INTRODUÇÃO: Apesar dos primeiros relatos sobre o uso clínico de células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC) sugerirem que esta abordagem seja factível e efetiva na reconstrução de partes moles, não existem na literatura ensaios clínicos randomizados e com inclusão de controles. Assim sendo, foi objetivo deste estudo investigar se um novo protocolo para o isolamento de ADSC e seu uso em conjunto com os enxertos de gordura é de fato capaz de aumentar a sobrevivência destes enxertos. MÉTODOS: Pacientes com microssomia craniofacial (n=18) foram selecionados e randomicamente distribuídos para o grupo EC (com suplementação de ADSC) ou o grupo EE (sem suplementação de ADSC). Para o grupo EC, ADSC imediatamente isoladas a partir de metade do volume lipoaspirado foram utilizadas para o enriquecimento de células progenitoras do enxerto. A quantidade de tecido adiposo transplantado foi determinada pela simetria com o lado não afetado, não sendo realizado qualquer tipo de supercorreção. O número total de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos de gordura foi calculado, e através de citometria de fluxo estas células foram examinadas quanto à presença de marcadores de superfície para células mesenquimais. Tomografia computadorizada foi realizada para avaliar ambas as hemifaces no pré-operatório e no pós-operatório de seis meses. A espessura do revestimento de partes moles em quatro diferentes pontos de referência e o volume das hemifaces foram calculados. Morbidade geral e variáveis transoperatórias foram registradas. RESULTADOS: Para ambos os grupos o volume médio injetado foi de aproximadamente 28 mL. O número médio de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos foi 5,6 x 105 e 9,9 x 105 células por mL de tecido adiposo (p=0,015). Análise de citometria de fluxo revelou que ADSC foram positivas para marcadores de células mesenquimais (>95% para CD 73 e CD 105). No pós-operatório de seis meses, o índice de espessura média nos pontos de 1 a 4 foi de 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), e 1,00 (p=0,04) no grupo EC, e 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), e 0,84 (p=0,59) no grupo EE. Para o grupo EC o volume de gordura mantido após seis meses foi de 84 % e para o grupo EE foi de 51 % (p=0,003). Nenhuma complicação foi detectada. CONCLUSÕES: Estes resultados sugerem que o isolamento e a suplementação de ADSC é efetivo, seguro e superior à lipoenxertia convencional para o aumento de partes moles da face em pacientes portadores de microssomia craniofacial / INTRODUCTION: Although first reports of the clinical use of adipose-derived stromal cells (ADSC) suggest that this approach may be feasible and effective for soft tissue reconstruction, there is a lack of randomized, controlled clinical trials in the literature. Hence, this study aimed to investigate whether a novel protocol for isolation of ADSC and their use in combination with fat tissue could really improve the long-term retention of the grafts. METHODS: Patients with craniofacial microsomia (n=18) were selected and randomly assigned to group EC (with supplementation of ADSC) or group EE (without supplementation of ADSC). For group EC, ADSC freshly isolated from half of the aspirated fat sample were used to enrich for progenitor cells in the graft. Amount of transplanted adipose tissue was determined by trying to obtain symmetry with the unaffected side without any overcorrection. Number of viable cells isolated before and after the supplementation of the grafts was calculated, and these cells were examined for mesenchymal cell surface markers using flow cytometry. Computed tomography was performed to assess both hemifaces preoperatively and at six months postoperatively. Soft tissue thicknesses at four different reference points and the hemifaces volume were calculated. Overall morbidity and surgical variables were recorded. RESULTS: For both groups mean injected volume was 28 mL. Average number of viable cells isolated before and after supplementation of the grafts was 5,6 x 105 and 9,9 x 105 cells per mL of fat tissue (p=0,015). Flow cytometry analysis revealed that the ADSC were positive for mesenchymal cell markers (>95% for CD 73 and CD 105). At six months postoperatively, average thickness ratio at points 1 to 4 was 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), and 1,00 (p=0,04) in group EC, and 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), and 0,84 (p=0,59) in group EE. For group EC surviving fat volume at six months was 84 % and for group EE it was 51 % (p=0,003). No complications were detected. CONCLUSIONS: These results suggest that this strategy for isolation and supplementation of ADSC is effective, safe and superior to conventional lipoinjection for facial recontouring in patients with craniofacial microsomia

Orientador: Ângela Cristina Malheiros Luzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manzini_BrunaMaria_M.pdf: 3170870 bytes, checksum: b4d5fa2d17ceaa12512b21b7a473e3bd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Cirrose e hepatite fulminante ocasionam diminuição severa da função hepática. Recentes avanços em terapia celular podem ser uma alternativa de tratamento. Objetivo desse estudo é analisar se MSCs obtidas de tecido adiposo (TA), sangue de cordão umbilical (SCU) e medula óssea (MO) se diferenciam em hepatócitos funcionais. Materiais e Métodos TA foi obtido de lipoaspiração, SCU do Banco Público de Cordão Umbilical e MO da Unidade de Transplante de Medula Óssea. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi obtido de todos. TA foi submetido à digestão por colagenase, SCU e MO ao gradiente de Ficoll. As células obtidas foram cultivadas (DMEM meio baixa glicose, SFB) por 3 dias. As células aderentes foram tratadas com tripsina e cultivadas com meio acima e na quarta passagem, caracterizadas por citometria de fluxo, microscopia confocal e diferenciadas para linhagem mesoderrmal para confirmação da diferenciação em MSCs. Atividade da enzima Telomerase (TEA) e cariótipo foram realizados. Diferenciação para hepatócitos: 1,0 x103 MSCs foram semeadas em DMEM, HGF, bFGF, nicotinamida (7 dias), quando receberam meio de maturação (oncostatina, dexametasona e ITS) por 36 dias. A hepatogênese foi analisada por morfologia, funcionalidade (detecção da reserva de glicogênio, marcação PAS), absorção de Indocianina Verde e expressão gênica (PCR-TR dos genes albumina (Alb), Alpha- fetoproteina (AFP), tirosina amino-transferase (TAT) e glutamina sintetase (GS) nos dias 9, 18, 25 e 36). Transplantes: MSCs indiferenciadas e diferenciadas em hepatócitos derivadas de TA e MO infundidas em animais, sacrificados no 7° e 15° dias após transplante, para confirmação e avaliação da regeneração hepática por células humanas através de histopatológico. Resultados: MSCs foram obtidas das três fontes. Análises de telomerase e de cariótipo não demonstraram potencial tumorigênico. MSCs adquiriram morfologia cuboide semelhantes a hepatócitos. Análise funcional efetiva, demonstrando armazenamento de glicogênio e absorção de ICG. Expressão de albumina subiu progressivamente (3.7 no dia 9; 10 no dia 25). AFP inicialmente alta (4.5 dia 9; 5.0 no dia 18), diminuindo depois do dia 18 (3.0 dia 25 e 1.5 dia 36). GS aumentou 3 vezes mais durante processo de diferenciação. TAT foi maior que 6.6 (dia 25 e 36). Anatomopatológico dos transplantes demonstrou que apesar de todas as células conseguirem reverter a lesão, MSCs indiferenciadas foram mais efetivas. Conclusões:. Embora MSCs se diferenciaram em hepatócitos funcionais, devido demora em obter MSCs-SC relativa à diferenciação e expansão, talvez medula óssea e tecido adiposo sejam mais efetivos no processo de regeneração hepática utilizando terapia celular com MSCs / Abstract: Introduction: Liver cirrhosis and fulminant hepatites greatly diminishes liver function. Cell therapy could be a new tool for treatment. This study aimed analyze whether mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from adipose tissue (AT), umbilical cord blood (UBC) and bone marrow (BM) could differentiate into functional hepatocytes. Material and Method: Adipocyte tissue (AT) was obtained from lipoaspiration, umbilical cord blood from Umbilical Cord Blood Bank and bone marrow (BM) from BM Transplantation Unit donors. All patients and donors signed free informed consent. AT was submitted to collagenase digestion, UCB and BM to Ficoll gradient. Cells were cultured (DMEM low glucose medium, SFB) for 3 days. Detached adherent cells at passage four were characterized as MSCs by flow cytometry, mesodermal lineages differentiation. Telomerase enzyme activity, karyotype analyses discharged tumorigenicity. Hepatocyte differentiation protocol was: DMEM, HGF, bFGF, nicotinamide for 7 days; addition of maturation medium (oncostatin, dexamethasone and ITS) during 36 days. Hepatogenesis was analyzed by morphology and gene expression (RT-PCR) of albumin, AF, TAT and GS genes on day 9, 18, 25 and 36. Functionality confirmed by glycogen storage detection, indocyanine green( ICG) absorption and animal experiment performed with transplantation of undifferentiated AT and BM MSCs and hepatocyte-like cells derived from AT and BM-MSCs into BALB/NOD mice submitted to fulminant hepatitis by CCl4 intraperitoneal injection. Animals were sacrificed at 7 and 15 days post transplantation to perform anatomohistopathological analyses. Results: All MSCs acquired cuboid form as hepatocyte-like cells, stored glycogen and absorbed ICG demonstrating functionality. Albumin expression gradually increased (3.7 on day 9 , 10 on 25 ). AFP expression was high at the beginning (4.5 day 9 ; 5.0 on day 18 ) , decreasing after day 18 ( 3.0 and 1.5 on day 25 day 36 ). GS expression increased 3 times during the differentiation process. TAT expression was greater than 6.6 on day 25 and 36. Animal experiments showed that undifferentiated MSCs (U-MSCs) and derivate hepatocyte ¿like cells regenerate the injured liver, but in different degrees. U-MSCs promoted better liver regeneration. Conclusion: MSCs differentiated into funcional hepatocytes, U-MSCs promoted better regeneration at animal experiments, and might be a useful tool for regenerative medicine in liver injuries improving cell therapy in this field / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestra em Ciências

Orientador: Karina Gonzales Silvério Ruiz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T13:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albiero_MayraLaino_M.pdf: 1767389 bytes, checksum: 14c8bc6c823503f78c08850abc5ed95b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar se a exposição das células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal (PDLMSCs) ao lipopolissacarídeo da Porphyromonas gingivalis (Pg) e da Escherichia coli (Ec), levaria a alterações biológicas que comprometessem as propriedades relacionadas ao fenótipo mesenquimal indiferenciado. Para testar essa hipótese, inicialmente foi verificado se as cinco populações de células mesenquimais indiferenciadas purificadas para o antígeno de superfície CD105 (células CD105+) expresssavam os receptores Toll-like 2 e 4 (TLR2 e 4). Em seguida, as células foram cultivadas na presença do LPS da Pg e da Ec, e avaliadas quanto a sua viabilidade e proliferação pelo ensaio do MTS, expressão dos genes para citocinas inflamatórias IL-1?, IL-6, IL-8 e TNF-? (técnica do PCRq), imunomarcação para STRO-1 e expressão do gene identificador de pluripotencialidade - Oct-4, e capacidade de diferenciação osteoblástica/cementoblástica através dos ensaios para identificação de nódulos minerais e expressão dos genes para RUNX2, ALP e OCN. Os resultados mostraram que todas as populações celulares apresentaram fenótipo mesenquimal indiferenciado com marcação positiva para STRO-1, além de se mostrarem positivas para os receptores TRL2 e 4. O ensaio de MTS revelou que a exposição às três concentrações de LPS da Pg e da Ec (100 ng, 1 ?g e 10 ?g/ml) não comprometeu a viabilidade celular, mantendo todas as populações de PDLMSCs proliferativas ao longo dos 10 dias de cultivo. Em paralelo, verificou que LPS da Pg não alterou os níveis de RNAm para citocinas estudadas enquanto que, o LPS da Ec promoveu um aumento significativo na expressão de IL-6 e IL-8, quando aplicado nas concentrações de 100 ng e 1 ?g/ml. Adicionalmente, os resultados revelaram que a exposição celular aos LPS bacterianos, ambos na concentração de 1?g/ml, não alterou o fenótipo mesenquimal indiferenciado destas populações, uma vez que a expressão do gene OCT-4 e a marcação positiva para STRO-1 mantiveram-se semelhantes às células do grupo controle. Além disso, as células mantiveram a capacidade de diferenciação em fenótipo osteoblástico/cementoblástico, confirmado pela produção de nódulos minerais (ensaio de vermelho de alizarina) e expressão dos genes para RUNX-2, ALP e OCN semelhante ao grupo controle (células cultivadas em meio osteogênico). Somente foi observado um aumento significativo (p<0,05) na produção de nódulos minerais quando as células foram cultivadas na presença de 1?g/ml do LPS de Ec. Contudo, esse aumento da matriz mineral não está relacionado ao aumento nos níveis de RNAm para os genes relacionados ao fenótipo osteogênico comparado ao grupo controle. Dentro das condições experimentais avaliadas, concluí-se que a exposição das PDLMSCs ao LPS da Porphyromonas gingivalis e da Escherichea coli não alterou as propriedades biológicas destas células, mantendo assim, as características que conferem a estas a condição de mesenquimal indiferenciada / Abstract: The aim of this study was to evaluate if the exposure of mesenchymal stem cells of the periodontal ligament (PDLMSCs) to lipopolysaccharide (LPS) of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Escherichia coli (Ec), would lead to biological changes that compromised the properties related to undifferentiated mesenchymal phenotype. To test this hypothesis, initially it was checked whether the five populations of mesenchymal stem cells purified by surface antigen CD105 (CD105+ cells) expressed the Toll-like receptors 2 and 4 (TRL2 and 4). Then, cells were cultured in the presence of LPS from Pg and Ec, and evaluated for viability and proliferation by the MTS assay, expression of proinflammatory cytokines IL-1?, IL-6, IL-8 and TNF-? (PCRq technique), immunostaining for STRO-1 and OCT-4 gene expression, an identifier of pluripotency, and osteoblast/cementoblastic differentiation capacity through assays to identify minerals nodules, as well as the gene expression of RUNX2, ALP and OCN. All these assays were carried out also in the presence of LPS from Escherichia coli (Ec), which is not considered a periodontal pathogen. The results showed that all cell populations with undifferentiated mesenchymal phenotype had positive staining for STRO-1, and also showed to be positive for the receptors TLR2 and 4. The MTS assay revealed that exposure to the three concentrations of Pg and Ec LPS (100 ng, 1?g and 10?g/ml) did not affect cell viability, keeping all PDLMSCs populations proliferative over 10 days of culture. In parallel, it was found that the LPS Pg did not alter mRNA levels for the cytokines studied, while the Ec LPS caused a significant increase in IL-6 and IL-8, when applied concentrations of 100ng/ml and 1?g/ ml. Additionally, the results revealed that cellular exposure to both LPS in the concentration of 1?g/ml, did not alter the undifferentiated mesenchymal phenotype of these populations, since the expression of gene OCT-4 and positive STRO-1 staining remained similar to cells in the control group. In addition, these cells retained their ability to differentiate into osteoblastic/cementoblastic phenotype confirmed by production of mineral nodules (alizarin red assay) and expression of the genes for RUNX-2, ALP and OCN similar to cells control group (cultured in osteogenic medium only). It was only observed a significant increase (p<0.05) in the production of mineral nodules when cells were cultured in the presence of 1?g/ml Ec LPS. However, this increase in the mineral matrix it is not related to increased levels of mRNA for genes related to osteogenic phenotype compared to the control group. Within the experimental conditions, it can be concluded that exposure of PDLMSCs to LPS of Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli did not alter the biological properties of these cells thereby, maintaining the characteristics that confer to these cells the condition of mesenchymal stem cells / Mestrado / Periodontia / Mestra em Clínica Odontológica

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:08:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Spejo_AlineBarroso_M.pdf: 5889410 bytes, checksum: 655242e3ec4018faf3f968013fd8d36d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Estudos recentes mostram resultados promissores no tratamento de lesões ao sistema nervoso (SN) através do implante de células-tronco, atribuindo essa melhora funcional à produção de fatores tróficos pelas células. Neste trabalho, o efeito neuroprotetor e neurorregenerativo de células-tronco mesenquimais (CTM) de ratos Lewis-EGFP foi investigado após o esmagamento das raízes motoras L4, L5 e L6. Cinco ratas fêmeas Lewis foram utilizadas em cada um dos seguintes grupos: G1 - esmagamento de raízes motoras; G2 - esmagamento de raízes motoras e injeção de DMEM (Meio de Eagle modificado pela Dubelco) na interface da substância branca e cinzenta (funículo lateral); G3 - esmagamento de raízes motoras e injeção de CTM (funículo lateral). Após 4 semanas, a sobrevivência neuronal foi estudada por coloração de Nissl, onde se observou, a partir da contagem neuronal, aumento da sobrevivência no grupo tratado com CTM. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para avaliar a expressão de sinaptofisina, sinapsina, VGLUT1 (Transportador vesicular de glutamato-1) e GAD65 (Glutamato descarboxilase 65KDa). A expressão de sinaptofisina e sinapsina na superfície dos motoneurônios lesionados mostrou uma menor redução de inputs em animais tratados com CTM, sugerindo uma possível redução no processo de eliminação sináptica. Para detectar possíveis mudanças no equilíbrio de inputs excitatórios / inibitórios em aposição ao corpo dos neurônios motores, os anticorpos VGLUT1 (marcador de terminais glutamatérgicos) e GAD 65 (marcador de terminais GABAérgicos) foram utilizados. A redução dos terminais glutamatérgicos foi semelhante em todos os grupos. Enquanto a redução de terminais GABAérgicos ocorreu em maior proporção em G1 e G2, em relação ao grupo tratado com CTM. Os dados indicam que CTM podem proteger os neurônios contra a excitotoxicidade, resultando em menor perda de células. Com sobrevida de 12 semanas após a lesão, a regeneração nervosa foi avaliada através da análise morfológica do nervo isquiático (área do nervo, número e morfometria de fibras mielínicas) e da recuperação da função motora (walking track test). O grupo tratado com DMEM apresentou nervo com menor área e menor número de fibras mielínicas do que o tratado com CTM, porém, o grupo tratado com células obteve resultados semelhantes ao grupo que sofreu apenas esmagamento. A morfometria revelou fibras com menor mielinização nos três grupos lesionados, em comparação ao nervo contralateral à lesão, porém, para os lados ipsilaterais não houve diferença entre os tratamentos. A função motora apresentou-se melhor no grupo tratado com CTM, quando comparada com o tratado com DMEM, mas não em relação ao grupo que sofreu apenas esmagamento. O efeito das CTM na função motora foi agudo, mostrando eficiência de 4 a 6 semanas após a lesão. Assim, as CTM mostraram efeito neuroprotetor e contribuíram para a regeneração, porém a forma de administração dessas células, através de injeção diretamente na medula, apesar de resultar num maior número de células enxertadas, contribuindo com a sobrevivência dos neurônios, mostrou-se um problema quando avaliada a regeneração e função motora dos animais, indicando a necessidade de desenvolvimento de outras formas de administração / Abstract: Recent studies have shown promising results in the treatment of nervous system injuries through stem cells implantation, attributing this functional improvement to the production of trophic factors by these cells. In this study, the neuroprotective and neurorregenerative effects of mesenchymal stem cells (MSC) from Lewis-EGFP mice was investigated after crushing the motor roots L4, L5 and L6. Five female rats Lewis were used in each of the following groups: G1 - motor roots crushing; G2 - motor roots crushing and DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium) injection in the white/gray matter interface; G3 - motor roots crushing and MSC injection in the white/gray matter interface. At 4 weeks after injury, neuronal survival was evaluated by Nissl staining, and revealed, by the neuronal count, increased survival in the group treated with MSC. The technique of immunohistochemistry was used to evaluate the expression of synaptophysin, synapsin, VGLUT1 (Vesicular Glutamate Transporter-1) and GAD65 (Glutamate decarboxylase 65). The expression of synaptophysin and synapsin on the surface of lesioned motoneurons, showed a smaller decrease of inputs in animals treated with MSC, suggesting a possible reduction in synaptic elimination process. To detect possible changes in the balance of excitatory / inhibitory inputs reaching the cell body of the motoneurons, antibodies for VGLUT1 (marker of glutamatergic terminals) and GAD 65 (marker of GABAergic terminals) were used. The reduction of glutamatergic terminals was similar in all groups. While the reduction of GABAergic terminals was in greater extent in G1 and G2 with respect to the group treated with MSC. The data indicate that MSC can protect neurons against excitotoxicity, resulting in decreased cell loss. With survival of 12 weeks after the injury, nerve regeneration was assessed by morphological analysis of the sciatic nerve (nerve size, number and morphology of myelinated fibers) and motor function recovery (walking track test). The group treated with DMEM showed nerve with smaller area and fewer myelinated fibers than treated with MSC, however, the group treated with cells was not better than the group that only suffered crushing. Morphometry revealed fibers with less myelination in the three injured groups, compared to the contralateral side, but there was no difference between treatments. Motor function appeared better in MSC-treated group in comparison to the DMEM-treated, but not in relation to the group which only suffered crushing. The effect of MSC in motor function was acute, demonstrating efficiency between 4 to 6 weeks after injury. Thus, the MSC shown to be neuroprotective and contributed to regeneration, but the form of administration of such cells, by direct injection into spinal cord, has to be improved or substituted by another method / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:54:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rego_PedroBordeaux_M.pdf: 28298145 bytes, checksum: 9790de4962b1c92e7ba928179c03b67a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A lesão cartilaginosa é um problema significante e crescente na área da saúde pública. A terapia com células-tronco adultas têm sido uma alternativa promissora e têm despertado muito interesse dos pesquisadores. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo são caracterizadas por serem uma população homogênea com morfologia fibroblástica, aderentes e com grande capacidade de proliferação, apresentarem positividade para marcadores celulares CD90+, CD105+, CD29+e CD73+ e por possuírem a capacidade de diferenciação em linhagens mesodérmicas tais como linhagem osteogênica condrogênica e adipogênica. Além da escolha da fonte celular é necessária a utilização de um biomaterial que mimetize um microambiente e que possa dar suporte para as células-tronco possibilitando a restauração do tecido e sua função. Sabe-se que a matriz extracelular da cartilagem hialina é composta pelas proteínas de colágeno, principalmente colágeno do tipo II que tem importância durante a diferenciação e manutenção da cartilagem. O biomaterial de hidrogel de colágeno do tipo II é capaz de dar suporte às células-tronco mesenquimais e permitir a diferenciação dessas células. Descrevemos um método para diferenciação condrogênica das células-tronco mesenquimais do tecido adiposo em um hidrogel de colágeno do tipo II, com o aumento da expressão dos genes relacionados com a formação da matriz extracelular da cartilagem (colágeno do tipo II e agrecana), e relacionado com o controle da diferenciação condrogênica (Sox-9) e o aumento do nível das proteínas glicosaminoglicanas na matriz extracelular. Experimentos em modelo animal para lesão cartilaginosa demonstram que as células-tronco mesenquimais do tecido adiposo e os hidrogéis de colágeno do tipo II são capazes de preencher lesões cartilaginosas e formar um tecido preenchido com células mesenquimais transplantadas. Dessa forma, esse estudo demonstra que hidrogéis de colágeno do tipo II apresentam características apropriadas para o uso em tratamentos para reparo cartilaginoso e que as células-tronco mesenquimais do tecido adiposo podem ser uma fonte alternativa para recuperação de lesões cartilaginosas / Abstract: The cartilage injury is a significant and growing problem of public health. Therapies with adult stem cells have been a promising alternative and have attracted much interest from researchers. The mesenchymal stem cells derived from adipose tissue are characterized as being a homogeneous population with fibroblastic morphology, adherent and with great capacity for proliferation, positive for cell markers CD90 +, CD105 +, CD29 + and CD73 +. They also have the capacity to differentiate into mesoderm lineage such as osteogênica, adipogenic and chondrogenic. Besides the choice of cell source, it is necessary to use a biomaterial that mimics a microenvironment that can support and allow the stem cells to restore tissue and function. It is known that the extracellular matrix of hyaline cartilage is composed of the protein collagen, mainly type II collagen which is important for the differentiation and maintenance of cartilage tissue. The biomaterial collagen type II hydrogel is able to support the mesenchymal stem cells and allow the differentiation of these cells. We describe a method for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from adipose tissue in a collagen type II hydrogel, with increased expression of genes related to the formation of the extracellular matrix of cartilage (collagen type II and aggrecan), and Sox-9 (a gene related with the control of chondrogenic differentiation) and increased the level of glycosaminoglycans in the extracellular matrix proteins. Experiments in animal model for cartilage lesions show that mesenchymal stem cells from adipose tissue and collagen type II hydrogel are able to develop a cartilaginous-like tissue filled with transplanted mesenchymal stem cells. Thus, this study demonstrates that collagen type II hydrogel have characteristics suitable for use in treatments to repair cartilage and mesenchymal stem cells from adipose tissue may be an alternative source for recovery of cartilage lesions / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Ciências

O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-19T13:49:54Z No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-19T13:50:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-19T13:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) Previous issue date: 2015-01 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As células-tronco mesenquimais (CTM) constituem uma ferramenta promissora para o campo de terapia celular. Além de seu potencial de diferenciação em diferentes tipos celulares, as CTM apresentam a habilidade de secretar moléculas bioativas e, assim, exercer múltiplos efeitos biológicos, tais como indução da regeneração de tecidos lesionados, redução de fibrose e modulação do sistema imune. A superexpressão dos fatores de crescimento G-CSF e IGF-1, conhecidos por seus efeitos sobre os processos de imunomodulação, sobrevivência celular e reparo tecidual, pode ampliar as ações terapêuticas das CTM. O objetivo deste trabalho consiste em gerar e caracterizar linhagens de CTM de camundongo superexpressando hGCSF ou hIGF-1. Um sistema lentiviral de segunda geração foi utilizado para modificação de CTM para expressão ectópica dos genes de interesse. As sequências codificantes de hG-CSF e hIGF-1 foram amplificadas por PCR e subclonadas em um vetor lentiviral de transferência, contendo um promotor constitutivo. As partículas lentivirais foram produzidas a partir da cotransfecção de células da linhagem HEK293FT com os vetores constituintes do sistema lentiviral. Em seguida, as CTM obtidas da medula óssea de camundongos transgênicos para proteína fluorescente verde (GFP) foram transduzidas com partículas lentivirais infectantes contendo hG-CSF ou hIGF-1. A expressão gênica de hG-CSF ou hIGF-1 pelas linhagens geradas foi quantificada por qRTPCR, e a produção da proteína por ELISA. As linhagens foram caracterizadas por imunofenotipagem e avaliadas quanto ao seu potencial de diferenciação celular. Foram geradas duas linhagens de CTM superexpressando hG-CSF e três linhagens superexpressando hIGF-1. Todas demonstraram por qRTPCR, estar efetivamente expressando os genes de interesse. Foi possível detectar e quantificar a síntese proteica de G-CSF e IGF-1. Todas as linhagens geradas foram capazes de se diferenciar em osteócitos, condrócitos e adipócitos, demonstrando a manutenção de seu fenótipo estromal. Neste contexto, este trabalho resultou em ferramentas funcionais para a avaliação dos efeitos terapêuticos de IGF-1 e G-CSF combinados à CTM, em modelos de lesões animais, em comparação com CTM não-modificadas geneticamente. Além disso, estas ferramentas poderão ser empregadas em estudos de pesquisa básica, para melhor compreensão dos efeitos de hIGF-1 e hG-CSF sobre a biologia das CTM. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising tool for the cell therapy field. In addition to their potential for differentiation into different cell types, MSCs have the ability to secrete bioactive molecules and thus exert multiple biological effects such as induction of the injured tissue regeneration, fibrosis reduction and modulation of the immune system. The overexpression of the growth factors G-CSF and IGF-1, known for their effects on immune modulation processes, cell survival and tissue repair, can result in a magnification of MSCs' therapeutic actions. The objective of this work is to generate and characterize mouse MSCs lines overexpressing hG-CSF or hIGF-1. A second generation lentiviral system was used to modify MSCs derived from mice for the ectopic expression of the genes of interest. The coding sequences of hG-CSF and hIGF-1 were amplified by PCR and subcloned into a lentiviral transfer vector containing a constitutive promoter. The lentiviral particles were produced from the co-transfection of HEK293FT lineage cells with the lentiviral vectors. Subsequently, MSCs obtained from the bone marrow of transgenic mice for green fluorescent protein (GFP) were transduced with infectious lentiviral particles containing hG-CSF or hIGF-1. The gene expression of hG-CSF or hIGF-1 by the generated cell lines was quantified by qRTPCR, and the protein production by ELISA. The lineages were characterized by immunophenotyping and evaluated for their potential of cellular differentiation. Two lines of MSCs overexpressing hG-CSF and three lines overexpressing hIGF-1 were generated. All the cell lines demonstrated to be effectively expressing the genes of interest by qRTPCR. It was possible to detect and quantify the protein synthesis of G-CSF and IGF-1. Moreover, all the generated lines were capable of differentiating into osteocytes, chondrocytes and adipocytes, indicating the conservation of their stromal phenotype even after genetic modification. In this context, this study resulted in functional tools for evaluating the IGF-1 and G-CSF therapeutic effects when combined with MSCs, to be tested in experimental animal models in comparison to non-genetically modified MSCs. Furthermore, these tools may be employed for basic research studies, for a better understanding of the effects of hIGF-1 and hG-CSF on MSCs' biology

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior

Orientador: Fausto Viterbo de Oliveira Neto / Resumo: As deformidades craniofaciais decorrentes de traumas, ressecções de tumores ou malformações congênitas são freqüentes na prática médica e o tratamento destas necessitam de cirurgia reparadora, com técnicas especializadas e profissionais qualificados para corrigir os defeitos e proporcionar melhor qualidade de vida, aprimorar a fala, respiração, mastigação e deglutição. Há diversas técnicas descritas para corrigir os defeitos ósseos, cada uma com vantagens e desvantages, escolhidas de acordo com o tipo de deformidade. Este estudo avaliou a formação óssea em um retalho tubular vascularizado, gáleo-periostal, enriquecido com o uso de pó de osso, plasma rico em plaquetas, células-tronco mesenquimais e ácido hialurônico, em coelhos, que tenha capacidade de substituir o enxerto ósseo nas reconstruções, principalmente nos defeitos faciais. No estudo, utilizou-se 98 coelhos divididos em doze grupos, submetidos à cirurgia para confecção do retalho em calota craniana. Foram realizados retalhos tubulares com o periósteo voltado para dentro e preenchidos com pó de osso, plasma rico em plaquetas (PRP), células-tronco mesenquimais (CTM) e ácido hialurônico. O Grupo 1 não foi manipulado. No Grupo 2 foi realizado o retalho tubular e mantido vazio. O Grupo 3 teve o retalho preenchido com pó de osso, no Grupo 4 o retalho foi mantido vazio. O Grupo 5 teve o retalho preenchido com PRP. No Grupo 6 o retalho foi preenchido com PRP e pó de osso. O Grupo 7 foi preenchido com CTM. O Grupo 8 teve o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor