de mutants FAP d'Arabidopsis thaliana. L'élucidation progressive des voies de biosynthèse des phlorotannins a servi de base pour étudier les mécanismes de régulation de ce métabolisme chez les Phaeophycées. En combinant des approches intégrées d'expression de gènes cibles, de dosages et de profilages de phlorotannins solubles, nous avons pu montrer que ces composés assurent une protection constitutive chez Fucus vesiculosus en réponse aux UV-B, et que leur métabolisme serait induit très précocement au cours de l'herbivorie. Le développement d'outils moléculaires spécifiques de ces voies métaboliques, ouvre de nouvelles perspectives en écophysiologie et en écologie. / Phlorotannins are polymers of phloroglucinol that are specific phenolic compounds of brown algae (Phaeophyceae). These metabolites present antioxidant activities and are potentially involved in the formation of cell-walls but their biosynthetic pathway is currently uncharacterized. The genome annotation of the brown algae Ectocarpus provided some information about conserved genes which are implicated in the synthesis of phenolics in terrestrial plants. One polyketide synthase of type III (PKSIII) has been successfully characterized: it produces phloroglucinol. The search for other targets has been pursued in brown algae focusing mainly on chalcone isomerase-like (CHI-like) genes, as well as on phenol-sulfotransferases, which are implicated in the sulfation of flavonoids. The characterization of CHIL has revealed their implication in fatty acid binding (FAP). However, the level of interest for this new family has led to their biochemical characterization and to functional studies by complementation of gene in the Arabidopsis thaliana FAP mutant. The progressive elucidation of the phlorotannin biosynthesis pathway has been used in order to discover mechanisms which regulate this metabolism in brown algae. By combining integrated approaches of gene expression profiling with the quantification and profiling of soluble phlorotannins, we have shown that these metabolites ensure the constitutive protection in Fucus vesiculosus against UV-B radiation and could also be induced as a very early response to grazing. The development of specific molecular tools for this metabolic pathway opens some news perspectives in ecophysiological and ecological studies.

Penicillium expansum est un contaminant commun des pomaceae (pommes et poires) causant la pourriture bleue. Ce champignon est le principal responsable de la présence de patuline dans les pommes et ses produits dérivés. Actuellement, la voie de biosynthèse de la patuline n’est que partiellement élucidée et le cluster de gènes correspondant n’est décrit que chez Aspergillus clavatus, champignon tellurique incapable de se développer dans les pommes. La caractérisation moléculaire de la voie de biosynthèse de la patuline est la condition sine qua none à toute étude visant à comprendre la régulation de la biosynthèse de la patuline, mais également à toute action permettant de limiter sa synthèse. C’est pourquoi le premier objectif de cette thèse a été de caractériser le cluster de gènes spécifique de la voie de biosynthèse chez Penicillium expansum. Celui-ci est caractérisé par une taille de 40 kb et contient les 15 mêmes gènes qu’Aspergillus clavatus, les seules différences résidant dans l’organisation et l’orientation des gènes. La caractérisation de la seconde étape de la voie de biosynthèse de la patuline a été ensuite entreprise chez Aspergillus clavatus, organisme modèle. Le gène patG code pour l’acide 6-méthylsalicylique décarboxylase responsable de la conversion de l’acide 6-méthylsalicylique en m-crésol. Pour faire suite au premier objectif, la régulation de la voie de biosynthèse de la patuline a été étudiée. Pour cela, une souche mutante pour le facteur de régulation spécifique à la patuline patL a été généré puis la production de patuline ainsi que l’expression des gènes du cluster analysés. Les résultats de cette étude ont montré que le gène patL joue le rôle d’interrupteur au sein du cluster. L’absence de patL conduit à une extinction totale de l’expression des gènes du cluster et à une abscence de production de patuline par Penicillium expansum. Dans cette même étude, des tests de pathogénicité ont été entrepris sur des pommes de différentes variétés démontrant ainsi que la patuline peut être un facteur de virulence facilitant l’infection de certaines variétés de pommes telles que la Golden Delicious ou la Pink Lady. Enfin, l’influence de la lumière a été évaluée en analysant l’impact de différentes longueurs d’ondes sur la croissance et la production de patuline de Penicillium expansum. Que ce soit in-vitro ou in-vivo, la croissance et la production de patuline sont très affectés par les lumières blanche, bleue et rouge. Favoriser le stockage des pommes sous les lumières blanche, bleue ou rouge plutôt qu’à l’obscurité pourrait devenir un moyen de prévention contre la contamination par Penicillium expansum. En conclusion, cette thèse présente un aspect fondamental avec la caractérisation du cluster de gènes chez Penicillium expansum et la caractérisation de la seconde étape de la voie de biosynthèse de la patuline ; mais aussi un aspect appliqué avec l’utilisation des lumières de différentes couleurs comme méthode de prévention contre Penicillium expansum durant le stockage des pommes. / Penicillium expansum is the common contaminant of apples and the causal agent of blue mold rot. This fungus is the main patulin producer in apple based products. Actually, the patulin biosynthesis is partially elucidates and the gene cluster has been elucidated in Aspergillus clavatus, a telluric fungi unable to grow on apples. The molecular characterization of the patulin biosynthetic pathway is the key step for a better understanding of the mechanisms leading to patulin production and will help to define strategies to reduce its presence in apple products. The first objective of this thesis was the characterization of the patulin gene cluster in Penicillium expansum. The latter includes the same 15 genes as in Aspergillus clavatus but in a different order and orientation. Then, the second step of this biosynthetic pathway has been characterized and the patG gene encode for the 6-methylsalicylic decarboxylase involved in the 6- methylsalicylic acid conversion into m-cresol. The second objective consists of the study of the patulin regulation. For that, a patL mutated strain was generated and the patulin production and the patulin gene cluster expression were assessed. The mutation of this gene results in a down-regulation of the rest of the genes in the cluster associated with a lack of patulin production. Pathogenicity tests on apples revealed that patulin could act as a virulence factor in some apple varieties, like Golden Delicious or Pink Lady. In the last part of this thesis, the influence of different wavelength lights on the growth and the patulin production by Penicillium expansum were assessed in vitro and in vivo. In both cases, growth and patulin production were significantly affected under white, blue and red lights. Consequently, the apple storage under these lights could be a good alternative to the storage in the dark. In conclusion, this thesis presents a fundamental aspect that consist in the characterization of the patulin gene cluster in Penicillium expansum and the characterization of the second step of this pathway. An applied aspect is also provided by the use of the different wavelength lights to prevent the Penicillium expansum contamination during apple storage.

Le Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) est une molécule à fort impact écologique couramment produite par le phytoplancton marin, mais très rarement chez les plantes à fleurs: seulement chez quelques genres (dont Spartina chez les Poacées). Bien que les étapes enzymatiques impliquées dans la voie de biosynthèse du DMSP soient connues chez les spartines, son origine ainsi que les gènes impliqués restent encore à découvrir chez les plantes. Cette étude s’est fixée pour objectif de contribuer à élucider les mécanismes à l’origine de cette fonction chez les spartines. Cette question a été appréhendée à travers différentes approches : biochimique, métabolomique, transcriptomique, génomique comparative et phylogénétique. Les résultats ont montré que la capacité à synthétiser le DMSP a une origine unique au sein du genre Spartina et se serait mise en place il y a 3-10 millions d’années. Cette capacité est intervenue chez l’ancêtre d’un des deux principaux clades (hexaploïde) de spartines, puis a été héritée chez toutes les espèces dérivant de ce clade (hexaploïdes à dodécaploïdes). Les espèces de l’autre clade (tétraploïde) et leurs descendants (quel que soit leur niveau de ploïdie) n’accumulent pas de DMSP. En utilisant les génomes séquencés des espèces de Poacées ainsi que les ressources génomiques et transcriptomiques disponibles chez les spartines, les gènes candidats intervenant dans les 4 étapes de la voie de biosynthèse proposée dans la littérature ont été explorés. L’identification des gènes intervenant dans les deux étapes intermédiaires, supposées spécifiques de la capacité de synthèse du DMSP représente un véritable défi dans la mesure où seules des activités enzymatiques putatives ont été proposées à ce jour (sans connaissance des enzymes spécifiques ni de leur séquence protéique). Nous avons pu identifier une série de gènes candidats pour chacune des deux fonctions concernées (décarboxylase et amine oxydase), comparer leur niveau de transcription entre les espèces DMSP+ et DMSP-, et prédire leur localisation cellulaire. De plus, des analyses d’activités enzymatiques ont permis de formuler de nouvelles hypothèses et pistes de recherches sur l’émergence de cette nouvelle voie de biosynthèse chez les spartines. / Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) is an ecologically important molecule produced by most marine phytoplankton species, but very rarely by flowering plants: only in a few genera (including Spartina in Poaceae). Despite the different enzymatic steps involved in DMSP biosynthesis are well known, the origin of the function and the genes encoding the different enzymes are yet to be discovered. To explore the evolutionary mechanisms involved in the DMSP accumulation in Spartina, we used various approaches, including biochemical analyses, metabolomics, transcriptomics, comparative genomics and phylogenetics. Notably, we demonstrate that the ability to synthesize DMSP evolved once in the Spartina genus, sometimes 3-10 million years ago. This functional innovation occurred following the emergence of the hexaploid clade, and was inherited by all Spartina species deriving from this hexaploid ancestor. Spartina species belonging to the tetraploid clade and their deriving species do not accumulate DMSP (whatever their ploidy level). Using Poaceae sequenced genomes as well as Spartina genomic and transcriptomic resources obtained in our laboratory, candidate genes involved in the four different enzymatic steps of the DMSP biosynthesis pathway were searched. Identifying genes involved in the intermediate (2nd and 3rd) steps that are specific to this pathway was particularly challenging as only putative enzymatic activities have been proposed so far (corresponding protein sequences and genes are unknown). A set of candidate genes potentially involved in these two steps (with decarboxylase and amine oxydase activities) were identified and their transcription levels were compared among DMSP producing (DMSP+) and non-producing (DMSP-) Spartina species. Their putative cellular localization was also predicted. Moreover, enzymatic activity assays open new hypotheses and research perspectives regarding this enigmatic biosynthesis pathway in Spartina.

Le but de ce travail de doctorat est l’étude chimique et biosynthétique de familles d’alcaloïdes guanidiniques d’origine marine provenant d’éponges de Méditerranée.Le travail est divisé en trois parties successives : 1) l’isolement d’alcaloïdes produits par des éponges marines de l’ordre des Poeciloscerida; 2) l’élucidation de la biosynthèse de la crambescine C1 par des études in vivo d’incorporation de précurseurs marqués au 14C; 3) la synthèse biomimétique de la crambescine A2 448 et de dérivés proches.La famille des alcaloïdes guanidiniques cycliques des crambescines est au coeur de la thèse, ces substances naturelles sont produites par l’éponge incrustante Crambe crambe. Ces alcaloïdes ont été découverts dans les années 1990 et ont suscité beaucoup d’intérêt pour leurs propriétés biologiques et écologiques et leurs synthèses totales. Par contre, leur biosynthèse était encore inconnue à ce jour. La seule synthèse biomimétique disponible était basée sur une hypothèse d’origine polyacétique. Les hypothèses récentes de nos groupes ont permis de mettre en avant une origine mixte: la partie cyclique guanidinique proviendrait d’un pyrrolidinium issu de l’arginine et d’un précurseur “céto-acide” proche des acides gras. Sur la base de cette hypothèse, nous avons mis au point une expérience d’incorporation qui a ensuite inspirée une voie de synthèse biomimétique pour l’accès aux crambescines et dérivés. Les premières conclusions quant à l’origine biosynthétique de ces molécules sont les faits les plus marquants de ce travail. Nous apportons une meilleure compréhension de la biochimie des alcaloïdes guanidiniques marins de structures complexes. / This thesis aims at the study of the chemical and biogenetic origin of specialized guanidine-alkaloid metabolites produced by sponges from the Mediterranean Sea.The work is divided into three main parts: 1) isolation of alkaloids produced by sponges of the Poeciloscerida order; 2) biosynthesis of crambescin C1 by in-vivo 14C-feeding experiments with Crambe crambe sponge; 3) biomimetic synthesis of crambescin A2 448 and derivatives. The main focus of the thesis will be the family of cyclic-guanidine alkaloids "crambescins", produced by the red incrusting sponge Crambe crambe.These alkaloids were discovered in the early 90s and despite the large interest on their biological activities, ecological roles, and synthesis, their biosynthesis is still unknown.The only available biomimetic synthesis of crambescins was based on a fully polyketide origin hypothesis. Recently our groups suggested an alternative biosynthetic hypothesis in which the guanidine-core would be originated from a condensation between a guanidinated pyrrolidinium derived from arginine and a beta-keto fatty acid. Based on this hypothesis, we designed a biosynthesis experiment that inspired a biomimetic synthesis route to access the crambescins and derivatives. The insights from these studies are the first experimental conclusions about the biosynthesis of crambescins. Finally, this work leads to a better comprehension of the biochemistry involved in guanidine marine alkaloids of complex structures.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019 / Les apocaroténoïdes volatils sont des composés à l’arôme fruité qui contribuent de façon positive à la flaveur des fruits et à la fragrance des fleurs. La régulation de la production de ces composés dans les plantes est encore peu comprise. Ce projet visait à identifier des gènes clés impliqués dans le sentier de production des apocaroténoïdes, dans le but ultime d’améliorer l’arôme des fruits. Chez les tomates, SlCCD1 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1), malgré sa localisation cytosolique, était considérée comme l’enzyme responsable d’effectuer le clivage oxydatif des caroténoïdes situés dans les plastes afin de libérer des apocaroténoïdes. Cependant, l’étude de lignées de tomates transgéniques et de fleurs de Viola odorata démontre que CCD1 n’est pas une enzyme clé dans la synthèse des apocaroténoïdes chez les fleurs et les fruits et que la présence d’enzymes capables d’accéder aux caroténoïdes est nécessaire. Ces enzymes peuvent être des CCDs localisées dans les plastes, comme VoCCD4 et VoCCD1-like chez V. odorata, ou des lipoxygénases comme TomloxC chez la tomate, capables de co-oxyder les caroténoïdes lors de l’oxydation des acides gras. L’accumulation des caroténoïdes dans les plastes ayant un impact important sur la nature des apocaroténoïdes produits, la synthèse de ces précurseurs a également été étudiée. L’analyse génétique de tomates qui présentent une accumulation anormale du lycopène a mis en évidence l’importance du gène de la phytoène synthase 1 (PSY1) dans le sentier et la façon dont différentes variations structurelles dans ses séquences promotrices et codantes peuvent affecter la couleur des fruits. Le phénotype des cultivars bicolores est notamment causé par une baisse vraisemblable de l’efficacité de la traduction de PSY1 due à une délétion dans sa région 5’UTR, tandis que les cultivars jaunes ry sont le résultat d’une perte de fonction de PSY1 suite à réarrangement complexe en aval du gène. Ces connaissances sur la synthèse des caroténoïdes et des apocaroténoïdes seront utiles afin d’améliorer l’arôme des tomates et de nombreuses autres espèces cultivées. / Volatile apocarotenoids are molecules with a fruity aroma that have a significant impact on the flavor of fruits and the fragrance of flowers. Despite their importance, the regulation of their synthesis in plants in still not fully understood. The main objective of this thesis was to identify key genes involved in the apocarotenoid pathway in order to ultimately improve the aroma of fruits. In tomatoes, SlCCD1 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1), even if localized in cytosol, was considered the enzyme responsible for the oxidative cleavage of plastid-localized carotenoids. Analyses of transgenic tomato lines and Viola odorata flowers demonstrate that CCD1 is not a key enzyme in apocarotenoid synthesis in flowers and fruits, and that plastidial enzymes are associated with the production of apocarotenoid volatiles. In tomato, the lipoxygenase C co-oxidizes carotenoids while performing fatty acid oxidation. In V. odorata flowers, the considerable production of ionones correlates with the high expression of plastid-localized CCDs such as VoCCD4 and VoCCD1-like. Since carotenoid accumulation in plastid has an important impact on the nature of the apocarotenoids produced, our attention was also drawn to their synthesis. Genetic analysis of tomatoes that show unusual lycopene accumulation demonstrated the importance of the phytoene synthase 1 (PSY1) gene in the pathway, and the way different structural variation in its promoter or coding sequences can affect fruits color. Bicolor cultivars phenotype is notably due to a likely decrease of PSY1 translation efficiency caused by a deletion in the PSY1 5’UTR region. Similarly, yellow cultivars are the result of structural variations in the first or last exon of PSY1. This knowledge on carotenoid and apocarotenoid synthesis will be useful in order to improve the flavor of tomatoes and many other cultivated species.

Les travaux effectués impliquent la synthèse totale de molécules organiques d'importance biologique incluant des métabolites secondaires et des composés non naturels. Les recherches subséquentes ont amené au développement d'une nouvelle méthodologie verte pour la synthèse d'hétérocycles oxygénés. Tout d'abord, le développement d'une voie biomimétique pour la synthèse du paracaséolide A est rapporté. Cette synthèse a été effectuée en 4 ou 5 étapes à partir de produis commerciaux passant par la formation de l'akolactone A, un produit naturel envisagé lors de la biosynthèse. Les étapes clés impliquent une réaction d'aldolisation régiocontrôlée et l'oxyfonctionnalisation d'un 2 ‑ silyloxyfurane permettant de générer le précurseur du produit naturel. Ce dernier a été obtenu via la dimérisation par voie de Diels - Alder d'un (E)‑α‑alkylidène‑γ‑hydroxybuténolide suivi d'une épimérisation et d'une cyclodéshydratation. Le s détail s concernant l'état de transition de cette transformation seront abordés permettant une meilleure compréhension de la biosynthèse du métabolite secondaire. De plus, ces travaux ont permis la découverte de trois réactions sans précédent dans la littérature concernant les transformations d'un α‑alkylidènebuténolide en γ‑hydroxybuténolide ou en 2‑silyloxyfuranes, ainsi que l'oxydation aérobie de ce dernier. Le développement d'une méthode verte pour la synthèse des γ‑hydroxybuténolides a été entrepris suite à la découverte de l'oxydation aérobie des 2‑silyloxyfuranes. Les détails de l'optimisation des conditions réactionnelles et l'étendue de cette méthode verte sont rapportés. La réalisation d'expérience de contrôle et l'isolation de produits réactionnelles nous ont conduit s à proposer un mécanisme pour cette transformation. Enfin, l'application de cette méthode a pu être illustrée par la synthèse totale de l'isofugomycine qui fût réalisée efficacement en cinq étapes pour un rendement global de 35%. Par la suite, notre intérêt pour les terpénoïdes polycycliques, et plus précisément la famille des labdanes, nous a conduit s à la synthèse totale unifiée de trois métabolites secondaires, amomaxins A et B et ottensidione. Ces molécules sont caractérisées par la présence d'un carbocycle à neuf membres peu représentés au sein des produits naturels. Ces trois composés ont été obtenus via un précurseur commun, obtenu en 16 étapes à partir du (+) - sclaréolide. Cette synthèse fait intervenir des réactions importantes en chimie organique telles que la fragmentation de Grob/Wharton, la métathèse de fermeture de cycle et bien d'autres. Enfin, l'obtention de l'amomaxin A, la réassignation d'un centre stéréogène pour l'amomaxin B et la confirmation structurelle de ottensidione constitue, à ce jour, la première synthèse iv de ces produits naturels. De plus, l 'analyse de données spectroscopiques d'un labdane nouvellement rapporté dans la littérature est discutée en vue d'une révision de la structure, une comparaison avec le cas de ottensinin offre un appui à cette théorie. Enfin, le dernier projet consiste en l'élaboration d'une synthèse orientée vers la diversité de diols peptidomimétiques non symétriques comme inhibiteurs potentiels de la protéase du syndrome de l'immunodéficience humaine (VIH). La synthèse implique l'utilisation de glycoside comme point de départ avec une addition conjuguée comme étape importante. Elle permet ainsi d'effectuer de la diversification à quatre points de divergences précis dans le but d'établir une librairie de composés pouvant potentiellement être impliqués dans une série de tests biologiques. / The work accomplished concerns primarily the total synthesis of biologically important organic molecules including secondary metabolites and non-natural compounds. Importantly, this research also led to the discovery and development of new methodology for the synthesis of oxygen heterocycles. First, a concise, biomimetic route to paracaseolide A is described. This complex molecule was synthesized in 4 or 5 steps via akolactone A, a natural product itself that is assumed to be an intermediate in the biosynthesis of paracaseolide A. Key steps include (i) regiocontrolled aldol reaction of α–angelica lactone with myristyl aldehyde, (ii) oxyfunctionalization of a 2-silyloxyfuran to generate an (E)–α–alkylidene–γ–hydroxy butenolide, and (iii) Diels-Alder dimerization of the latter and in situ cyclodehydration to provide paracaseolide A. The stereochemical outcome of the Diels-Alder cycloaddition is discussed. In addition, the synthesis allowed the discovery of three unprecedented transformations, notably the conversion of α–alkylidenebutenolides to γ–hydroxybutenolides and 2-silyloxyfurans, and the aerobic oxidation of the latter. In particular, a new, green and practical method was developed for converting 2-silyloxyfurans to γ–hydroxybutenolides using oxygen as oxidant. A mechanism for this autoxidation is proposed, supported by control experiments and the isolation of side products. The utility of this method was demonstrated by a short synthesis of isofugomycin (5 steps, 35% overall yield). Following on from our interest in polycyclic terpenoids, and more precisely the labdane family, we developed a unified route to three structurally novel secondary metabolites, namely, amomaxin A and B and ottensidione. These molecules contain a nine-membered carbocycle which is rarely encountered in Nature. All three targets were assembled from a common precursor, obtained in 16 steps from (+) - sclareolide. The route entailed judicious application of several important reactions, including Grob/Wharton fragmentation and ring closing metathesis (RCM). The synthesis enabled establishment of the correct stereochemistry of amomaxin A, which was misassigned in the original publication. In a related project, we corrected the structure of a new labdane natural product, independently isolated from two Alpinia plants by different research groups, by careful analysis of the reported spectroscopic data and NMR comparison of the chemical shifts with those of ottensinin. vi Finally, we developed a diversity - oriented synthesis of non - symmetric, diol - based peptidomimetics as potential protease inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV). The route begins from a readily available carbohydrate building - block and makes use of conjugated addition as a key step. It allows divergence at four distinct points, thereby generating a library of new, drug-like compounds for biological screening.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Pour le maintien d'une espèce, il est primordial que celle-ci soit capable, à partir des nutriments présents dans le milieu environnant, d'effecmer la biosynthèse du matériel ceUiilaire nécessaire à sa survie. Les micro-organismes par exemple, synthétisent les produits organiques dont ils ont besoin, en uulisant divers processus métaboliques afin de trouver des sources d'énergie alternatives. Cette diversité est observée chez les baaéries photosynthétiques, qui sont capables de convertir la lumière en énergie chimique, favorisant ainsi le processus de fixation de l'azote. Ce processus, qui pennet la biosynthèse de l'azote, est essentiel car l'azote diatomique limite encore la production agricole. C'est pourquoi il est important de trouver différentes méthodes permettant d'améliorer le processus de fixation de l'azote. Afin de perfectionner ce mécanisme biologique, il est nécessaire d'étudier au préalable les facteurs qui limitent et régulent l'activité de la nitrogénase (N2ase), qui est l'enzyme-clé du processus de fixation de l'azote. La N2ase est une métalloenzyme sensible à l'oxygène et constituée de deux composantes qui ont besoin de MgATP2 et nécessite un transporteur d'électrons à bas potentiel rédox. Le transport d'électrons vers la N2ase a été fermement établi chez Klebsiella pneumoniae et chez cette bactérie, le transporteur est une flavodoxine spécifique, NifF. Le mécanisme met en jeu la NifF et une pyruvate flavodoxine oxydoréductase (NifJ), qui résulte en une décarboxylation du pyruvate en CoA + COz (par NifJ) couplée à une réaction de reduction de la NifF. Cependant, ce transport d'électrons ne se résume pas seulement au système NifF/NifJ. En effet, ce système n'est pas utilisé chez tous les diazotrophes. Par exemple, chez Clostridium pasteurianum, le transport d'électrons implique une ferrédoxme. De plus, certains micro-organismes peuvent avoir plusieurs types de ferrédoxines ou des ferrédoxines et une flavodoxine ou encore plusieurs tonnes de flavodoxines. Un exemple est donné par Rhodobacter capsulatus qui possède de nombreux transporteurs d'électrons à bas potentiel rédox, mais dont seulement une de type ferrédoxine, est capable d'acheminer des électrons vers la N2ase in vivo. Le sujet de cette thèse de doctorat est l'identification d'une flavodoxine comme étant un nouveau transporteur d'électrons à bas potentiel rédox, in vivo pour la N2ase chez Rhadsbacter capsalatus. Une combinaison d'approches génétiques, biochimiques, physiologiques et d'études de cinétique de type « stopped-flow », a permis de caractériser ce transporteur. Les études biochimiques ont identifié celui-ci comme étant une flavodoxine (NifF) à longue chaîne hautement homologue à des flavodoxines nif-spécifiques. L'observation de la complémentation d'un mutant nifF de Klebsiella pneumoniae et l'obtention de la séquence nucléotidique de ce dernier ont mis en évidence la présence d'un promoteur de type spécifique. Les études sur la régulation transcriptionnelle de nifF ont confirmé son implication en tant que transporteur d'électrons dans le processus de fixation de l'azote. Par contre, il a été démontré que la transcription du gène de nifF chez Rhodobacter capsalatus est régulée à la fois par le taux intracellulaire d'azote ammoniacal et de fer, contrairement à la transcription de nifF chez Klebsiella pneumoniae. De plus, la ferrédoxine (Fdl) semble jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de nifF, mais le mécanisme d'action reste encore à déterminer. Enfin, les études de cinétiques de type « stopped-flow » permettent d'affirmer que NifF peut remplacer Fdl (le transporteur d'électrons pour la N2ase chez Rhodobacter capsalatus in vivo) comme transporteur d'électrons vers la N2ase. En effet, NifF présente non seulement une interaction spécifique avec la FeP, mais cette interaction est plus forte que celle entre FdJ et FeP. Donc, même si NifF est présente en quantité intracelullaire plus faible que Fdl, elle contribue de façon importante au taux de fixation de l'azote de par sa grande réactivité avec la FeP.

La 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase humaine de type 7 (17β-HSD7) a une double fonction dans la cholestérologénèse et la stéroïdogénèse, et qui est impliquée à la fois dans la formation d’estradiol (E2) à partir de l’estrone (E1), et dans la dégradation de la dihydrotestostérone (DHT) en un œstrogène faible (3β-diol). Cependant, sa fonction dans le cancer du sein dépendant des œstrogènes (positif aux récepteurs oestrogéniques (RE+) n’a pas toujours été claire. L’E2 stimule la croissance des cellules cancéreuses du sein (CCS; cellules MCF-7) via les RE tandis que la DHT a un effet antiprolifératif via le récepteur des androgènes. Mes études in vitro, in vivo et de protéomique, ont apporté les résultats suivants : (1) L’inhibition de la 17β-HSD7 par un inhibiteur spécifique (INH7) dans les CCS a entrainé une baisse de l’E2, une augmentation de la DHT, une interruption du cycle cellulaire et une régulation négative de cette enzyme. De plus, l’INH7 a permis de réduire des tumeurs xénogreffes qui a été accompagnées d’une diminution de l’E2 et une augmentation de la DHT sériques. (2) L’INH7 a modulé des protéines impliquant différents processus biologiques. L’INH7 a supprimé l’expression de la protéine 78 régulée par le glucose (Grp78) et de fait a augmenté l’apoptose des CCS envers le Letrozole, un inhibiteur de l’aromatase. (3) Les interactions entre les CCS et les fibroblastes tumoraux montrent que la 17β-HSD7 était l’enzyme la plus régulée dans les CCS tandis que l’aromatase était l’enzyme les plus régulées dans les fibroblastes. De telles régulations ont mené à une augmentation de la conversion de l’E2 à partir de ses précurseurs, et a ainsi encouragé la prolifération cellulaire des CCS. Si l’augmentation de la prolifération cellulaire est bloquée par le Letrozole des résultats plus significatifs ont été observés par l’INH7 qui bloque la dégradation de la DHT. (4) L’analyse des données intégratives basée sur The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirme l’amplification significative du gène HSD17B7 dans les divers cancers du sein comparé à des tissus mammaires sains. Ainsi, nous pensons que la 17β-HSD7 devrait être une nouvelle cible thérapeutique des cancers RE+ du sein. / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 (17β-HSD7) displays a dual function in cholesterogenesis and steroidogenesis. In steroidogenesis, it is both involved in the formation of the estradiol (E2) from estrone (E1) and in the degradation of dihydroterstosterone (DHT) into weak estrogen 5α-androstane-3β, 17β-diol (3β-diol). However, its function in estrogen dependent breast cancer (estrogen receptor positive, ER+) has been unclear for many years. E2 stimulates breast cancer cells (BCCs, MCF-7 cells) growth via estrogen receptor (ER) whereas DHT displays anti-proliferative effects via androgen receptor (AR). In the present thesis, the function of 17β-HSD7 in ER+ breast cancer was studied with in vitro, in vivo, proteomics and three dimensional (3D) co-culture model and results were described: (1) Inhibition of 17β-HSD7 by its selective inhibitor (INH7) in BCCs induced significant lower E2, higher DHT, cell cycle arresting and negative regulating of the same enzyme. Such inhibition induced significant shrinkage of xenograft tumors accompanied by decreased E2 and elevated DHT in plasma. (2) Inhibition of 17β-HSD7modulated 104 proteins involved in different biological processes. INH7 especially suppresses the expression of glucose regulated protein 78 (GRP78) and consequently enhanced apoptosis of MCF-7 towards aromatase inhibitor. (3) The interactions between BCCs and tumor fibroblast modulate steroidogenic enzymes. 17β-HSD7 was the most modulated enzyme in MCF-7 cells whereas aromatase was the most regulated enzyme in fibroblast (Hs578Bst). Such regulations led to an increasing of E2 conversion from precursors and promoted MCF-7 cells’ proliferation. The increased cell proliferation was blocked by aromatase inhibitor in 3D co-culture system, but more significant results were observed with INH7 which blocked DHT degradation. (4) Integrative data analysis with The Cancer Genome Atlas (TCGA) confirmed the significant amplification of 17β-HSD7 in various breast cancers compared to normal breast tissue. Thus, in the present thesis, 17β-HSD7 was characterized as a novel therapeutic target for estrogen dependent breast cancer in postmenopausal women.

L'étude de la ramification chez le pois, à partir des mutants hyper-ramifiés ramosus (rms) a permis de mettre en évidence l'existence d'une nouvelle famille d'hormones végétales : les strigolactones, inhibant la ramification des plantes à graines. La découverte de cette hormone végétale ouvre de nouvelles pistes de recherche sur la biosynthèse et la perception de cette nouvelle hormone. Nous avons montré le rôle du gène PsBRC1, codant un facteur de transcription de type TCP et homologue du gène TEOSINTE BRANCHED1 du maïs, dans la voie de signalisation des strigolactones. L’étude de ce gène nous a permis d'avoir une meilleure compréhension de l’interaction entre strigolactones et cytokinines dans le contrôle de la ramification, de la dynamique de la levée de dormance des bourgeons axillaires, et d'effectuer les premières études de relations structure-activité des strigolactones sur l’inhibition de la ramification chez le pois.Nous avons étudié et caractérisé d'autres éléments dans la voie de signalisation. Chez le pois, deux mutants, autres que Psbrc1, ne répondent pas à l’application de strigolactones, rms3 et rms4. Le gène RMS4 code pour une protéine à boîte F. Nous nous sommes focalisés ici sur le mutant hyper-ramifié rms3. Nous avons montré que RMS3 est l'homologue du gène D14 du riz, codant pour une protéine de la superfamille des α-β/hydrolases. Ces protéines peuvent avoir une activité enzymatique et ainsi pourraient modifier les strigolactones en un composé actif. Le récepteur des gibbérellines GID1 appartient aussi à cette famille, RMS3 est donc un bon candidat pour être le récepteur des strigolactones. Nous avons utilisé une strigolactone radiomarquée afin d’étudier le métabolisme de l'hormone. Nous avons découvert que la strigolactone synthétique, 3H-GR24 est clivée en un composé inconnu au contact des racines, indépendamment de l'activité de la protéine RMS3. Ce composé de structure inconnue se retrouve aussi dans la sève du xylème alors que 3H-GR24 y est absent.Outre un phénotype hyperbranché les mutants rms présentent une diminution de la taille de leurs entre-nœuds, qui n'est pas due à l’augmentation de la ramification. Nous avons étudié l'origine du nanisme des mutants déficients en strigolactones et affectés dans la réponse à l’hormone. Des approches génétiques et moléculaires ont été utilisées pour tester une interaction possible entre les strigolactones et les gibbérellines. Nous avons montré que les strigolactones régulaient l’élongation des entre-nœuds indépendamment des gibbérellines.Le pois est un excellent modèle en génétique et en physiologie. Avec le développement de nouvelles techniques à l'INRA (TILLING; UNIGENE : ensemble de plus de 40000 séquences exprimées de pois), nous avons pu identifier de nouveaux gènes de biosynthèse des strigolactones chez le pois et obtenir plusieurs nouveaux mutants de pois. Ces mutants seront essentiels pour les futures études du laboratoire et pourront permettre d'identifier de nouveaux intermédiaires dans la biosynthèse et le métabolisme des strigolactones. / The study of shoot branching in pea, using the high branching ramosus (rms) mutants has highlighted the existence of a new family of plant hormones: the strigolactones, inhibiting shoot branching in seed plants. The discovery of this novel plant hormone opens novel research areas in the deciphering of strigolactone biosynthesis and strigolactone perception. We have shown the role of the pea TCP transcription factor, PsBRC1, the homolog of the maize TEOSINTE BRANCHED (TB1) in strigolactone signaling. The PsBRC1 gene was shown to have a role in integrating strigolactone and cytokinin pathways, and allowed to have a better understanding of the dynamics of bud outgrowth, and to perform the first strigolactone Structure-Activity Relationship studies for branching inhibition in pea. We investigated and characterized other elements in the signaling pathway, including the strigolactone receptor. In pea, two mutants, other than Psbrc1, do not respond to the application of strigolactones, rms3 and rms4. The RMS4 gene encodes an F-BOX protein and here we focused on the high branching rms3 pea mutant. We have shown that RMS3 is the homolog of the rice D14 gene encoding a protein of the α-β/hydrolase superfamily. Consequently RMS3 may have an enzymatic activity to modify strigolactone into an active compound. The gibberellin receptor GID1 also belongs to this family, therefore RMS3 is also a good candidate for the strigolactone receptor. We used a radiolabeled synthetic strigolactone, 3H-GR24, to investigate the metabolism of the hormone. We discovered that the synthetic strigolactone, 3H-GR24 is cleaved in an unknown compound in the root media independently of RMS3 activity, compound which is also found in the xylem sap in contrast to 3H-GR24. The rms mutants exhibit not only a high branching phenotype but also a reduced height which is not due to this high branching. We investigated the origin of the dwarfism of strigolactone-deficient and response mutants in pea. Genetic and molecular approaches have been used to test a possible interaction between strigolactones and gibberellins. We have shown that strigolactones regulate stem elongation independently of gibberellin. Pea is a powerful model plant for genetics and physiology. With the development of new facilities at INRA (TILLING; UNIGENE set of more than 40000 expressed sequences), we were able to identify new biosynthesis genes in pea and to obtain several novel pea mutants. These mutants will be essential for future studies of the laboratory in particular to identify new intermediates in strigolactone biosynthesis and metabolism.

Les membranes cellulaires sont des cibles préférentielles de la dégradation induite par les espèces réactives de l’oxygène produites durant la sécheresse et par la stimulation d’activités hydrolytiques. La biosynthèse des lipides des chloroplastes peut être importante pour la tolérance à la sécheresse ainsi que pour la reprise après réhydratation. Dans ce travail nous avons étudié le métabolisme des lipides des membranes chloroplastiques, monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyl-diacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG), phosphatidyl-glycerol (PG), dans le cadre de la sécheresse et de la reprise après la fin de la contrainte hydrique. Dans ce but, nous avons mesuré la teneur des lipides des feuilles, suivi l’incorporation du précurseur 14C-acétate dans les lipides et analysé l’expression des gènes codant les enzymes de biosynthèse des lipides (MGD1, MGD2, DGD1, DGD2, SQD2 et PGP1) durant le stress hydrique et après réhydratation. Afin de mieux comprendre le rapport entre le métabolisme de ces lipides et la tolérance à la sécheresse, nous avons travaillé sur deux cultivars de Vigna unguiculata L. Walp, un tolérant (cv. EPACE) et l’autre sensible (cv. 1183) à la sécheresse. Les séquences complètes des ADNc des gènes VuMGD1, VuMGD2, VuDGD1, VuDGD2, VuSQD2 et VuPGP1 ont été obtenues par le criblage d’une banque d’ADNc de V.unguiculata. Les résultats montrent qu’en condition de stress hydrique le cultivar tolérant, en plus de préserver la teneur en lipides, est capable de stimuler la biosynthèse du DGDG augmentant significativement le rapport DGDG:MGDG de ces membranes. Nous suggérons que le DGDG accumulé en sécheresse est exporté vers les membranes extrachloroplastiques et que cela contribue à la tolérance à la contrainte hydrique. Les effets de la perte d’eau cellulaire sur les membranes ont des conséquences directes sur la capacité des plantes à reprendre après réhydratation. 48 heures après réarrosage, le cv. sensible 1183 n’est pas capable de récupérer en termes de teneurs en galactolipides et incorporation de précurseur. Chez le cv. tolérant, par contre, la teneur en DGDG demeure élevé, même après réhydratation. En conclusion, nos résultats suggèrent l’importance des lipides membranaires dans la tolérance/sensibilité des plantes au déficit hydrique, en particulier la balance entre des classes lipidiques de propriétés physico-chimiques différentes (SQDG versus PG et DGDG versus MGDG) qui pourraient affecter la structure et le fonctionnement des membranes / Membranes are main targets of degradation by reactive oxygen species and hydrolytic activities induced by drought. Chloroplasts lipid biosynthesis, especially galactolipids monogalactosyl-diacylglycerol (MGDG) and digalactosyl-diacylglycerol (DGDG) are important for plant tolerance to water deficit and for recovery after rehydration. In this thesis, we studied the metabolism of the chloroplast membrane lipids, MGDG, DGDG, sulphoquinovosyl-diacylglycerol (SQDG), phosphatidyl-glycerol (PG) under drought and during recovery from drought. Aiming this, we measured leaf lipids content, followed 14Cacétate incorporation and expression of genes coding for chloroplast membrane lipid synthases (MGD1, MGD2, DGD1, DGD2, SQD2 and PGP1) during drought and recovery. In order to better understand the relationship between drought tolerance and lipid metabolism, two cultivars of Vigna unguiculata L. Walp, one drought tolerant (cv. EPACE) the other drought susceptible (cv. 1183) were compared. The cDNA complete sequences for VuMGD1, VuMGD2, VuDGD1, VuDGD2, VuSQD2 and VuPGP1 were obtained from screening of a V.unguiculata cDNA library. The results showed that under water stress conditions, the tolerant cultivar, besides its ability to preserve its lipids pool despites drought, is able to strongly stimulate the DGDG biosynthesis, increasing the DGDG:MGDG ratio in its membranes. We suggest that DGDG accumulated under drought condition, when phosphate is deficient, is exported for extrachloroplastic membranes, and thus contributes to plant drought tolerance. Effects of loss of water on cell membranes have direct consequences on plant capacity to recover from stress. 48 hours after rewatering, the susceptible cv. 1183 was not able to fully recover from a moderate stress in terms of leaf galactolipid content and acetate incorporation into MGDG. In EPACE-1, MGDG leaf content remained unchanged after rehydration and DGDG remained higher than in the control plants. In conclusion, our results highlight the importance of membrane lipids in plant adaptation to water deficit and in their capacity to recover from stress. Of particular importance is the balance between lipid classes with various physico-chemical properties (SQDG versus PG, DGDG versus MGDG), since they most likely have a profound influence on membrane structure and function