As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: As terapias regenerativas com a utilização de células tronco mesenquimais (CTMs) têm sido amplamente empregadas com a finalidade de modificar a progressão de enfermidades locomotoras em animais de grande porte. Estudos sobre o comportamento das células tronco, portanto, mostram-se de extrema importância para que, cada vez mais, elucidar sua ação, efeito e eficácia nos tratamentos propostos. A inserção das CTMs derivadas do tecido adiposo de muares em microcápsulas de hidrogel gera expectativas promissoras para a proteção da célula contra anticorpos do receptor, bem como processos inflamatórios exacerbados, distribuição de agentes terapêuticos e supressão de processos inflamatórios. O presente trabalho teve por objetivo verificar o comportamento das CTMs após o encapsulamento em hidrogel, quanto a sua viabilidade, migração, além da avaliação morfológica e imuno-histoquímica. Avaliação da morfologia da cápsula, dos poros, a rugosidade por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e observação das células encapsuladas pela microscopia confocal de varredura a laser. A porcentagem de células viáveis manteve-se ao longo dos momentos em uma média de 93%, então o biomaterial permitiu a difusão de nutrientes e oxigênio adequadamente. A diminuição da quantidade de células no interior das cápsulas é justificada pela possível migração das mesmas através dos microporos das microcápsulas permitindo a aderência à placa de cultivo. Na avaliação morfológica foi possível identificar as células... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Regenerative therapies using mesenchymal stem cells (MSCs) have been widely widespread to treat locomotor diseases in large animals. Studies on the behavior of stem cells are extremely important to increase our knowledge regarding their action, effect and effectiveness in the proposed treatments. The insertion of muar adipose-derived MSCs into hydrogel microcapsules yields promising expectations for cell protection against immune response, as well as exacerbated inflammatory processes, delivery of therapeutic agents, and suppression of inflammatory processes. The present research aimed to verify the behavior of MSCs after hydrogel encapsulation, including cell viability, migration, morphological and immunohistochemical pattern. Evaluation of capsule morphology, pore size, roughness by scanning electron microscopy (SEM) and observation of encapsulated cells by confocal laser scanning microscopy. The percentage of viable cells remained throughout the moments at an average of 93%, so the biomaterial allowed the diffusion of nutrients and oxygen properly. A decreased amount of cells number inside the capsules is justified by the possible migration of them through the microcapsule micropores allowing adherence to the culture plate. The cells showed positive CD44 staining, absence in MHC II. The capsules were evaluated with SEM for their morphology, the area of circular and irregular pores and the size of the cells. It was possible to confirm the presence of stem cells in the micro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Célia Regina Nogueira / Resumo: O tecido ósseo é extremamente complexo e regulado por fatores sistêmicos e locais, apresentando considerável atividade metabólica que envolve a remoção do osso mineralizado pelos osteoclastos, seguida pela formação da matriz óssea pelos osteoblastos. A associação de triiodotironina (T3) e estrógeno (E2) pode levar a uma resposta complexa à atividade do tecido ósseo sendo que o T3 possui efeito tanto sobre a reabsorção como na formação óssea e o E2, em baixo nível, pode levar a osteoporose e no estado normal garante a supressão de citocinas, a partir do sistema RANKL, OPG e c-Fos, que participam ativamente no remodelamento ósseo. Dessa forma, muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de verificar a ação hormonal sobre o metabolismo ósseo. Entre essas pesquisas, têm sido isoladas células-tronco mesenquimais (CTMs) a partir do tecido adiposo humano e diferenciadas em osteoblastos. Baseado nisso, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o efeito do T3 e E2 nas concentrações infrafisiológica (T3I/ 10-10M e E2I/ 10-9M); fisiológicas (T3F/10-9M e E2F/10-8M) e suprafisiológicas (T3S/10-8M) separadamente e em diferentes associações de T3I (T3I+E2I e T3I+E2F); T3F (T3F+E2I e T3F+E2F) e T3S (T3S+E2I e T3S + E2F) e diferentes associações de E2I (E2I+T3I e E2I+T3F e E2I+T3S); E2F (E2F+T3I e E2F+T3F e E2F+T3S) sobre a expressão gênica e proteica de RANKL, OPG e c-FOS. Quando associados, a maioria desses hormônios aumentou os níveis gênicos da célula estudada. Em c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bone tissue is extremely complex and is regulated by systemic and local factors, presenting a considerable metabolic activity involving the removal of mineralized bone by osteoclasts in balance with the formation of bone matrix by osteoblasts. The association of triiodothyronine (T3) and estrogen (E2) may lead the activity of bone tissue to complex responses, due to T3 effects on both bone formation and reabsorption, and E2 being able to lead to osteoporosis when at low levels, or, at normal levels, maintain the suppression of the cytokines RANKL, OPG, and c-FOS, which take part actively on bone remodeling. To date, many studies have been done to verify hormone actions on bone metabolism. Among them, mesenchymal stem cells (MSC) have been isolated from human adipose tissue and differentiated into osteoblasts. The aim of our study was to evaluate the effect of both T3 and E2 on RANKL, OPG, and c-FOS gene and protein expression, at infra- (T3I, 10-10M; E2I, 10-9M), physiological (T3F, 10-9M; E2F, 10-8M) supra- (T3S, 10-8M) and doses. Cells were treated with hormones separately or in all possible combinations of T3 and E2 doses. The majority of associated treatments increased gene expression levels of all genes. We can state that the doses included in this study, of both hormones, efficiently increase the expression of the analyzed genes, especially when associated. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:11Z : No. of bitstreams: 1 000829196.pdf: 397092 bytes, checksum: ae8c06f67bfaa9d589934981c550dd81 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada... / Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest...

Orientador: Cristina Antoniali Silva / Coorientador: Adalberto Luiz Rosa / Banca: Alberto Carlos Botazzo Delbem / Banca: Márcio Mateus Beloti / Banca: Mário Taba Júnior / Banca: Natália Marcumini Pola / Resumo: A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada... / Abstract: Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest... / Doutor

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: A utilização de terapias celulares no tratamento de lesões musculoesqueléticas cresce mundialmente em larga escala e é cada vez mais aceita. As células tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas e expandidas in vitro, sendo tipicamente obtidas do próprio paciente (autóloga). Contudo, o uso de células provenientes de um animal doador (alogênica) e submetidas ao cultivo e a criopreservação, cria a oportunidade de iniciar o tratamento imediatamente após o diagnóstico. Há evidencias de que as CTMs possuem capacidade de imunomodulação, interagindo com os linfócitos T de diversas maneiras, além de não estimularem a indução de uma resposta imune complexa por não expressarem MHC II. Contudo, ainda há falta de consenso entre os estudos quanto a imunogenicidade das CTMs. Desta forma, o presente estudo objetivou avaliar a segurança da administração das células alogênicas em equinos através da análise de uma possível inflamação decorrente do implante alogênico de CTMs em músculo hígido de equinos, por meio de exame físico, ultrassonográfico, termográfico, histopatológico e pela expressão gênica de IL-1 beta e TNF- alfa. Os resultados demostraram que aplicação de CTM alogênicas é um processo seguro uma vez que não houveram alterações clínicas significativas, contudo uma segunda aplicação de CTM alogênicas de um mesmo doador levou ao aumento significativo da expressão gênica de TNF- alfa, podendo caracterizar uma resposta imune celular mais acentuada. Nossos resultados contribuíram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of cell therapy for treatment of musculoskeletal injuries in horses is increasing in large scale worldwide. The mesenchymal stem cells (MSCs) are easily isolated and expanded in vitro, making them promising for use in clinical trials. Typically, these cells are obtained from the own patient (autologous), however, cell from a donor horse (allogeneic) expanded in vitro and cryopreserved create the opportunity of immediate treatment after diagnosis. There is evidence that MSCs have immunomodulatory capacity by interacting with T lymphocytes in several ways, and do not stimulate a complex immune response for not expressing MHC II. However, there is still a lack of consensus among the studies on the immunogenicity of MSCs. Thus, this study aimed to evaluate the safety of administration of allogeneic mesenchymal stem cells in horses. For such a possible inflammation reaction to the implantation was analysed through physical examination, ultrasound, thermography, histopathology and gene expression of IL 1beta and TNF-alpha. The results showed that the implantation of allogeneic MSCs is a safe process since there were no significant clinical changes in the animals, but a second application of allogeneic MSCs from the same donor led to significant increase in gene expression of TNF-alpha, which can characterize a cellular immune response. Our results contribute to future research on treatment of musculoskeletal injuries in horses using MSCs, by creating banks of cells derived ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: O tendão flexor digital superficial (TFDS) é uma estrutura importante para a espécie equina e para animais de alto desempenho atlético. Atualmente, a medicina regenerativa vem evoluindo de forma significativa no tratamento de diversas enfermidades, no entanto, o entendimento a respeito do comportamento celular quando do transplante de células tronco mesenquimais (CTMs) em tecido hígido ainda não é completamente conhecido. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo a avaliação da resposta inflamatória local após aplicação de células tronco mesenquimais alogênicas derivadas do tecido adiposo (AdCTMs) em tendão equino comparado ao transplante autólogo e ao grupo controle. Para isso, 18 membros torácicos de 9 animais, divididos em três grupos, foram submetidos à aplicação de AdCTMs em tendão hígido, sendo que em Galog os animais receberam aplicação de AdCTMs alogênicas no membro torácico (MT); em Gauto, aplicação de células autólogas no MT e em Gcont aplicou-se o PBS como grupo controle. Esses animais foram avaliados por parâmetros físicos, exames ultrassonográficos e termográficos até o momento da biópsia, que foi realizada uma semana após aplicação das células autólogas e alogênicas para avaliar a possível reação inflamatória aguda, decorrente do implante de células no tecido tendíneo. O transplante alogênico de CTMs não resultou em reação adversa ou inflamatória que comprometesse o uso dessas células, elucidando a sua segurança neste trabalho. O seu comportamento mostrou-se ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The superficial digital flexor tendon (SDFT) is an important structure for the equine species and for high performance animals. Currently, regenerative medicine has evolved significantly in the treatment of several diseases, even though the cellular behavior during the implantation of mesenchymal stem cells in healthy tissue is not completely known, despite the fact that it has been tirelessly studied in the last few years. This study aims to evaluate and compare the local inflammatory response upon injection in equine tendon of either allogeneic and autologous mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AdMSC). For this purpose, 18 forelimbs, 9 animals were submitted to the application of AdMSC in healthy tendon, which were divided into 3 groups: in Galog the animals received application of allogeneic AdMSC in the thoracic member; in Gauto, autologous AdMSC were injected in the thoracic member; in Gcont, PBS was implanted as control group. These animals were evaluated through physical exams, ultrasound, and thermography up until the moment of the biopsy, which was performed a week after the application of AdMSC in order to evaluate the inflammatory response due to the implantation of the cells in the tendinous tissue. Biopsy samples were taken to histopathology and immunohistochemistry in order to evaluate the actions of allogeneic AdMSC. The allogeneic MSCs implantation did not result in adverse or inflammatory reaction which could compromise the use of these cells,... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hussein_Fernanda_M.pdf: 13730743 bytes, checksum: 0ded9b4ee837e3040ae51d3a2c5d6b02 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As células tronco são células indiferenciadas capazes de se auto replicar e de se diferenciar em diversos tipos celulares maduros com funções especializadas. As células tronco de medula óssea são particularmente interessantes por serem células multipotentes, ou seja, geram células de diversos tecidos, são de fácil obtenção através da aspiração da medula óssea femural e eliminam os problemas de rejeição por ser possível realizar transplante autólogo.As células de Schwann são um dos tipos celulares mais importantes do Sistema Nervoso Periférico (SNP). Elas são uma fonte de sinais para a geração e desenvolvimento dos nervos periféricos, da mielinização e, ainda, auxiliam na regeneração axonal no caso de lesões tanto do SNP quanto do SNC. Os estudos enfocando a indução da diferenciação de células progenitoras a tipos celulares específicos desejados estão em seus passos iniciais. Já são conhecidos diversos fatores que favorecem o desenvolvimento de um determinado tipo celular a partir de células progenitoras in vitro. Contudo, permanecem desconhecidos os fatores intrínsecos ao organismo que induzem esse processo. Faz-se necessário portanto que se investigue, ainda in vitro, porém sem manipulações exógenas e mimetizando o microambiente corpóreo, quais fatores endógenos são os responsáveis pela deflagração do processo de diferenciação. Neste sentido, o Meio Condicionado por células de Schwann mostrou exercer efeitos importantes sobre as células mesenquimais de medula óssea, promovendo sua proliferação e possivelmente induzindo o processo de diferenciação nestas células. Ainda, a Eletroforese 2DE comparativa mostrou uma similaridade maior entre CS e CMMO do que com as CMMO cultivadas em MC, indicando que esta última poderia estar sofrendo um processo de diferenciação celular, diferentemente das CS e das CMMO / Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) are capable to differentiate into several cell types. The differentiation depends on culture media molecules signaling. In this study we investigated the effect of Schwann cell conditioned media on BMMSC morphology and molecular phenotype. Schwann cells (SC) were isolated from adult Wistar rats sciatic nerve (Glia, 17: 327-338, 1996) and were cultivated in DMEM plus 10% FBS (D10). Every 48 hours the SC conditioned media (CM) were collected and stored at -80°C. The BMMSC were isolated from adult Wistar rats femur bone marrow (PNAS, 95:3908-3913,1995). BMMSC were maintained in D10. Subsequently, they were cultivated in CM for 7, 14 and 21 days. After 14 days in CM it was detected changes on the BMMSC typical flattened morphology to the SC bipolar morphology. The frequency of these changes increased after 21 days. These changes have been followed by changes on immunoreactivity and S100b protein localization on BMMSC. Before they were cultivated in CM, the BMMSC showed low immunoreactivity to S100b protein on cytoplasm. Culture in CM generated a S100b label gradual increase and it was found in nuclear compartment. Only the nucleous was S100b labeled, after 21 days. On the other hand, the bipolar morphology cells showed cytoplasmatic and nuclear S100b+. These findings agree with Deloume et al. (Mol. Cell. Neurosci. 27:453-465, 2004) about the S100b immunolabelling during the differentiation of glial progenitor cells into oligodendrocytes. Our results suggest that molecules present in CM are capable of inducing phenotypes changes related with the S100b expression and it roles on differentiation of BMMSC into SC. Moreover, 2DE electrophoresis shown a extent similarity between SC and BMMSC. This result suggests that the BMMSC cultivated in CM could be in a differentiation process / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cartarozzi_LucianaPolitti_M.pdf: 5081962 bytes, checksum: 794c493e497a269465a5b035175dfbcb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A regeneração nervosa periférica é um processo complexo dependente do rearranjo e ativação das células de Schwann. O estímulo das células de Schwann pode ser alcançado através do enxerto de células tronco exógenas. Com o intuito de entender a importância do enxerto de células tronco mesenquimais (MSC) no processo regenerativo periférico, utilizamos o modelo de tubulização do nervo isquiático. As próteses tubulares foram preparadas a partir de membranas de poli-caprolactona (PCL) e preenchidas com selante de fibrina (FG), utilizado, neste caso, como substrato para as MSC. A técnica de tubulização foi feita em ratas fêmeas Lewis adultas, divididas em 4 grupos (n = 5 por grupo): normal, PCL (tubo vazio); FG (tubo preenchido com selante de fibrina) e FG+MSC (tubo preenchido com selante de fibrina e enxertado com MSC). Sessenta dias após lesão, os nervos regenerados foram processados para imunoistoquímica e microscopia de luz. A presença de MSC GFP-positivas foi detectada nos nervos dos animais que receberam enxerto de MSC, indicando que a sobrevivência, a longo prazo, das células tronco no tecido. A regeneração axonal, analisada por imunoistoquímica, revelou expressão de elementos básicos do nervo periférico, ou seja, componentes dos axônios e da lâmina basal tiveram a expressão equivalente em todos os grupos experimentais. A organização axonal foi observada através da marcação anti-neurofilamento. A presença das células de Schwann foi analisada através da marcação anti-S100 e o anticorpo anti-colágeno IV foi utilizado para detecção da lâmina basal. A imunomarcação anti-p75NTR, o receptor de baixa afinidade para neurotrofinas, foi utilizada para investigar a reatividade das células de Schwann. A marcação basal deste, em nervos não lesionados, foi aumentada pelo processo regenerativo, sendo estatisticamente maior no grupo FG+MSC (77% em relação ao nervo contralateral; p<0.001). Além disso, houve colocalização de MSC GFP-positivas e imunomarcação anti-BDNF, evidenciando uma possível via de atuação das células sobre o comportamento das células de Schwann. A partir da análise das secções semi-finas dos nervos pudemos avaliar que a área dos nervos regenerados no interior das próteses tubulares foi estatisticamente igual nos diferentes grupos experimentais. Quando quantificamos o número de axônios mielinizados por uma área fixa, o grupo FG+MSC apresentou maior densidade de axônios em relação ao grupo controle (25%, p<0,05). Da mesma maneira, quando analisamos os parâmetros morfométricos nos diferentes grupos experimentais, o grupo FG+MSC apresentou uma tendência a apresentar axônios de maior calibre e bainha de mielina mais espessa, em relação aos demais grupos, sendo que, a EBM, no intervalo de 1,46 a 2,25?m, foi significantemente maior em relação aos grupos PCL e FG (p<0,05). Como consequência, os animais do grupo FG+MSC mostraram recuperação motora significativamente maior na sétima e oitava semana de análise do índice funcional do nervo fibular. Os achados deste estudo mostram que as MSC enxertadas conjuntamente com selante de fibrina influenciam positivamente o processo regenerativo, modulando a reatividade das células de Schwann / Abstract: Peripheral nerve regeneration is a complex process that is dependent on the rearrangement and activation of Schwann Cells (SC). Such stimulation of SCs may be achieved by the use of exogenous stem cells. In order to better understand the importance of mesenchymal stem cell (MSC) grafting in the peripheral regeneration process we have used the model of sciatic nerve tubulization. Tubular prostheses were prepared from polycaprolactone (PCL) membranes and filled with fibrin sealant (FS), which was used as a substrate for the MSC. The technique of tubulization was applied in adult Lewis female rats that were divided into four groups (n = 5 per group): normal, PCL (empty tube), FS (tube filled with fibrin sealant) and FS + MSC (tube filled with fibrin sealant and grafted with MSC). Sixty days after injury, the regenerated nerves were processed for imunohistochemistry and observed under fluorescence microscopy. The presence of GFP positive stem cells was detected in the nerves of the animals that received MSC grafts, indicating the long term survival of such cells. The axonal regeneration process was studied by immunohistochemistry and revealed the presence of the basic elements of the peripheral nerve, namely axons and basal lamina components that were equivalent in all experimental groups. The axonal organization was observed with anti-neurofilament immunostaining. The presence of SCs was analyzed with anti-S100 immunostaining and anti-type IV collagen was used to detect the basal lamina. Anti-p75NTR, the low affinity receptor for neurotrophins, was used to investigate the reactivity of the SCs. A basal positive labeling in uninjured nerves was detected, which was upregulated by the regenerative process, being statistically higher in FS + MSC group (77% relative to uninjured nerve; p<0.001). Moreover there was colocalization between GFP-positive MSC and anti-BNDF immunolabeling, showing a possible pathway that these cells induce the reactivity of SCs. From sciatic nerve semi-thin sections we were able to evaluate that the areas of regenerated nerves were statistically the same in the different experimental groups. When we quantified the number of myelinated axons in 50.000?m2, the FG+MSC group showed higher density of axons when compared with PCL group (25%, p<0,05). In the same way, the analysis of morphometric parameters showed that the FG+MSC group have a tendency to present higher caliber axons and ticker myelin sheath when compared with other groups, being that the myelin sheath thickness, in the interval between 1,46 to 2,25?m, was significantly higher in FG+MSC group when compared to PCL and FG (p<0,05). As the functional result of the findings above, the FG+MSC animals showed higher motor function recovery, analyzed by FFI, at seventh and eighth weeks after lesion. The findings herein show that MSC associated with the FS scaffold improve the regeneration process by positively modulating the reactivity of SCs / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Morgana Rodrigues Guimarães Stabili / Resumo: Curcumin é um composto ativo derivado da planta Curcuma longa que exibe uma variedade de atividades biológicas, potencial anti-inflamatório e imunomodulatório, que pode ser associado ao tratamento de uma série de condições, como doenças inflamatórias intestinais, artrite reumatoide, câncer, diabetes e periodontite. Recentemente, a literatura também tem demonstrado o potencial do composto sobre o reparo ósseo, entretanto, os dados ainda são contraditórios. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da administração tópica do curcumin veiculado em nanopartículas de PLGA sobre a formação/reparo ósseo de defeitos críticos in vivo, e investigar seu potencial biológico in vivo e in vitro. Defeitos ósseos confeccionados na calvária de ratos machos foram preenchidos com solução salina (controle), curcumin nanoparticulado 0,05mg/ml ou veículo utilizado na diluição do composto (nanopartícula vazia) por 7, 14 e 28 dias. A fração de volume ósseo no interior do defeito nos diferentes grupos foram avaliados por microtomografia óssea (μCT); expressão e imunolocalização dos marcadores do turnover tecidual (RANKL, OPG, PCNA e RUNX2) foram investigados por imuno-histoquímica, enquanto as características teciduais do tecido neoformado foram observadas através da análise histológica descritiva e estereometria. In vitro, o potencial do curcumin nanoparticulado em estimular a diferenciação osteogênica de células estromais derivadas da medula óssea (BMSCs) de ratos foi avaliado determinando-se a at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Curcumin is an active compound derived from the Curcuma longa plant that exhibits a variety of biological activities, anti-inflammatory and immunomodulatory potential, which can be associated with the treatment of a number of conditions, such as inflammatory bowel diseases, rheumatoid arthritis, cancer, diabetes and periodontitis. Recently, the literature has also demonstrated the potential of the compound on bone repair, however, the data are still contradictory. The aim of this study is to evaluate the effect of topical administration of curcumin-loaded PLGA nanoparticles on bone formation / repair of critical defects in vivo, and to investigate its biological potential in vivo and in vitro. Bone defects made in the calvaria of rats were filled with saline solution (control), nanoparticulate curcumin 0,05mg/ml, or vehicle used in the dilution of the compound (empty nanoparticle) for 7, 14 and 28 days. The fraction of bone volume within the defect in the different groups was assessed by microcomputed tomography (μCT); expression and immunolocation of tissue turnover markers (RANKL, OPG, PCNA and RUNX2) were investigated by immunohistochemistry, while the tissue characteristics of the newly formed tissue were observed through descriptive histological analysis and stereometry. In vitro, the potential of nanoparticulate curcumin in stimulating osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived stromal cells (BMSCs) was assessed by determining the activity of alkaline phospha... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre