Genomas reduzidos de bactérias apresentam-se como complexos sistemas evolutivos, evidenciando diferentes propriedades genômicas de acordo com o nicho ocupado por cada organismo. Em bactérias simbiontes, genomas reduzidos apresentam uma grande estabilidade em relação a rearranjos e taxas mutacionais em comparação com genomas reduzidos de bactérias parasitas. Dentre as espécies parasitas com genoma reduzido, Mycoplasma hyopneumoniae distingue-se por apresentar, em diferentes cepas, genomas com características específicas dentro da classe Mollicutes, incluindo maior taxa mutacional, e freqüência de rearranjos. Através do desenvolvimento de um método quantitativo para avaliar a preferência de disposição preferencial de genes nas fitas senso e anti-senso de genomas de procariotos, foi possível avaliar comparativamente a estrutura genômica de espécies bacterianas em 8 filos de procariotos. Os resultados dessa análise indicam que dentre os genomas analisados as espécies de Mollicutes do grupo hominis são as que possuem a maior desorganização estrutural em relação à colocação preferencial de genes nas fita senso e anti-senso, enquanto que as espécies do grupo pneumoniae apresentam valores intermediários, o que se correlaciona com a maior sintenia observada entre genomas nesse grupo. Uma análise em grande escala de mutações sinônimas e não-sinônimas em 7 grupos de genomas reduzidos indica a ocorrência de evolução positiva em uma série de genes possivelmente relacionados a patogenicidade. Com base em dados comparativos de rearranjos, presença de recombinação, transferência horizontal e elevadas taxas de mutações sinônimas sobre não-sinônimas, um novo modelo de evolução de genomas reduzidos de parasitas foi proposto. No modelo, sugere-se que, ao contrário dos genomas de bactérias simbiontes, a redução genômica em bactérias parasitas caracteriza-se por um processo altamente turbulento, no qual a constante geração de variabilidade é um ponto crítico para o sucesso da estratégia de colonização do hospedeiro. / Reduced genomes present an interesting evolutionary system, showing different genomic properties accordingly their lifestyle as parasites or symbionts. In symbiont bacteria, reduced genomes present a great stability regarding rearrangements and mutational rates comparing with reduced genomes from parasite bacteria. Among these species, the Mycoplasma hyopneumoniae genome distinguish itself by presenting specific characteristics inside the Mollicutes class, including higher mutational and rearrangements rates. Through the development of a quantitative method of gene strand bias, was possible a comparative analysis of 8 bacterial phyla. The results of such analysis indicated that genomes of Mollicutes bacteria from the hominis group possess the most disordered genomes regarding gene position on the leading or lagging chromosome strand, while genomes from bacteria of the pneumoniae group have intermediary values, in agreement with the higher sinteny between the genomes in this group. A large-scale analysis of synonymous and non synonymous mutations in 7 groups of reduced genome bacteria determined positive evolution in several genes related to pathogenicity. Based in comparative data from rearrangements, recombination, horizontal transfer and high synonymous over non-synonymous mutational rates, a new model of evolution for parasite species with reduced genomes is proposed. In this model is suggested that, in opposition with symbionts bacteria, genome reduction of parasite prokaryotes is characterized by a high turbulent process, where the constant variability generation is a critical point for the success of the host colonization.

Cada vez mais a busca por fontes de energia renováveis tem se intensificado. Isto não somente pela preocupação ambiental, mas também devido aos combustíveis fósseis serem limitados. Desta forma, o etanol de segunda geração (bioetanol) tem chamado a atenção por ser uma fonte de energia pouco poluente e que pode ser obtida a partir de resíduos agroindustriais. Resíduos lignocelulósicos agroindustriais, como a casca de arroz, são fontes abundantes e de baixo custo para produção biotecnológica de compostos de alto valor agregado. Esse processo biotecnológico tem o objetivo de promover o aproveitamento completo das frações celulósica (contém hexoses) e hemicelulósica (rica em pentoses) dos resíduos lignocelulósicos, para a obtenção de commodities. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de conversão de hexoses e pentoses pela levedura Spathaspora arborariae, descrita recentemente como boa conversora de pentoses a etanol. Cultivos sobre meio semissintético e hidrolisado de casca de arroz, a 180 rpm e 28oC, foram realizados em agitador orbital utilizando frascos Erlemmeyers, utilizando leveduras fermentadoras de hexoses e pentoses, como Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis e Spathaspora arborariae, respectivamente, em cultivos isolados e em co-cultivo. As cepas testadas isoladamente apresentaram valores de produtividade de etanol (YP/S) entre 0,35 e 0,46 g g-1, enquanto que o rendimento dos co-cultivos variou de 0,30 e 0,77 g g-1 de etanol, sobre ambos os susbstratos. Também foram realizados ensaios em frascos agitados em aerobiose (180 rpm) e anaerobiose (100 rpm) a 28oC utilizando como meio de cultura com diferentes açúcares individualmente (glicose, xilose ou arabinose). O cultivo realizado em anaerobiose, utilizando glicose como substrato foi o que apresentou maior índices de conversão de etanol (Y P/S) 0,26 g g-1. Cultivos foram conduzidos em biorreatores submersos utilizando S. arborariae sobre meio semissintético, contendo glicose e xilose, em condições anaeróbicas (150 rpm), aeróbicas (400 rpm e 2 vvm; 150 rpm e 0,5 vvm) e microaerofilia (180 rpm e 0,33 vvm). O maior rendimento de etanol foi obtido no cultivo anaeróbico com Y P/S=0,52 g g-1. / It is increasing the search for renewable energy sources due to environmental concerns and the possibility of fossil fuels shortage in the near future. Thus, the second generation ethanol (bioethanol) has drawn attention for being a renewable energy source and can be obtained from organic residues. Lignocellulosic agroindustrial residues such as rice hulls are abundant resources and have a low cost for the biotechnological production of compounds of high added value. This biotechnological process aims to promote the full exploitation of the cellulose fractions (containing hexoses) and hemicellulose (rich in pentoses) of lignocellulosic wastes to obtain commodities such as ethanol. This study aimed at studying the capability of the yeast Spathaspora arborariae, recently discovered, of converting hexoses and pentoses into ethanol. Cultures on semi synthetic medium and hydrolyzed rice hull at 180 rpm and 28oC, were performed in shaker, using fermenting yeast hesoxes and pentoses such as Saccharomyces cerevisiae, Candida shehatae, Pichia stipitis and Spathaspora arborariae, either isolated or in co-cultivations. The strains tested alone showed values of ethanol yields (YP/S) between 0.35 and 0.46 g g-1, while the yield of co-cultures varied from 0.30 to 0.77 g g-1 ethanol on both substrates. Experiments were also carried out in shake flasks under aerobic conditions (180 rpm) and anaerobic (100 rpm) at 280C using culture medium with different sugars individually (glucose, xylose, or arabinose). The yeasts cultivated in anaerobic conditions using glucose as substrate showed the highest ethanol yields (YP/S) 0.26 g g-1. Cultures were conducted in submerged bioreactors using S. arborariae on semi-synthetic medium containing glucose and xylose under anaerobic conditions (150 rpm), aerobic (400 rpm and 2 vvm, 150 rpm and 0.5 vvm) and micro-aerobiosis (180 rpm and 0.33 vvm). The highest ethanol yield was obtained in anaerobic cultivation with YP/S = 0.52 g g-1.

156 f. / Submitted by Ana Valéria de Jesus Moura (anavaleria_131@hotmail.com) on 2013-03-22T14:09:21Z No. of bitstreams: 1 TARSIS BARRETO OLIVEIRA - Dissertação.pdf: 608602 bytes, checksum: 5482c81ae0dd02ddad8b66fe73addaae (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Valéria de Jesus Moura(anavaleria_131@hotmail.com) on 2013-03-22T14:09:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TARSIS BARRETO OLIVEIRA - Dissertação.pdf: 608602 bytes, checksum: 5482c81ae0dd02ddad8b66fe73addaae (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-22T14:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TARSIS BARRETO OLIVEIRA - Dissertação.pdf: 608602 bytes, checksum: 5482c81ae0dd02ddad8b66fe73addaae (MD5) Previous issue date: 2007 / O presente trabalho tem como objetivo investigar as possibilidades de patenteamento de seres vivos, bem como seus limites e conseqüências. Indo além, busca-se definir, dentro da atual sistemática das patentes e à luz dos acordos internacionais sobre a matéria, quais as modalidades de seres vivos sujeitas à concessão deste privilégio pelo Direito Brasileiro. A propriedade intelectual na área da Biotecnologia é aqui analisada nos seus contornos jurídicos, éticos e econômicos, no plano dos impactos provocados pelas novas tecnologias sobre o espírito humano, marcados pela exploração econômica de estruturas vivas no fenômeno da “comercialização da vida humana”. Neste contexto, abordam-se os conflitos éticos concomitantes aos novos avanços científicos, em especial na manipulação genética das espécies vivas. Neste esforço elucidativo, examinam-se as disposições normativas nacionais e os acordos internacionais sobre a matéria, o Projeto Genoma, a biopirataria e as tentativas de apropriação do patrimônio genético da humanidade. O trabalho parte da exceção feita pela Lei 9.279/96 (Lei de Propriedade Industrial Brasileira), que, em seu artigo 18, III, admite o patenteamento de seres vivos na modalidade “microorganismos”. Investiga-se, nesse sentido, em uma perspectiva hermenêutico-biológica, todos os seres vivos compreendidos nesta modalidade, analisando-se as mais variadas formas vivas que compõem o Reino Protista, destacando-se, ainda, as possibilidades de patenteamento dos genes, das células humanas e de estruturas vivas mais diferenciadas. Busca-se, assim, encontrar respostas quanto aos limites e conseqüências da concessão de patentes sobre seres vivos, como condição única de delimitação do alcance das práticas científicas no campo da propriedade intelectual em Biotecnologia. / Salvador

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:49:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213754.pdf: 825313 bytes, checksum: 719b942f69b3204102ad0eb0af7086d7 (MD5) / Agaricus brasiliensis (=Agaricus blazei ss. Heinem.), popularmente conhecido no Brasil como Cogumelo Medicinal, Cogumelo do Solâ, é um fungo de cultivo expressivo no país devido às suas propriedades medicinais, evidenciadas em diversos trabalhos científicos, e vem ganhando importância em diversos países, principalmente para uso nutricêutico. Estes produtos são obtidos dos cogumelos, minimamente processados e encapsulados para serem consumidos como suplementos dietéticos. São utilizados principalmente devido ao potencial terapêutico como imunomodulatórios e anti-tumoral. As frutificações de A. brasiliensis são coletadas no Brasil principalmente no estágio imaturo, quando o píleo ainda está fechado, atendendo a padrões morfológicos pré-estabelecidos. No entanto, essas frutificações imaturas ainda não atingiram máxima eficiência da biomassa fúngica, mas é nesse estágio que se obtém maior valor comercial para exportação. As frutificações maduras são geralmente de menor valor comercial, sendo muitas vezes descartadas pelos produtores ou aproveitadas na produção de nutricêuticos. A qualidade desses nutricêuticos é dependente da composição química das frutificações, particularmente em relação ao conteúdo de b-D-glucanas que constituem a parede celular do fungo. No presente estudo, foram utilizadas frutificações de A. brasiliensis (estirpe UFSC 51), coletadas em diferentes estágios de maturação - imaturas SI (píleo fechado), maduras (píleo aberto) com esporos imaturos SII e maduras com esporos maduros SIII, para se avaliar o rendimento e as características estruturais dos polissacarídeos solúveis em água a 100oC antes e após a purificação das b-D-glucanas usando-se cromatografia líquida, identificação por espectrometria (FTIR e RMN de 13C e 1H), peso molecular e teor de proteínas. Identificou-se a presença de um polímero de peso molecular superior a 1.000.000 daltons, e estrutura (1®6)-(1®3)-b-D-glucanas, com baixo teor de proteínas (em média 0,61%), nos três estágios de maturação, porém com aumento do rendimento das b-D-glucanas no estágio SII e de (1®3)-b-D-glucanas nos estágios SII e SIII. Como conseqüência, frutificações maduras de A. brasiliensis que também contêm estas importantes b-D-glucanas devem ser utilizadas na elaboração de produtos nutricêuticos. As b-D-glucanas extraídas e purificadas destas frutificações nos diferentes estágios foram avaliadas quanto à bioatividade, qualitativa e quantitativamente, sobre o processo de vascularização inicial em embriões de galinha (Gallus domesticus). Foram constatados efeitos pró-vasculogênico, com conseqüente aumento do crescimento dos embriões para todos os estágios de maturação, inclusive nas diferentes concentrações testadas para os estágios SI e SII. Estes resultados sugerem que as b-D-glucanas, isoladas das frutificações nos diferentes estágios de maturação interferem positivamente na formação de vasos sanguíneos e que o efeito pode ser mediado pela atividade imunomoduladora. Em conclusão, as frutificações maduras, que também possuem atividade pró-vasculogênica, devem ser incluídas na produção de nutricêuticos propiciando a utilização otimizada da biomassa do cogumelo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249429.pdf: 3363259 bytes, checksum: 38f8dd99b759ea476f6268236b2e2462 (MD5) / Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) de diversos microrganismos possuem importantes papéis na determinação da patogenicidade por modificação do equilíbrio entre fosforilação/defosforilação dentro do hospedeiro. Deste modo, a identificação de substratos das PTPs torna-se um passo essencial para compreensão de seus papéis fisiológicos, e também contribuem para o desenvolvimento de novos fármacos. Neste trabalho, a metodologia de 'mutant substrate-trapping' foi utilizada como ferramenta para identificação de potenciais substratos fisiológicos de PtpA, uma das duas únicas tirosina-fosfatases presentes em Mycobacterium tuberculosis. A mutação do Asp126 no sítio ativo de PtpA converteu uma enzima ativa em um 'mutant substrate-trapping': PtpA-D126A. Ambas as enzimas, ativa/não mutada ('wild-type' - wt) e mutante D126A, foram purificadas e caracterizadas por estudos cinéticos e estruturais. O mutante D126A mostrou ser uma boa ferramenta para 'mutant substrate-trapping', apresentando valor de Km semelhante à proteína ativa, todavia com Vmax reduzido, mantendo os possíveis substratos mais tempo unidos ao seu sítio ativo. Para identificar prováveis substratos de PtpA, ensaios in vitro foram realizados, por incubação de PtpA-D126A com diferentes extratos de macrófagos humanos da linhagem THP-1. Os experimentos foram realizados na escala de Ressonância Plasmônica de Superfície e posteriormente passados a miligramas de proteína. Os complexos PTP-substrato foram isolados por imobilização covalente da PtpA-D126A à resina de agarose e analisados por SDS-PAGE. A identificação por espectrometria de massa dessas proteínas, bem como das proteínas de E. coli co-eluídas com PtpA-D126A durante cromatografias de afinidade e exclusão molecular, revelou alguns possíveis substratos de PtpA. Outros ensaios estão programados para confirmação dos resultados e identificação de substratos fisiológicos da proteína tirosina-fosfatase PtpA de M. tuberculosis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:37:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247981.pdf: 1781469 bytes, checksum: a099ea9e628cb5c63de8bfd3d28635a1 (MD5) / O uso de caudas de afinidade tem facilitado a purificação de proteínas recombinantes para aplicações bioquímicas, terapêuticas e estudos estruturais. A cauda mais comum é a cauda contendo seis-histidinas (His-tag) porque permite a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Em alguns casos, as caudas de tamanhos maiores podem aumentar a solubilidade da proteína de interesse. Em outros, a presença da cauda pode alterar a conformação estrutural da proteína, a atividade, interações proteína-proteína e a formação de cristais com um bom padrão de difração, necessário para elucidar a estrutura tridimensional. Todos esses efeitos negativos reforçam a importância de realizar uma caracterização funcional das proteínas expressas com caudas e que a clivagem das mesmas é de grande utilidade antes de realizar estudos funcionais e estruturais. A protease TEV é uma das mais utilizadas para clivar a cauda de proteínas recombinantes porque ela reconhece uma seqüência de aminoácidos muito específica (EXXYXQ*S/G) (onde X pode ser qualquer resíduo) e é ativa a baixas temperaturas e na presença de inibidores de protease adicionados durante o processo de purificação. A protease TEV é disponível comercialmente na forma solúvel, porém é muito cara. Quando a TEV é utilizada na forma solúvel, ela deve ser separada da proteína de interesse. Esta separação é normalmente realizada por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular, que permite a separação da cauda, da proteína clivada e não clivada. Nos casos em que a proteína de interesse possua uma massa molecular semelhante a protease TEV, são necessárias etapas adicionais de purificação diferentes da gel filtração. Quando um grande número de proteínas é estudada, como nos projetos de genômica estrutural para a cristalização de proteínas, a produção da TEV deve ser contínua nos laboratórios, aumentando o custo do processo de purificação. Neste trabalho, a protease TEV foi produzida e imobilizada em diferentes suportes visando obter um biocatalisador ativo, estável e que possa ser reutilizado em vários processos de clivagem de caudas de histidina de proteínas recombinantes. Para isso, foram utilizadas três estratégias: a primeira pela imobilização no suporte glutaraldeído-agarose (G-agarose) que permite a ligação da TEV pelos grupos e-amino das lisinas. A segunda pela imobilização em tiolsulfinato-agarose (TSI-agarose) pela união da proteína pelos grupos tiol das cisteínas e a última pela imobilização pelos grupos tiol e por outros nucleófilos da superfíce da TEV. O rendimento da purificação das proteínas a partir de 1 litro de cultivo foi de 20 mg para a TEV e 5 mg para o substrato da TEV. A protease TEV imobilizada em TSI-agarose clivou 100% do substrato em 24 h a temperatura ambiente e a imobilizada em G-agarose clivou 50% do substrato nas mesmas condições. A TEV imobilizada em TSI-agarose foi mais estável que a enzima solúvel durante um período de armazenamento de 16 dias a 4°C e pode ser reutilizada em pelo menos cinco ciclos de clivagem.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345764.pdf: 1327591 bytes, checksum: 16526788a991cb47c5948515e0df47a4 (MD5) Previous issue date: 2016 / Surtos de doença de Chagas aguda associados à transmissão pela via oral têm sido reportados no Brasil e em outros países da América do Sul. Contudo, estudos sobre a dinâmica da infecção por via oral ainda são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a interação in vitro e in vivo de linhagens transfectadas de T. cruzi TcI e TcII com plasmídeos pTREXRFP/GFPNeo e pROCKGFPNeo. Para tanto, foram geradas linhagens da cepa SC25 (TcI) e SC96 (TcII) expressando de maneira estável as proteínas fluorescentes RFPe GFP, respectivamente. A cepa Y expressando GFP foi utilizada em ensaios de interação parasito-hospedeiro. Estudos in vitro mostraram que a transfecção não alterou o crescimento e a capacidade de infecção das cepas. Ensaios de co-infecção em células THP-1 mostraram que misturas de parasitos TcI e TcII em diferentes proporções apresentaram níveis de infecção inferiores aos observados para as cepas em infecções isoladas eque uma mesma célula comporta a infecção pelas duas linhagens de parasitos. Triatomíneos infectados isoladamente com cada uma das cepas transfectadas apresentaram taxa de infecção semelhante. Contrariamente, infecções mistas nos insetos mostraram um predomínio de parasitos da linhagem TcII. Em camundongos a infecção pela via oral da cepa TcI não foi capaz de induzir parasitemia sanguínea detectável nos animais. Por outro lado, a cepa YGFP ocasionou parasitemia sanguínea patente e nas inoculações com misturas de TcI e TcII, apenas parasitos TcII foram detectados no sangue e tecidos de animais infectados. O tratamento de tripomastigotas da cepa SC25RFP com pepsina reduziu significativamente sua capacidade de infecção em células THP-1, sugerindo que a passagem pelo ambiente gástrico pode ter interferido negativamente na infecção de camundongos pela via oral. A avaliação histopatológica mostrou que o processo inflamatório na fase aguda foi mais intenso e com presença de parasitismo apenas no tecido cardíaco para a cepa YGFP. Na fase crônica a inflamação foi reduzida e não foram encontrados parasitos visíveis nos tecidos avaliados. Contudo, a PCR revelou a presença de DNA do parasito em todos os tecidos examinados. Os resultados do presente trabalho sugerem que a dinâmica da co-infecção está mais associada às características das cepas de T. cruzi do que a linhagem genética (DTU) à que elas pertencem. Parasitos transfectados expressando genes repórteres distintos pode ser uma ferramenta útil no estudo da dinâmica de infecção mista.<br> / Abstract : Acute Chagas' disease outbreaks associated with oral transmission have been reported in Brazil and other South American countries. However, oral infection dynamics studies are still incipient. The present work aimed to evaluate the in vitro and in vivo interaction of T. cruzi TcI and TcII transfected strains with plasmids pTREXRFP / GFPNeo and pROCKGFPNeo. Transfected SC25 (TcI) and SC96 (TcII) strains were showed stable RFP and GFP fluorescent proteins expression, respectively. Y strain expressing GFP was used in parasite-host interaction assays. In vitro studies showed that transfection did not afected the strains growth. Co-infection assays in THP-1 cells showed that mixtures of TcI and TcII parasites in different proportions had lower levels of infection than those observed for the isolated strains and that the same cell carries infection by the two strains of parasites. Triatomines infected with each transfected strains showed a similar infection rate. In contrast, mixed infections showed a predominance of TcII lineage parasites in the insect gut. In mice, oral infection with TcI strainwas not able to induce detectable blood parasitemia in the animals. On the other hand, the YGFP strain caused patent blood parasitemia and in mixed infections only TcII parasites were detected in blood and tissues of infected mice. Treatment of trypomastigotes of the SC25RFP strain with pepsin significantly reduced their ability to infect THP-1 cells, suggesting that passage through the gastric environment may have interfered with the parasite capacity to infect mice by oral route. The histopathological evaluation showed that inflammatory process was more intense in the acute phase and YGFP parasites were detected only in heart. In the chronic phase inflammation was reduced and no visible parasites were found in the evaluatedt issues. However, PCR revealed parasite DNA in all examined tissues. The present work suggest that co-infection dynamics is more associated with the T. cruzi strain characteristics than the genetic lineage (DTU) to which they belong. Transfected parasites expressing different reporter genes may be a useful tool for the study of mixed infection dynamic.

NOBRE, C. G. Eficácia e segurança de chresta martii (dc.) H. Rob. na hipernocicepção inflamatória da articulação temporomandibular induzida por zymosan em ratos. 2013. 87 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-24T13:01:59Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_canobre.pdf: 1737648 bytes, checksum: 56dd8d497b5f9875fea936edd29570b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-24T15:07:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_canobre.pdf: 1737648 bytes, checksum: 56dd8d497b5f9875fea936edd29570b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T15:07:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_canobre.pdf: 1737648 bytes, checksum: 56dd8d497b5f9875fea936edd29570b2 (MD5) Previous issue date: 2013 / The aim of the present study was to investigate the efficacy and safety of Chresta martii (DC.) H. Rob.(EHA) in the temporomandibular joint arthritis (TMJ) induced by Zymosan in rats by evaluating the possible role of nitric oxide and hemeoxygenase-1 (HO-1). Protocol 1: Male Wistar rats (160-220 g) were pretreated with EHA (100, 200 ou 400 mg/kg; per os) before the intra-articular injection (i.art.) of zymosan (2 mg) in the left TMJ. The Zymosan group (Zy) received saline (per os) 60 min prior to induction of arthritis. The Sham group received saline (i.art.). Indomethacin (5 mg/kg) was used as positive control. Von Frey test was used to evaluate the joint hypernociception (g) at 4 h after injection of Zy. At 6 hours after Zy injection, the animals were euthanized under anesthesia, and collected the joint lavage for total cell count, myeloperoxidase activity (MPO) and joint tissue for histopathological analysis (H&E). In another series of experiments the animals were pretreated with L-NAME (30 mg/kg; i.p.) or ZnPP-IX (3 mg/kg, s.c.). Protocol 2: To evaluate the systemic effects of chronic administration of EHA, Swiss mice (25-30 g) received once a day, 400 mg/kg (per os) for 14 days. Changes in body weight, wet weight of o liver , white blood cell count, biochemical parameters, and behavioral changes were determined. Controls received saline (per os). EHA 400 mg/kg (per os) increased (p < 0.05) joint hypernociception threshold, reduced the cell influx and MPO activity, when compared to Zy. EHA (400 mg/kg) reduced the cell influx in the synovial membranes. The analgesic effect of EHA occured in the presence of L-NAME, but was not observed when administered r ZnPP-IX. EHA (400 mg/kg )for 14 days did not alter the weight change, wet weight of liver. EHA (400 mg/kg did not affect the biochemical and hematological parameters in relation to the saline group. The anti-inflammatory and analgesic effect of EHA is multimodal, which do not act via NO, however depending on the integrity of the paths of HO-1 / Este trabalho teve por objetivo investigar a eficácia e segurança do extrato hidroalcóolico de Chresta martii (DC.) H. Rob.(EHA) na hipernocicepção inflamatória da articulação temporomandibular (ATM) induzida por Zymosan em ratos, avaliando o possível papel do óxido nítrico (NO) e hemeoxigenase-1 (HO-1). Protocolo1: Ratos Wistar machos (160-220 g) foram pré-tratados com EHA (100, 200 ou 400 mg/kg; per os) 60 min antes da injeção (intra-articular (i.art.) de Zymosan (2 mg) na ATM esquerda. O grupo Zymosan (Zy) recebeu salina (per os) 60 min antes da indução da artrite. O grupo Sham recebeu solução salina (i.art.) ; Indometacina (5 mg/ kg) foi usada como controle positivo. Teste do Von Frey foi utilizado para avaliar a hipernocicepção articular (g) na 4ª hora após injeção (i.art.) de Zy. Na 6ª hora após injeção (i.art.) Zy os animais foram eutanasiados, sob anestesia, e coletou-se o lavado sinovial para contagem total de células e dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO) e coletou-se o tecido articular para análise histopatológica (H&E). Em outra série de experimentos os animais foram pré tratados com L-NAME (30 mg/kg; i.p.) e ZnPP-IX (3 mg/kg, s.c.). Protocolo 2: Para avaliar a segurança da administração de EHA camundongos Swiss (25-30 g) receberam diariamente, uma vez ao dia, 400 mg/kg (per os) durante 14 dias. Variação ponderal, peso úmido do fígado, leucograma, parâmetros bioquímicos, e alterações comportamentais foram determinados. Controles receberam solução salina (per os). Resultados EHA (400 mg/kg; per os) aumentou (p < 0.05) o limiar de hipernocicepção articular, reduziu o influxo celular e a atividade de MPO, quando comparado ao grupo Zy. EHA (400 mg/kg; per os) reduziu o influxo celular nas membranas sinoviais. Esses resultados foram similares ao obtido com os compostos testados em ambas as doses. O efeito antinociceptivo de EHA ocorreu na presença de L-NAME, porém não foi observado quando se administrou ou ZnPP-IX. EHA 400 mg/kg durante 14 dias não alterou a variação ponderal, o peso úmido do fígado. EHA 400 mg/kg não modificou os parâmetros bioquímicos e hematológicos .O efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de EHA é multimodal, não atuando pela via do NO, porém dependendo da integridade das vias do HO-1

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-23T03:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 351723.pdf: 4050541 bytes, checksum: a231870e6bd57a030795ca43703aafb3 (MD5) Previous issue date: 2017 / A proteína ISG15 é o produto de um gene estimulado por interferons (IFN) do tipo I. Além de um papel de proteína semelhante à ubiquitina, ela é frequentemente descrita na literatura interagindo com o sistema imune, sendo capaz de regular proteínas que participam de vias de sinalização importantes como a JAK1, ERK1, STAT1 e RIG-I. ISG15 é também importante na resposta a infecções virais. Além dessas atividades intracelulares, ISG15 é secretada sendo capaz de induzir quimiotaxia em neutrófilos, estimular a proliferação de células NK, estimular a atividade citotóxica de monócitos e induzir a produção de IFN? por linfócitos T e células NK. Os mecanismos responsáveis pela capacidade de ISG15 de ativar células e genes imunes são pouco conhecidos, diante disso, buscou-se investigar o papel de citocina dessa proteína e seus potenciais mecanismos de ação. Nessa tese, foi observado que ISG15 é capaz de induzir a produção de IL-10 em monócitos primários de forma dose-dependente. Além disso, utilizando dados de transcriptoma, foi observada uma correlação significativa entre células mielóides, ISG15 e IL-10 e entre células linfóides e IFN?, essa última, corroborando estudos anteriores. Também com o auxílio dos bancos de dados, foi observado que a produção de IL-10 induzida por ISG15 está associada a MAPKs e PI3K em indivíduos saudáveis. Esse dado foi demonstrado com experimentos in vitro. Além disso, demonstrou-se que o eixo ISG15/IL-10 está amplificado em lesões causadas por M. leprae, mas ausente em indivíduos com tuberculose ativa embora ISG15 per se esteja fortemente correlacionada à inflamação e gravidade dessa patogenia. Por último, com a finalidade de identificar um possível receptor de ISG15, ensaios de purificação por afinidade em tandem foram realizados utilizando ISG15 fusionada aos motivos STREP e FLAG e proteínas de membranas de leucócitos totais. A precipitação permitiu identificar alvos de ISG15 já descritos na literatura além de proteínas de membrana que podem atuar como possíveis receptores, porém outros estudos precisam ser realizados para avaliar um potencial mecanismo de sinalização desencadeado por essa ligação. Em conclusão, esse estudo determina a produção de IL-10 como uma nova atividade biológica para ISG15, propõe essa proteína como um marcador de gravidade da para infecções por micobactérias e sugere alvos de ISG15 presentes na superfície de leucócitos humanos que podem atuar como potenciais receptores dessa proteína. / Abstract : In humans, interferon stimulated gene (ISG) 15 deficiency may lead to inflammatory interferonpathies and mycobacterial disease, which has been previously linked to its extracellular cytokine-like activity. Here, a novel role for secreted ISG15 as IL-10 inducer, unique to human primary monocytes, is demonstrated. Moreover, a significant correlation of ISG15-induced monocyte/IL-10 and lymphoid/IFN? expression, which was associated with p38 MAPK and PI3K signalling in healthy volunteers, was found employing targeted in vitro and ex vivo system analysis of novel and established human transcriptomic datasets. In human mycobacterial infections, the ISG15/IL10 axis was amplified in leprosy, whereas ISG15 strongly correlated to inflammation and disease severity in active tuberculosis (TB). The specificity and MAPK/PI3K-dependence of ISG15-induced monocyte IL-10 production was confirmed in vitro using CRISPR/Cas9 knockout and pharmacological inhibitors. In this study, we have also attempted to identify a potential receptor using tandem affinity purification assays with ISG15 fused to STREP-FLAG motifs and membrane proteins from total leukocytes. This assay led to the identification of potential ISG15 receptors but other studies must be carried out to evaluate a signalling mechanism potentially triggered by this binding. In conclusion, this study determines the production of IL-10 as a new biological activity for ISG15, proposes this protein as a marker of severity of mycobacterial infections and suggests new ISG15 targets present on the surface of human leukocytes that can act as potential receptors.

Esta tese abrange questões relacionadas aos discursos de risco presentes nas publicações dos depoimentos de pais e mães em sites de biobancos autólogos que coletam e armazenam células-tronco do cordão umbilical para criopreservação. Para essa tarefa, tenho as seguintes questões: como a racionalidade de risco e sua promessa de garantia biológica no futuro se constituem nos depoimentos dos pais publicados nos sites que comercializam/vendem a coleta e o armazenamento de células-tronco do cordão umbilical? Como tal racionalidade e suas práticas se constituem como uma dimensão educativa, relativa à saúde, nesses sites? Nesse empreendimento, analisei as publicações da Internet de cinco sites de biobancos, que se constituíram como material principal da análise; vou toma-los enquanto um artefato cultural. A partir das discussões de risco e hiperprevenção, noções desenvolvidas nos trabalhos de Luis David Castiel, e de biotecnologias, nos trabalhos de Nikolas Rose, estabeleci as estratégias e categorias de análise da tese, que estão apresentadas em três eixos analíticos. O primeiro aborda a exortação do discurso de risco, em que apresento de que modo a prevenção dos riscos se constitui como elemento mobilizador para aquisição desta biotecnologia, educando pais e mães para a adoção de determinadas práticas de saúde vinculadas à segurança biológica para o futuro. O segundo discute o consumo de biotecnologias, que se apresentam discursivamente nos sites como um futuro de oportunidades para prevenção de riscos e influenciam a constituição de sujeitos de consumo. No terceiro eixo, problematizo as promessas de segurança biológica para o futuro, divulgadas de forma reiterada pelos biobancos, refletindo sobre os discursos que tratam do desejo de, a partir desta biotecnologia, adquirir um tipo de seguro biológico para a saúde no futuro. Será possível observar que os depoimentos extraídos dos sites constituem discursivamente a criopreservação das células-tronco do cordão umbilical como um tipo de “segurança biológica para o futuro”. A discussão dos dados possibilita perceber que os discursos presentes nos depoimentos dos pais e mães são singulares, amplamente marcados pelas pedagogias do risco, e ajudam a compreender como os processos de medicalização e molecularização da vida vão conformando as práticas e reposicionando as famílias em relação aos cuidados de saúde dos filhos, com vistas a evitar riscos de adoecimento no futuro. / This thesis addresses issues related to risk discourses found in testimonies given by parents on websites of autologous biobanks that collect and store stem cells from umbilical cord blood for cryopreservation. Two questions have been posed: How have the risk rationality and its promise of biological guarantee constituted and functioned on websites that trade/sell the collection and storage of umbilical cord blood stem cells? How have such rationality and its practices been constituted as an educative health-related dimension on those websites? The contents of five websites of biobanks have been selected as the main research material; hence, they have been here regarded as cultural artifacts. From the discussions about the notions of risk and hyper-prevention, which have been developed by Luis David Castiel, and also about biotechnologies, as seen by Nikolas Rose, I have established the strategies and categories of analysis, which have been divided into three analytical axes. The first one approaches the exhortation of the risk discourse, in which I have evidenced how risk prevention is a mobilizing element for the acquisition of that biotechnology and teaches parents to adopt certain health care practices linked to future biological security. The second one discusses the consumption of biotechnologies which are both discursively presented in the websites as a future of opportunities for risk prevention and influence the constitution of consumption subjects. In the third axis, I have problematized the promises of future biological security that have been recurrently publicized by the biobanks. I have reflected on discourses that, by considering this biotechnology, address the desire to obtain a certain kind of biological health insurance. It is possible to notice that the testimonies extracted from the websites discursively produce the cryopreservation of umbilical cord blood stem cells as a type of “biological insurance”. Data discussion has enabled me to understand that the discourses found in parents’ testimonies are unique and highly marked by the risk pedagogy, and also help us understand how the processes of medicalization and molecularization of life have shaped some practices and repositioned the families in relation to their children health care aiming at preventing diseases from appearing in the future. / Esta tesis abarca cuestiones relacionadas a los discursos de riesgo presentes en testimonios de padres y madres publicados en sitios web pertenecientes a biobancos autólogos que colectan y almacenan células madre del cordón umbilical para criopreservación. Para esta tarea, tengo las siguientes cuestiones: ¿Cómo la racionalidad de riesgo y su promesa de garantía biológica en el futuro se constituyen y operan en los sitios web que comercializan la colecta y el almacenamiento de éstas células? ¿Cómo tal racionalidad y sus prácticas se constituyen como una dimensión educativa relativa a la salud en estos sitios? En ese emprendimiento, analicé las publicaciones web de cinco páginas de biobancos, que se constituirían en el material principal de análisis; por eso los considero como un artefacto cultural. A partir de las discusiones de riesgo e hiperprevención (nociones desarrolladas en los trabajos de Luis David Castiel), y de biotecnologías (presente en los trabajos de Nikolas Rose), establecí las estrategias y categorías de análisis de la tesis, presentadas en tres ejes analíticos. El primero aborda la exhortación del discurso de riesgo, en el que presento de qué modo la prevención de riesgos se constituye como elemento movilizador para la adquisición de esta biotecnología, educando a padres y madres para la adopción de determinadas prácticas de salud vinculadas a la seguridad biológica para el futuro. El segundo discute el consumo de biotecnologías, que se presentan discursivamente en los sitios web como un futuro de oportunidades para la prevención de riesgos e influencian a la constitución de sujetos de consumo. En el tercer eje, problematizo las promesas de seguridad biológica para el futuro divulgadas de forma reiterada por los biobancos, reflexionando sobre los discursos que tratan el deseo de, a partir de esta biotecnología, adquirir un tipo de seguro biológico para la salud en el futuro. Será posible observar que los testimonios extraídos de los sitios web constituyen discursivamente la criopreservación de células madre como un tipo de “seguridad biológica para el futuro”. La discusión de los datos posibilita percibir que los discursos presentes en las declaraciones de padres y madres son singulares, ampliamente marcados por la pedagogía de riesgo, y ayudan a comprender como los procesos de medicalización y moleculización de la vida van conformando las prácticas y reposicionando a las familias en relación a los cuidados en la salud de los hijos, con vista a evitar riesgos de enfermedades en el futuro.