INTRODUÇÃO: Apesar dos primeiros relatos sobre o uso clínico de células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC) sugerirem que esta abordagem seja factível e efetiva na reconstrução de partes moles, não existem na literatura ensaios clínicos randomizados e com inclusão de controles. Assim sendo, foi objetivo deste estudo investigar se um novo protocolo para o isolamento de ADSC e seu uso em conjunto com os enxertos de gordura é de fato capaz de aumentar a sobrevivência destes enxertos. MÉTODOS: Pacientes com microssomia craniofacial (n=18) foram selecionados e randomicamente distribuídos para o grupo EC (com suplementação de ADSC) ou o grupo EE (sem suplementação de ADSC). Para o grupo EC, ADSC imediatamente isoladas a partir de metade do volume lipoaspirado foram utilizadas para o enriquecimento de células progenitoras do enxerto. A quantidade de tecido adiposo transplantado foi determinada pela simetria com o lado não afetado, não sendo realizado qualquer tipo de supercorreção. O número total de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos de gordura foi calculado, e através de citometria de fluxo estas células foram examinadas quanto à presença de marcadores de superfície para células mesenquimais. Tomografia computadorizada foi realizada para avaliar ambas as hemifaces no pré-operatório e no pós-operatório de seis meses. A espessura do revestimento de partes moles em quatro diferentes pontos de referência e o volume das hemifaces foram calculados. Morbidade geral e variáveis transoperatórias foram registradas. RESULTADOS: Para ambos os grupos o volume médio injetado foi de aproximadamente 28 mL. O número médio de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos foi 5,6 x 105 e 9,9 x 105 células por mL de tecido adiposo (p=0,015). Análise de citometria de fluxo revelou que ADSC foram positivas para marcadores de células mesenquimais (>95% para CD 73 e CD 105). No pós-operatório de seis meses, o índice de espessura média nos pontos de 1 a 4 foi de 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), e 1,00 (p=0,04) no grupo EC, e 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), e 0,84 (p=0,59) no grupo EE. Para o grupo EC o volume de gordura mantido após seis meses foi de 84 % e para o grupo EE foi de 51 % (p=0,003). Nenhuma complicação foi detectada. CONCLUSÕES: Estes resultados sugerem que o isolamento e a suplementação de ADSC é efetivo, seguro e superior à lipoenxertia convencional para o aumento de partes moles da face em pacientes portadores de microssomia craniofacial / INTRODUCTION: Although first reports of the clinical use of adipose-derived stromal cells (ADSC) suggest that this approach may be feasible and effective for soft tissue reconstruction, there is a lack of randomized, controlled clinical trials in the literature. Hence, this study aimed to investigate whether a novel protocol for isolation of ADSC and their use in combination with fat tissue could really improve the long-term retention of the grafts. METHODS: Patients with craniofacial microsomia (n=18) were selected and randomly assigned to group EC (with supplementation of ADSC) or group EE (without supplementation of ADSC). For group EC, ADSC freshly isolated from half of the aspirated fat sample were used to enrich for progenitor cells in the graft. Amount of transplanted adipose tissue was determined by trying to obtain symmetry with the unaffected side without any overcorrection. Number of viable cells isolated before and after the supplementation of the grafts was calculated, and these cells were examined for mesenchymal cell surface markers using flow cytometry. Computed tomography was performed to assess both hemifaces preoperatively and at six months postoperatively. Soft tissue thicknesses at four different reference points and the hemifaces volume were calculated. Overall morbidity and surgical variables were recorded. RESULTS: For both groups mean injected volume was 28 mL. Average number of viable cells isolated before and after supplementation of the grafts was 5,6 x 105 and 9,9 x 105 cells per mL of fat tissue (p=0,015). Flow cytometry analysis revealed that the ADSC were positive for mesenchymal cell markers (>95% for CD 73 and CD 105). At six months postoperatively, average thickness ratio at points 1 to 4 was 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), and 1,00 (p=0,04) in group EC, and 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), and 0,84 (p=0,59) in group EE. For group EC surviving fat volume at six months was 84 % and for group EE it was 51 % (p=0,003). No complications were detected. CONCLUSIONS: These results suggest that this strategy for isolation and supplementation of ADSC is effective, safe and superior to conventional lipoinjection for facial recontouring in patients with craniofacial microsomia

Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Resumo: Atualmente são muitos casos de pacientes que perdem estrutura óssea em acidentes ou reabsorção patológica. A bioengenharia óssea é um tratamento promissor que visa reconstruir estas estruturas sem a morbidade do enxerto autógeno. O tecido ósseo é um conjuntivo especializado com a função principal de proteção e sustentação dos tecidos moles, mas também é responsável pela produção de tipos celulares e homeostase de minerais. Sua reparação é complexa com diferentes tipos celulares e agentes quimiotáticos que funcionam de forma orquestrada até a reparação. As terapias celulares vêm sendo estudadas para promover a reparação de defeitos que o organismo por si não consegue resolver. Células menos especializadas como as células-tronco embrionárias (ESCs) possuem grande potencial terapêutico, mas são complicadas eticamente. Já as células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser autólogas, o que minimiza o risco de imunogenicidade mas necessitam área doadora do paciente. Atualmente ainda não há consenso quanto ao uso de células tronco na terapia regenerativa pois há grandes variáveis como a melhor forma de aplicação, a quantidade correta e o melhor tipo celular para a regeneração óssea. As células produzem mediadores químicos no local enxertado, que segundo pesquisas recentes é o principal mecanismo de reparação tecidual. Estes mediadores são depositados em abundância no meio de cultura durante a cultura celular e usados na bioengenharia com a ajuda de scaffolds. Os biopolímeros de fibrina ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chapter I present a review about bone repair and its biological events, bioengineering, cells, fibrin biopolymer as scaffold and the secretoma derived from cell culture. Many patients nowadays lose bone structure in accidents or pathological reabsorption. Bone bioengineering is a promising treatment that aims to reconstruct these structures without autogenous graft morbidity. Bone tissue is a specialized connective tissue specialized in protecting and supporting soft tissues, but it is also responsible for the production of cell types and mineral homeostasis. The bone healing is a complex process where different cell types and chemotactic agents work in an orchestrated way. The cell therapies can promote the repair of defects that the body cannot solve. Less specialized cells like embryonic stem cells (ESCs) have great therapeutic potential, but are ethically complicated. In contrast, mesenchymal stem cells (MSCs) may be autologous, which minimizes the risk of immunogenicity but requires a patient's donor area. Currently there is still no consensus regarding the use of stem cells in regenerative therapy, studies uses different methods, cells and biomaterials for bone regeneration. Recent researches advocate that paracrine secretions by cells are main mechanism of tissue repair. These mediators are deposited in abundance in the culture medium during cell culture. Fibrin biopolymers (BF) are natural biomaterials to the body and can function as drug delivery of growth factors, c... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: Estudos com células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) estão em crescente progresso devido às suas propriedades imunomoduladoras, antiinflamatórias, antiapoptóticas e de regeneração tecidual, tornando essa modalidade de terapia celular promissora no tratamento de diversas doenças. Devido à limitada capacidade regenerativa do sistema nervoso central (CNS), causando sequelas funcionais, as MSCs estão sendo investigadas como uma alternativa terapêutica para condições neurológicas inflamatórias, vasculares, traumáticas e degenerativas em diversas espécies animais. A Mieloencefalite protozoária equina (EPM) causada por ambos os protozoários do filo Apicomplexa, Sarcocystis neurona e Neospora hughesi, permanece como uma importante doença neurológica dos equinos nas Américas, embora a maioria dos casos seja devida à infecção por S. neurona. A aplicação da proteômica com sua gama de ferramentas na clínica de equinos pode contribuir significativamente para o entendimento de processos patológicos e facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos ou marcadores diagnósticos. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil proteômico do líquido cefalorraquidiano (CSF) antes e após múltiplos transplantes intratecal de MSCs em equinos hígidos e o perfil proteômico do CSF de equinos cronicamente afetados pela EPM. Doze cavalos adultos clinicamente saudáveis foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais: grupo DPBS (DPBS ou control; n = 4) onde a sol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multipotent mesenchymal stromal cell (MSCs) studies are under increasing progress because of their immunomodulatory, anti-inflammatory, antiapoptotic and tissue regeneration properties, making this modality of cell therapy promising in the treatment of various diseases. Due to the limited regenerative capacity of the central nervous system (CNS), causing functional sequelae, MSCs are being investigated as a therapeutic alternative for inflammatory, vascular, traumatic and degenerative neurological conditions in various animal species. Equine protozoal myeloencephalitis (EPM) caused by both protozoa of the Apicomplexa phylum, Sarcocystis neurona and Neospora hughesi, remains an important neurological disease in horses in the Americas, although most cases are due to S. neurona infection. The application of proteomics with its range of tools in the equine clinic can contribute significantly to the understanding of pathological processes and facilitate the discovery of new therapeutic targets or diagnostic markers. In this context, the objectives of this study were to evaluate the proteomic profiling of cerebrospinal fluid (CSF) before and after multiple intrathecal transplantations of MSCs in healthy horses and the CSF proteomic profiling of horses chronically affected by EPM. Twelve clinically healthy adult horses were randomly divided into three experimental groups: DPBS (DPBS or control; n = 4), in which intrathecal "transplants" with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPB... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células mesenquimais estromais multipotentes (CMMs) gera a necessidade da produção em larga escala destas células com adequada qualidade terapêutica. As CMMs são geradas atualmente através de culturas aderentes na presença de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, apesar da eficiência na promoção do crescimento celular, o uso de SFB não é isento de desvantagens e riscos. Além do alto custo, sua utilização pode gerar risco de contaminação do produto final com agentes adventícios como vírus e príons. Por outro lado, a sua variabilidade em diferentes lotes e fornecedores dificulta a padronização do meio e reprodutibilidade do cultivo. Uma alternativa promissora para a cultura de células destinadas a terapia celular é a substituição de SFB por soro AB humano obtido a partir de plasma humano. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi produzir soro AB humano e avaliar a sua qualidade e eficácia como substituto do SFB na produção de células mesenquimais destinadas à terapia celular. Para a produção do soro AB humano foram avaliados tanto Plasma comum (PC>24h) (n=3) quanto Plasma isento de crioprecipitado (PCIC) (n=3). Após a produção, foi realizado o controle de qualidade dos lotes produzidos sendo verificado que os mesmos atenderam as exigências necessárias para a utilização na terapia celular. As duas fontes de plasma utilizadas para a produção do soro AB humano apresentaram características semelhantes quanto aos constituintes bioquímicos e demais parâmetros analíticos e foram eficazes na suplementação do cultivo e expansão das CMMs. A suplementação do meio com 10% de soro AB humano foi eficaz tanto no cultivo em culturas estáticas quanto em microcarregadores. Esta característica alinhase com a possibilidade de produção em larga escala, uma vez que, permitiu a expansão das CMMs de maneira similar à condição controle (suplementada com 10% de SFB) e preservou as características imunofenotípicas, funcionais e perfil citogenético pós cultivo. Além disso, o soro AB humano produzido pode ser utilizado por no mínimo doze meses após produção, quando armazenado em temperatura inferior a 20ºC negativos / The growing number of clinical applications involving multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) generates the need for large-scale production of these cells with appropriate treatment quality. The MSCs are now generated through adherent cultures in the presence of fetal bovine serum (FBS). However, despite the efficiency of this method, the use of FBS is not exempt of drawbacks and hazards. Besides the high cost, their use can lead to the risk of final product contamination with adventitious agents such as viruses and prions. In addition, due to its high variability of reproducibility, this methodology requires high level of standardization. A promising alternative would be to replace FBS by human AB serum from human plasma. In this scenario, our objective was to produce human AB serum and evaluate their quality and effectiveness as a FBS substitute on production of mesenchymal cells for therapy. For the production of human AB serum were evaluated both common plasma (CP > 24h; n=3) and plasma cryoprecipitate depleted (PCD; n=3). Quality controls were carried out to stablish minimal requirements of quality to be used in a cell therapy scenario. Both plasma sources of human AB serum presented similar biochemical characteristics and other analytical parameters, being effective in supplementation of the culture and expansion of MSCs. Supplementing the culture medium with 10% human AB serum was effective both in cultivation of static cultures as for microcarriers. This condition might indicate that this method would be useful for large scale production, allowing the expansion of MSCs similarly to the control condition and maintaining immunophenotypic, functional and cytogenetic characteristics. Furthermore, the human AB serum produced can be used for at least twelve months after production when stored at temperature below 20ºC negative

Orientador: Benedito Barraviera / Resumo: O reparo do tecido ósseo é um desafio antigo da ciência mundial. A partir das décadas de 70-80, os biomateriais passaram a ser explorados e hoje desempenham importante papel na engenharia tecidual. Estes, quando aplicados na enxertia óssea, devem ser bioativos, biocompatíveis e reabsorvíveis. A integração entre os diversos materiais de origem sintética e os arcabouços biológicos possui amplo espectro de uso. Dentre os arcabouços destacam-se os compostos à base de fibrina por suas propriedades hemostáticas, estabilidade e morfologia favorável à proliferação celular. A presente revisão abordou a estrutura e constituição do tecido ósseo e suas limitações no processo de reparo, a relevância da engenharia tecidual aplicada à esta finalidade e os biomateriais utilizados para otimizar tal processo, com ênfase especial aos materiais compostos por fosfatos de cálcio, células tronco mesenquimais e sua aplicação junto ao arcabouço biológico selante de fibrina, com destaque para o selante heterólogo de fibrina, agora denominado biopolímero de fibrina, um produto único e em fase de testes em experimentação animal e estudos clínicos. Propõe-se, ao final desta, uma nova abordagem para a regeneração de defeitos ósseos de ratos baseada na associação entre o selante heterólogo de fibrina, o fosfato de cálcio bifásico e células tronco mesenquimais. / Abstract: Bone tissue repair is an ancient challenge of world science. From the 70s and 80s, biomaterials began to be explored and nowadays play an important role in tissue engineering. These, when applied in bone grafting, have to be bioactive, biocompatible and resorbable. The integration between the various materials of synthetic origin and biological scaffolds has a wide spectrum of use. Among these scaffolds, fibrin-based compounds are distinguished by their hemostatic properties, stability and morphology favorable to cell proliferation. The present review addressed the structure and constitution of bone tissue and its limitations in the repair process, the relevance of tissue engineering approaches applied to this purpose and the biomaterials used to optimize this process, with special emphasis on materials composed of calcium phosphates, mesenchymal stem cells and its application with the biological sealant fibrin scaffold, highlighting the heterologous fibrin sealant, now named as fibrin biopolymer, a unique product testing in animal experimentation and clinical studies. At the end of this, a new approach is proposed for the regeneration of rat bone defects based on the association between heterologous fibrin sealant, biphasic calcium phosphate and mesenchymal stem cells. / Mestre

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-30Bitstream added on 2015-04-09T12:48:01Z : No. of bitstreams: 1 000814146.pdf: 660875 bytes, checksum: 9336b38c8a05d65357c828a9a2773a9b (MD5) / This study aimed to isolate MSCs from canine Wharton's jelly umbilical cord and evaluate in vitro the effect of PRP and the MOD in osteogenic differentiation of these cells in the absence of osteogenic medium. Cells were isolated and characterized as undifferentiated mesenchymal cells with a phenotype fibroblasts-like and characteristic phenotype of confirmed by flow cytometry with CD44 +, CD105 +, CD271 +, CD34-and CD45-, plus the ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. Except for the control group (MSCs), in all groups, G-PRP (PRP and MSCs), G-DBM (DBM and MSCs) and G-PRP + DBM (MSCs and PRP + DBM) was differentiation osteoblastic with production of mineralized bone matrix confirmed by Alizarin red staining. The measurement of alkaline phosphatase (AP) increased up to 14 days in all groups. Bone proteins were expressed in the polymerase chain reaction in real time and were able to confirm the differentiation bone in all groups. Osteopontin had its greatest expression in G- PRP to seven days followed by G-PRP + DBM, at other times the G-PRP + DBM had higher expression than the other groups. The osteocalcin and Runx2 were expressed more intensely in the G-PRP + DBM at the end of the experiment. It can be concluded that the PRP and DBM are capable of promoting osteogenesis mesenchymal cells in Wharton's jelly of the umbilical cord with canine, with advantage in the presence of DBM

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.