Orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Maria Del Pilar Taboada Sotomayor / Banca: Gabriela Silva Bisson / Resumo: A lectina vegetal ArtinM, ligante de D-manose, está presente nas sementes da jaca, Artocarpus heterophyllus e possui uma estrutura homotetramérica formada pela associação não covalente de subunidades, sendo que cada subunidade representa um CRD (Carbohydrate Recognition Domain). Por interagir com N-glicanas presente em células de mamíferos, a ArtinM desencadeia diversos processos biológicos, dentre eles a resposta citotóxica sobre células leucêmicas, em especial células NB4 da leucemia promielocitica aguda. Neste trabalho foi estudada a interação ArtinM-NB4 por técnicas piezoeletricas de Microbalança a Cristal de Quartzo (QCM) e eletroquímicas por Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS), para tanto foi desenvolvida uma superfície de reconhecimento capaz de realizar a transdução do evento biológico de interação lectina-carboidrato em elétrico. A superfície de reconhecimento foi formada pela imobilização da lectina ArtinM em superfícies metálicas de Au por meio de uma monocamada auto-organizada, utilizando uma mistura de dois alcanotióis, o ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA), como ancora, e o 6-mercaptoetanol (6-MetOH), como espaçador. As várias concentrações de células NB4 previamente fixadas foram deixadas em contato com a lectina imobilizada no eletrodo para que ocorressem as interações desejadas. Após as medidas terem sido avaliadas utilizando-se QCM e EIS, e aplicando o modelo da isoterma de Langmuir, foi possível determinar as constantes cinéticas e de afinidade. Nas medidas obtidas utilizando a QCM, para além da constante de afinidade aparente, foi possível extrair os parâmetros cinéticos: Ka (constante de associação cinética) = (1,8±1,1)x10-7 mL cel-1, kon (constante de velocidade de associação) = (3,6±1,0)x10-10 mL cel-1s-1 e koff (constante de dissociação) = (20,3±6,6)x10-4 s-1. O valor da constante de afinidade aparente (K') foi de (4,4±0,1)x10-7 mL cel-1 utilizando... / Abstract: ArtinM, a D-mannose-binding lectin from Artocarpus heterophyllus (jackfruit), interacts with N-glycans on cell surface receptors triggering cell migration, degranulation, and cytokine release. Because malignant transformation is often associated with altered expression of cell surface glycans, this work evaluated the interaction of ArtinM with human myelocytic leukemia cells, such as acute promyelocytic leukemia, NB4, by piezoelectric techniques of the Quartz Crystal Microbalance (QCM) and by electrochemical techniques of Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS). It was developed, for both techniques, a surface recognition capable of performing the biological interaction between lectin-cell and transducte them in electric signal. The surface was formed by immobilization of ArtinM in Au metal surfaces by over a self-organized monolayer constructed by a mixture of two alkanothiols, 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) as an anchor, and 6-mercaptoethanol (6- MetOH) as a spacer. Concentrations of NB4 cells, previously fixed with paraformaldeide, were left in contact with the immobilized lectin on electrode. After the interaction measurements evaluated by QCM and EIS, and applying the model of Langmuir isotherm, it was possible to obtained both kinetic and affinity constants. Using QCM, beyond the apparent affinity constant, was possible to extract kinetic parameters Ka (association kinetic constant) = (1.8 ± 1.1) 10-7 cel mL-1, kon (association constant) = (3.6 ± 1.0) x10- 10 mL cel- 1 s- 1 and koff (dissociation constant) = (20.3 ± 6.6) x10- 4 s- 1 . The value of the apparent affinity constant (K') was (4.4 ± 0.1) x10- 7 cel mL- 1 by QCM and (9.9 ± 0.2) x10- 5 mL cel- 1 by EIS, the difference between the values comparing both techniques may be related to different factors such as the use of successive addition of NB4 in EIS comparing the in unitary addition in QCM analysis, variation in surface engineering and distinct saturation range. / Mestre

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: O presente estudo teve como objetivo isolar, cultivar e caracterizar as células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) bovino, obtenção de vesículas extracelulares e meio condicionado do cultivo celular (MC) e avaliação do seu potencial imunomodulador em cultivo de explantes endometriais bovinos. Para isso, as CTM-TA foram coletadas (n=3) de tecido adiposo e sofreram isolamento, processamento e cultivo. As amostras foram submetidas à análise citogenética, imunofenotípica (CD44, CD29, vimentina, CD34 e MHCII), de viabilidade e de diferenciação (adipogênica, osteogênica e condrogênica), e então criopreservadas. Após descongelamento e expansão, o meio condicionado do cultivo celular foi submetido à ultracentrifugações para obtenção das vesículas extracelulares que foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e Western Blot (Alix e CD9). Explantes de endométrios bovinos (n=7) provenientes de abatedouro foram submetidos a cultivo e desafio com LPS (3μg/mL) por 48 horas. Os grupos experimentais foram CN (controle negativo, sem desafio com LPS), CP (controle positivo, apenas desafio com LPS), V (desafio com LPS e adição de vesículas extracelulares) e MC (desafio com LPS e adição de meio condicionado). Avaliou-se secreção de PGF2α e IL-1β por Elisa, morfologia do tecido através de histopatologia, expressão tecidual de Fas-L, TLR-4, PGDH e PGF2α-R por Imunoistoquímica. No cultivo celular das CTM-TA foi obtida uma população celular homogênea e fibroblastóide, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-09-18T14:46:21Z No. of bitstreams: 1 2008_RafaelGianellaMondadori.pdf: 5571322 bytes, checksum: 0abb914927b73636e03ad52aba0bff72 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-06-28T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RafaelGianellaMondadori.pdf: 5571322 bytes, checksum: 0abb914927b73636e03ad52aba0bff72 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-28T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RafaelGianellaMondadori.pdf: 5571322 bytes, checksum: 0abb914927b73636e03ad52aba0bff72 (MD5) Previous issue date: 2008-06 / Os bubalinos apresentam grande potencial para serem utilizados tanto em propriedades com baixa como alta aplicação de tecnologia de produção, por ser uma espécie rústica e que produz principalmente leite com alto valor de mercado. Porém, devido às características inerentes a espécie, a aplicação de biotécnicas da reprodução que visam multiplicar animais de alto valor genético não tem demonstrado bons resultados. Assim sendo, o presente trabalho visou conhecer as características ultra-estruturais do desenvolvimento do gameta feminino da espécie. Para isto foram utilizados ovários e complexos cumulus-oócito (CCOs) de búfalas, devidamente processados para microscopia eletrônica de transmissão e microscopia óptica. Foi observado que os gametas e folículos pré-antrais dos bubalinos são menores que os bovinos e possuem conteúdo lipídico (que se acumula gradativamente) bastante superior a esses. Os bubalinos apresentaram menor número de folículos pré-antrais nos ovários, além disso, houve uma predominância de folículos classificados como primários em detrimento dos primordiais e secundários. Outro fator que pode impactar a aplicação de biotecnologias como a punção folicular, bem como a biosegurança é o fato da zona pelúcida dos oócitos bubalinos ser aparentemente mais frágil e conter mais fendas que a dos bovinos. A maturação citoplasmática dos bubalinos foi caracterizada pela migração de organelas para a região cortical do oócito. Somando-se a essa característica o fato que houve aumento do espaço perivitelínico e a diminuição gradativa do contato entre as células do cumulus oophorus e o oócito conforme a maturação evolui. Por fim, o presente trabalho confirmou que a possível alteração química sofrida pelos lipídeos durante o processo de maturação in vitro ocasiona uma modificação de seu aspecto ultra-estrutural no início do período de maturação. Ressalta-se o fato que também foi comprovado que, com as devidas modificações no sistema de produção in vitro de embriões, é possível obter-se embriões viáveis de búfalas, mesmo na contra estação. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The rusticity and milk production with high market value make possible to Buffalos be bred in low or highly technified production system. On the other way, some species’ inherent characteristics make difficult to apply reproductive biotechniques to multiply animals (mainly females) with high genetic potential. Considering this, the present research established the ultrastructural characteristics of female gamete development. To achieve the objective, buffalo cumulus-oocyte complexes (COCs) and ovaries were properly processed to light and transmission electron microscopy. The buffalo oocyte and preantral follicles were smaller than bovine ones and have higher lipid content (progressive accumulation). The specie also shows a lower number of preantral follicles in the ovaries, as well as, the number of primary is superior to primordial and secondary follicles. Other described factors which affects the application of ovum pick-up technique, other than the biosecurity, is the apparently fragile aspect of zona pellucida and the presence of fissures in its surface. Buffalo oocyte cytoplasmic maturation was characterized by organelle migration to cortical region. In addition, as the maturation progress, the perivetilline space increased in size and it is possible to observe a progressive reduction on granulosa cells and oocyte connections. In conclusion, the present research confirmed that the chemical modifications possibly suffered by oocyte lipids during in vitro maturation period, cause an alteration in its ultrastructural aspect. It is also important to note that is possible, with some modifications on in vitro embryo production systems, to produce buffalo embryo in seasonal anoestrous.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T19:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 264160.pdf: 2865891 bytes, checksum: cb44ee2073dbe211f744f1d28d47c283 (MD5) / A mucosa bucal funciona como um sítio atrativo para a liberação sistêmica de fármacos, que incluem peptídeos e proteínas, em função da sua permeabilidade considerável e por evitar os efeitos hepáticos e intestinais de primeira passagem. A pele representa outra via alternativa, podendo também ser direcionada para efeitos locais ou sistêmicos, com a vantagem de conveniência na administração/aplicação, além de também evitar o metabolismo de primeira passagem. Para a avaliação do potencial destas vias como sítio de liberação de fármacos e para a estimativa de efeitos tóxicos de compostos utilizados no desenvolvimento de formulações, o modelo da câmara de Franz foi selecionado para este propósito. A mucosa esofágica suína tem mostrado ser um substituto útil e prático da mucosa bucal suína nos estudos de permeabilidade ex vivo por oferecer uma maior área de superfície e facilidade no preparo do tecido. Além disto, estes tecidos demonstraram características histológicas similares. Assim, parâmetros de permeabilidade tais como fluxo, tempo de latência e coeficiente de permeabilidade da carbamazepina (CBZ) e do acetonido de triancinolona (AT) foram estimados nestas mucosas, para fins de comparação. Além disto, o efeito do congelamento (-80oC) sobre a permeabilidade ex vivo destes fármacos nas mucosas bucal e esofágica suínas também foi avaliado. Para os estudos de permeação ex vivo, através da pele de orelha de porco, selecionou-se o metil, etil, propil e butilparabeno, tendo em vista os questionamentos recentes sobre a segurança dos mesmos, decorrente das suas absorções sistêmicas. O efeito das interações destes adjuvantes farmacêuticos na permeação cutânea foi avaliado através de delineamento fatorial. As amostras testadas foram veiculadas em soluções e, como meio de dissolução da fase receptora, soluções tampões em presença de solubilizante, geralmente o etanol (estabelecimento da condição sink) foram utilizadas. Métodos analíticos, previamente validados, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, espectrofotometria na região do ultravioleta e eletroforese capilar foram selecionados para a quantificação dos fármacos e adjuvantes. Os resultados indicaram que as mucosas esofágicas suínas poderiam substituir as bucais nos estudos de permeabilidade ex vivo da CBZ, tendo em vista a semelhança estatística (p>0,05; SNK) entre os parâmetros de permeabilidade calculados a partir das cinéticas de permeação da CBZ. Já para o AT, os resultados desta comparação foram estatisticamente diferentes (p<0,05; SNK) e, neste caso, a mucosa esofágica suína não seria recomendada como substituto da mucosa bucal suína. Mesmo que o congelamento não tenha alterado os parâmetros de permeabilidade para a CBZ, observou-se maior retenção deste fármaco em tecidos congelados, provavelmente devido à formação de vacúolos, fato observado durante a avaliação histológica destes tecidos. Para o AT, não foi observada diferença estatística significante (p>0,05; SNK) entre os parâmetros de permeabilidade dos tecidos frescos e congelados. Assim sendo, os tecidos congelados poderiam ser utilizados nas situações em que a avaliação da retenção não é desejada. A ordem de permeação dos parabenos (BP=PP<EP<MP), através da pele de orelha de porco, foi contrária a ordem de lipofilicidade dos mesmos (BP>PP>EP>MP), notando-se maior retenção dos parabenos na epiderme do que na derme, provavelmente pelas diferenças no conteúdo lipídico destas camadas. No delineamento fatorial, efeitos estatisticamente significantes foram observados apenas para as combinações MP e EP, bem como para MP e PP, com redução nos fluxos de permeação e, assim sendo, estas associações seriam recomendadas até a definição de protocolos de segurança mais confiáveis, tendo em vista que efeitos nocivos destes adjuvantes seriam observados quando das suas absorções sistêmicas, conforme literatura. The buccal mucosa serves as an attractive site for the systemic delivery of drugs, including peptides and proteins, because of its considerable permeability and the avoidance of intestinal and hepatic first-pass effects. The skin represent another alternative, can be directed to local or systemic effects, with the advantage of administration convenience, and also it avoid the first-pass metabolism. To assess the potential of these routes as a drugs delivery site and to estimate the toxic effects of compounds used in the formulations development, the model of Franz diffusion cell was selected for this purpose. The porcine esophageal mucosa has been shown be a useful and practical substitute for porcine buccal mucosa ex vivo permeability studies in that it offers a larger surface area and it is much easier to prepare. Further, these tissues demonstrated similar histological characteristics. Thus, permeability parameters such as flux, lag time and permeability coefficient of carbamazepine (CBZ) and triamcinolone acetonide (AT) were estimated in these mucosae, for comparison purposes. In addition, the freezing effect (-80oC) on the ex vivo permeability of these drugs in the porcine buccal and esophageal mucosae was also evaluated. To evaluate the ex vivo permeation through pig ear skin were selected methyl- (EP), ethyl- (EP), propyl- (PP) and butyl- (BP) paraben due the recent questions about safety, resulting from systemic absorption of these parabens. The interactions effect of pharmaceutical adjuvants in skin permeation was assessed by factorial design. The tested samples were incorporated in solutions and as dissolution mean of the receptor phase were used buffer solutions in the solubilising presence, usually ethanol (establishment of sink condition). Analytical methods, previously validated, such as high performance liquid chromatography, UV/Vis spectrophotometry and capillary electrophoresis were selected to the drugs and adjuvants quantification. The results indicated that the esophageal could replace the buccal mucosa in CBZ permeability studies, considering the statistical similarity (p> 0.05, SNK) between the calculated permeability parameters from CBZ diffusion kinetics. For the AT, results of this comparison were statistically different (p <0.05, SNK) and in this case the swine esophageal mucosa would not be recommended as a substitute for porcine buccal mucosa. Although freezing has not changed the CBZ permeability parameters, there was greater drug retention in frozen tissue probably due to the formation of vacuoles, fact shown during the histological evaluation of these tissues. For the AT, there was no significant statistically difference (p> 0.05, SNK) between the permeability parameters of fresh and frozen tissues. Therefore, the frozen tissue could be used when retention evaluation is not required. The parabens permeation order (BP = PP <EP <MP) through the pig ear skin was contrary to the lipophilicity order of these (BP> PP> EP> MP), presenting higher parabens retention in epidermis than dermis, probably due lipid content differences of these layers. In the factorial design, significant statistically effects were shown only for MP and EP as well as MP and PP combinations with reduction in permeation fluxes. In this way, these associations would be recommended until definition of security protocols more reliable, by consider that harmful adverse effects of these adjuvants would be shown when of their systemic absorption, according literature.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T17:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290074.pdf: 1700338 bytes, checksum: 3f59a5b83f2addc78aaeba153141e2ab (MD5) / O presente estudo teve por objetivo avaliar atividade leishmanicida in vitro de chalconas trimetoxiladas contra formas promastigotas de cultura e amastigotas intracelulares de L. braziliensis e L. chagasi em células da linhagem J744-A1 e macrófagos murinos derivados de medula. Além disso, foi realizada a clonagem e a expressão da enzima tripanotiona redutase de L. braziliensis com o objetivo de implementar uma metodologia para avaliação de compostos inibidores desta enzima. Trinta e cinco das 70 chalconas avaliadas mostraram atividade leishmanicida contra formas promastigotas, com CI50 variando de 1,31 a 32,54 µM, e oito destas mostraram índices de seletividade maiores que 20 contra formas promastigotas de L. braziliensis e L. chagasi. Nos ensaios contra formas amastigotas intracelulares de L. braziliensis na linhagem J744-A1, as chalconas M10 e M30 apresentaram CI50 de 0,13 e 0,34 µM, respectivamente, sendo as mais seletivas para o parasito. Em macrófagos murinos infectados a CI50 variou de 2,2 a 6,5 µM para L. braziliensis e de 2,4 a 8,7 µM para L. chagasi. De maneira geral, a espécie dermotrópica mostrou-se mais sensível que a viscerotrópica aos compostos. A expressão da tripanotiona redutase recombinante de L. braziliensis (LbTR) resultou em uma proteína de 53,5kDa. A atividade biológica da enzima foi confirmada pela redução do substrato (tripanotiona) e sua inibição pelos compostos padrão (clomipramina e ácido gálico). Ensaios de inibição in vitro da atividade enzimática com as 8 chalconas ativas mostraram que apenas dois compostos (D08 e M17) foram capazes de inibir moderadamente a atividade da enzima (58% e 63%). As chalconas trimetoxiladas apresentaram um potente efeito leishmanicida in vitro, constituindo-se em moléculas protótipo promissoras para o desenvolvimento de novos agentes leishmanicidas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T14:25:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 240357.pdf: 949085 bytes, checksum: a290070c83642822d8d3f48b81b9f0c1 (MD5) / Proteínas ou peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes essenciais do sistema imune inato e encontram-se amplamente distribuídos entre vertebrados, invertebrados e plantas. São moléculas relativamente pequenas, de caráter anfipático e catiônico, podendo apresentar uma atividade microbicida rápida e potente contra um amplo espectro de microrganismos. Em camarões peneídeos, três classes de PAM foram isoladas e caracterizadas molecular e funcionalmente, a partir de suas células sangüíneas ou hemócitos: peneidinas (PEN), crustinas (CRUS) e os fatores anti-lipopolissacarídeos (ALF). O objetivo desse estudo foi o de detectar, clonar e caracterizar molecularmente seqüências semelhantes a PEN, CRUS e ALF nos hemócitos de três espécies nativas de camarões peneídeos Farfantepenaeus paulensis, F. subtilis e Litopenaeus schmitti, além de elaborar filogramas a partir das seqüências obtidas. Através da utilização de iniciadores desenhados a partir de regiões de consenso de seqüências disponíveis em bancos gênicos públicos, foi possível amplificar fragmentos de cDNA correspondentes às três classes de PAM acima mencionadas nos diferentes peneídeos. Em F. subtilis foi clonada uma seqüência semelhante à PEN do subgrupo 2 denominada de Farsub PEN2-1 (GenBank: EF450742), codificando para um peptídeo maduro de 54 aminoácidos, altamente catiônico e com alta identidade aminoacídica com as PEN2 de F. paulensis (91-93%). Em L. schmitti, mas não nos outros peneídeos, foi possível obter um produto de amplificação correspondendo a uma seqüência de ALF, cujo peptídeo maduro consiste de 98 aminoácidos, com similaridades aminoacídicas de 93 e 95% com F. chinensis e L. vannamei, respectivamente. Esta seqüência, denominada Litsch ALF (GenBank: DQ991357) codifica para uma molécula altamente catiônica e contém, assim como outras seqüências de ALF, uma região anfipática entre dois resíduos conservados de cisteína. Já, seqüências similares a CRUS foram obtidas nas três espécies de peneídeos analisados, sendo denominadas de Farsub CRUS (127 aminoácidos, GenBank: EF450744), Farpau CRUS (150 aminoácidos, GenBank: EF182747) e Litsch CRUS (148 aminoácidos, GenBank: EF182748). As três seqüências codificam para peptídeos contendo uma região N-terminal hidrofóbica rica em resíduos de glicina e uma região C-terminal com doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP. Todas as seqüências de CRUS obtidas apresentaram alta similaridade aminoacídica com as diferentes isoformas de CRUS do camarão L. vannamei (em torno de 85%). Este foi o primeiro relato da presença de ALF e CRUS em camarões peneídeos nativos brasileiros. A PEN já havia sido detectada em F. paulensis e L. schmitti. Atualmente, alguns dos PAM identificados estão em fase de expressão em sistema recombinante, para posteriormente determinar seu espectro de ação frente a diferentes grupos de microrganismos e verificar seu potencial como agente terapêutico em saúde humana, veterinária e aqüicultura. Antimicrobial proteins or peptides (AMP) are major components of the immune system, which are widely distributed among vertebrates, invertebrates and plants. They are small cationic and amphipatic molecules that exhibit a rapid and potent activity against a broad range of microorganisms. In penaeid shrimp, three different classes of AMP have been isolated and molecular and functionally characterized from the blood cells or hemocytes: penaeidins (PEN), crustins (CRUS) and anti-lipopolysaccharide factors (ALF). The main purpose of this study was to detect, clone and molecularly characterize, gene sequences similar to PEN, CRUS and ALF from the hemocytes of the indigenous penaeid shrimp Farfantepenaeus paulensis, F. subtilis and Litopenaeus schmitti and also construct philograms from the obtained sequences It was possible to amplify cDNA sequences of the three AMP classes mentioned above, using primers based on consensus regions of corresponding sequences available at the GenBank. In F. subtilis, a PEN-like sequence, belonging to the subgroup 2, was cloned and named Farsub PEN2-1 (GenBank: EF450742). It coded for a mature peptide composed of 54 amino acids, highly cationic, and exhibited a high amino acidic identity with PEN2 isoforms of F. paulensis (91-93%). In L. schmitti, but not in other penaeids, one amplification product corresponding to an ALF-like sequence was obtained and called Litsch ALF (GenBank: DQ991357). It coded for a mature peptide of 98 amino acids exhibiting 93 and 95% of amino acid similarity with the ALF of F. chinensis and L. vannamei respectively. On the other hand, CRUS-like sequences were obtained in all three penaeid species, and were named Farsub CRUS (127 amino acids, GenBank: EF450744), Farpau CRUS (150 amino acids, GenBank: EF182747) and Litsch CRUS (148 amino acids, GenBank: EF182748). The three CRUS sequences coded for peptides containing a hydrophobic N-terminal sequence rich in glycine residues and a C-terminal sequence with twelve conserved cysteine residues and a WAP domain. All obtained CRUS sequences had amino acid similarity with different isoforms of L. vannamei CRUS (about 85%). This is the first report of ALF and CRUS sequences in indigenous Brazilian penaeid shrimp. PEN sequences were already described in F. paulensis e L. schmitti. Some of the cloned AMP are presently under expression through recombinant system, for further evaluate their antimicrobial activity spectra and their potential use as therapeutic agents for human and veterinary health and also aquaculture.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-23T19:44:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 248379.pdf: 6044909 bytes, checksum: 3ff74fbefc084ae3b89c236795505d7c (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T23:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247673.pdf: 1809341 bytes, checksum: edb7370f822eed4b105da747d3865feb (MD5) / A subfamília de genes MYB R2R3 de plantas é um dos maiores grupos de fatores de transcrição descritos até hoje. Fatores de transcrição MYB R2R3 de Arabidopsis thaliana regulam uma variedade de processos incluindo respostas a fatores ambientais e a via de transdução de sinal do ácido abscísico (ABA). O Óxido Nítrico (NO) pode influenciar a atividade transcricional de uma grande variedade de genes em Arabidopsis e já foi demonstrado estar presente em plantas e envolvido na resposta a diversos tipos de estresse. O objetivo do presente trabalho foi investigar a possibilidade do NO modificar a atividade de ligação ao DNA de AtMYB2, um típico domínio MYB R2R3 de A. thaliana por uma modificação pós-traducional do seu resíduo Cys53 conservado. Nós clonamos, expressamos e purificamos o domínio MYB R2R3, um domínio mínimo ativo que compreende os resíduos 19-125 (M2D). Em ensaios de Retardamento de Migração Eletroforética a proteína M2D se liga à seqüência de DNA 5#-[A]AACC[A]-3#. Os doadores de NO, NPS e SNOG, inibiram a ligação de M2D ao DNA. De acordo com o esperado para o mecanismo de Snitrosilação da cisteína, os efeitos do NO foram revertidos por DTT. A Snitrosilação em M2D foi detectada pelo método de biotinilação. Esses resultados demonstram que a ligação de M2D ao DNA é inibida por Snitrosilação da Cys53 como conseqüência da ação do NO, estabelecendo pela primeira vez uma relação entre o estado redox e a propriedade de ligação ao DNA de um fator de transcrição MYB de plantas.

Orientador: Cecília Laluce / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Resumo: Uma levedura selvagem capaz de produzir etanol a temperaturas acima das toleradas pela levedura Saccharomyces cerevisiae pode ser útil ao processo de produção de etanol durante períodos de elevações da temperatura. Leveduras do gênero Issatchenkia orientalis são encontradas em processos industriais de fabricação de pães e bebidas alcoólicas. Esta levedura é capaz de converter glicose e frutose em etanol a temperaturas tão altas quanto 42°C. O presente trabalho teve como objetivo inicial selecionar as melhores linhagens da levedura I. orientalis quanto a sua capacidade de fermentar melaço de cana-de-açúcar e outras fontes de carbono a temperaturas maiores que 40°C. Um segundo objetivo consistiu em produzir etanol a partir de melaço utilizando a melhor linhagem de I. orientalis em co-cultura com a levedura S. cerevisiae. Para cumprir este propósito foram realizados, inicialmente, ensaios qualitativos de assimilação e fermentação com os isolados de I. orientalis da nossa coleção a 40°C. As linhagens ensaiadas mostraram diferentes características quanto a sua capacidade de assimilação (crescimento em meio sólido) e fermentação de sacarose e melaço (ensaio de Durham), apresentando intensidades variadas de crescimento, morfologias diferentes das células e colônias e formação de película no meio liquido. Estes ensaios qualitativos permitiram selecionar a linhagem 195B de I. orientalis para os estudos de fermentação em batelada simples. Esta linhagem foi capaz de assimilar melaço não hidrolisado, melaço hidrolisado, sacarose, frutose e glicerol a 40°C e de fermentar melaço não hidrolisado na mesma temperatura, além de produzir etanol em meio YPD a pH 2,5 e 40°C com pouca perda de viabilidade. Devido à incapacidade da linhagem 195B em fermentar a sacarose contida no melaço, foi estabelecida uma co-cultura desta linhagem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Some wild yeasts that produce ethanol at temperatures above those usually tolerated by the yeast Saccharomyces cerevisiae may be useful to the ethanol production process during periods of elevated temperatures. Issatchenkia orientalis is yeast found in industrial processes for manufacturing of bread and drinks. This yeast is capable of converting glucose and fructose into ethanol at temperatures as high as 42°C. The initial aim of the present work was the selection of the best strains of I. orientalis capable of fermenting sugarcane molasses and other carbon sources at temperatures above 40°C. A second objective was to produce ethanol from molasses using one of the best strain of I. orientalis in co-culture with a strain of S. cerevisiae. To accomplish these purposes qualitative assays of assimilation and fermentation at 40°C were carried out using the isolates of I. orientalis from our collection. Tested strains showed different characteristics regarding their ability to assimilate (growth on solid medium) and to ferment sucrose and molasses (Durham assay), showing a diversity of growth intensities, differences in cell and colony morphologies and film formation in the liquid media. These qualitative assays allowed us to select the strain 195B of I. orientalis for studies using simple batch fermentations. This strain was able to assimilate non-hydrolyzed molasses, hydrolyzed molasses, sucrose, fructose and glycerol at 40°C and to ferment non-hydrolyzed molasses at the same temperature. Moreover, this strain was able to produce ethanol at pH 2.5 and 40°C in YPD with little loss in viability. Due to the inability of strain 195B to ferment the sucrose present in molasses, a co-culture involving this strain and strain IQAr/45-1 of S. cerevisiae was established. The mixed inoculum (1 part of S. cerevisiae : 3 parts of I. orientalis) allowed to ferment molasses at 42°C with little... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre