Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Marinônio Cornélio Lopes / Banca: Rubens Camargo Siqueira / Resumo: Matrizes de quitosana e colágeno podem oferecer nicho biológico para o crescimento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC). O objetivo deste trabalho foi caracterizar as propriedades físicoquímicas das matrizes e sua biocompatibilidade com ADSC, bem como suas interações e influências diretas das matrizes sobre o comportamento da ADSC. A metodologia incluiu o tratamento enzimático de tecido adiposo obtido por lipoaspiração com colagenase IV, imunofenotipagem, cinética de crescimento das células, estudos de biocompatibilidade das matrizes analisadas pela atividade de fosfatase alcalina (AP), determinação de óxido nítrico (NO) por macrófagos e imagens das matrizes por microscopia óptica e eletrônica de varredura. A concentração de reticulação de genipina e glutaraldeído foi avaliada por ensaios de ninidrina, testes de solubilidade e de degradação das matrizes. Os melhores resultados foram obtidos com genipina a 0,5 %. Após nove expansões a viabilidade foi de 99 % e o tempo de duplicação da população de células diminuiu de sete para dois dias. Os resultados mostraram que as matrizes são biocompatíveis, exibem propriedades físicas e químicas necessárias para as células e são fortes estimuladoras de proteínas de sinalização (fosfatase alcalina) e de outras moléculas (NO), que são importantes no processo de regeneração tecidual. Portanto, as matrizes podem proporcionar um nicho biológico para adesão, proliferação e controle das atividades das ADSC / Abstract: Scaffolds of chitosan and collagen can offer a biological niche for the growth of adipose derived stem cells (ADSC). The objective of this work was to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds and the ADSC, as well as their interactions to direct influences of the scaffolds on the behavior of ADSC. The methodology included an enzymatic treatment of fat obtained by liposuction by collagenase IV, ASDC immunophenotyping, cell growth kinetics, biocompatibility studies of the scaffolds analyzed by the activity of alkaline phosphatase (AP), nitric oxide (NO) determination, and images of both optical and scanning electron microscopy of the matrices. The extent of the crosslinking of genipin and glutaraldehyde was evaluated by ninhydrin assays, solubility tests and degradation of the matrices. The best results were obtained with 0.5 % genipin. After nine expansions viability was 99 % and the population doubling time decreased from seven to two days.The results showed that the matrices are biocompatible, exhibit physical and chemical properties needed to house cells in vivo and are strong stimulators of signaling proteins (alkaline phosphatase) and other molecules (NO) which are important in tissue regeneration. Therefore, the matrices provide a biological niche for ADSC adhesion, proliferation and cells activities / Mestre

Orientador: Silvia Regina Catharino Sartori Barravieira / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Joel Carlos Lastoria / Banca: Alexandre Leite Rodrigues de Oliviera / Resumo: A cicatrização de uma ferida consiste em uma perfeita e coordenada cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a reestruturação original do tecido. Nas últimas décadas, o tratamento de feridas vem ganhando um grande avanço tecnológico e científico, visando à redução no tempo de cicatrização e diminuição dos riscos de infecção. Assim, a bioengenharia de tecidos introduziu novas alternativas no tratamento de doenças e perdas teciduais por meio do uso de células-tronco associadas à biomateriais. Selantes de fibrina convencionais atuam como arcabouço no transplante de células-tronco pela biocompatibilidade, bio-absorção e a capacidade de ligação célula-selante. O presente estudo tem por objetivo avaliar a resposta cicatricial da ferida cirúrgica na pele de ratos com a aplicação de células-tronco mesenquimais (CTMs) extraídas da medula óssea de ratos em associação ao selante de fibrina derivado de peçonha de serpente (SFPS), visando avaliar se a aplicação do selante promove uma melhor união dos tecidos dérmicos e melhor cicatrização da ferida cirúrgica, tanto sozinha, quanto em associação com CTMs. Para tanto, foram utilizados 2 grupos de analise comparativa, sendo o grupo A (n=32) formado por dois subgrupos de tratamento, sendo o subgrupo 1 com aplicação de SFPS no antímero direito e subgrupo 2 com realização de sutura no antímero esquerdo dos animais e o grupo B (n=32) também formado por 2 subgrupos de tratamento distintos, sendo o subgrupo 3 tratado com SFPS associado a CTM no antímero direito e subgrupo 4 em que foi realizada sutura associada a CTM no antímero esquerdo dos animais. A metodologia de cultivo e proliferação de CTM foi implantada e padronizada em laboratório. A avaliação das respostas cicatriciais ocorreram em 4 períodos (3, 7, 14 e 21 dias) pós-cirúrgicos. Assim, foi demonstrado que o SFPS além de promover uma melhor união das bordas da ... / Abstract: The healing process of a wound is a perfect and coordinated cascade of cellular and molecular events which interacts to occur the restructuring of the tissue. In the past decades, wound care has gained a great technological and scientific advancement, in order to reduce healing time and lowering the risk of infection. Thus, the tissue engineering introduced new alternatives for the treatment of diseases and loss tissue, through the use of stem cells associated with biomaterials. Conventional fibrin sealants operate as a scaffold in the stem cells transplantation, by its biocompatibility, bioabsorption and ability to connect the cells with the sealant. This study aims to evaluate the wound healing response in rats skin, by the application of mesenchymal stem cells (MSCs) extracted from bone marrow of rats, in association with fibrin sealant derived from snake venom (FSSV), in order to evaluate whether if the application of the sealant promotes a better union of the dermal tissues and if improves healing of the surgical wound, either alone or in association with MSCs. For this purpose, 2 groups of comparative analysis were used. The group A (n = 32) was formed by two treatment subgroups, which the subgroup 1 was treated with the application of the FSSV in the right antimere and the subgroup 2 was treated with suture in left antimere. The animals of the group B (n = 32) also comprising two distinct subgroups of treatment, where the subgroup 3 was treated with FSSV associated with MSC in the right antimere and subgroup 4 was performed with suture associated with MSC in the left antimere of the animal. The methodology of the culture and proliferation of MSC was established and standardized in the laboratory. The evaluation of the cicatricial response occurred at 4 periods (3, 7, 14 and 21 days) after surgery. Thus, it was demonstrated that FSSV, besides promoting a better union of the borders of the wound and improved healing, it also allows ... / Mestre

Orientador: Célio Percinoto / Coorientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Robson Frederico Cunha / Banca: Celso Koogi Sonoda / Banca: Elenice Deffune / Banca: Saul Martins de Paiva / Resumo: A avulsão dentária é um tipo de trauma que resulta na perda da continuidade de um complexo e múltiplo compartimento de tecidos. Componentes derivados do sangue, incluindo o plasma pobre em plaquetas (PPP) e o plasma rico em plaquetas (PRP) constituem uma opção terapêutica para o reparo tecidual. O gel de PRP tem sido usado como arcabouço para células-tronco da medula óssea em Engenharia Tecidual. O propósito da presente investigação foi avaliar o efeito do PPP, PRP ativado ou não por trombina e células-tronco (CT) originárias da medula óssea associadas ao PRP no reparo de reimplantes dentários. Quatro cães foram utilizados neste estudo. PRP e PPP foram obtidos pelo método de dupla centrifugação a partir do sangue coletado da veia jugular dos animais. CT foram obtidas por aspiração da medula óssea (AMO) e isoladas pelo método de centrifugação por densidade de gradiente. A citometria de fluxo (CF) foi realizada após AMO utilizando marcadores celulares CD34 e CD90. Após 30 minutos da extração, os dentes foram reimplantados e, de acordo com a proposta metodológica, divididos em 5 grupos: Grupo I - dentes reimplantados sem material (Controle); Grupo II - dentes reimplantados com o Plasma Pobre em Plaquetas (PPP); Grupo III - dentes reimplantados com o Plasma Rico em Plaquetas ativado por cloreto de cálcio (PRP); Grupo IV - dentes reimplantados com o Plasma Rico em Plaquetas ativado por trombina de origem bovina e cloreto de cálcio (PRP + TR) e Grupo V - dentes reimplantados com células-tronco da medula óssea associadas ao PRP ativado por cloreto de cálcio (CT + PRP). Análises histológica, histomorfométrica e imuno histoquímica foram realizadas 120 dias após o reimplante. Análise de variância (ANOVA) e o teste post-hoc de Tukey foram utilizados para a análise estatística, com nível de significância de 5%. CF mostrou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dental avulsion constitutes a traumatism which results in the loss of a complex and multiple tissue compartments. Blood-components products, including platelet-poor plasma (PPP) and platelet-rich plasma (PRP), constitute a therapeutic option for tissue healing. PRP gel has also been used as a scaffold for bone marrow stem cells in Tissue Engineering. This study aimed to evaluate the effect of PPP, PRP activated or not with thrombin and bone marrow stem cells (BMSC) associated with PRP on the healing of replanted teeth. Four adult hybrid dogs were used in this study. PRP and PPP were obtained trough double centrifugation technique of blood collected from the jugular vein of the animals. CTM were obtained from bone marrow aspiration (BMA) and isolated by density gradient centrifugation method. Flow Cytometry Analysis (FCA) was performed after BMA using CD34 and CD90 cells markers. After 30 minutes of extraction, teeth were replanted and, according to the methodological proposal, divided into 5 Groups: Group I - teeth replanted without any material (Control); Group II - teeth replanted with Platelet-poor Plasma (PPP); Group III - teeth replanted with Platelet-rich plasma activated by sodium chloride (PRP); Group IV - teeth replanted with Platelet-rich plasma activated by bovine thrombin and sodium chloride (PRP + TR) and Group V - teeth replanted with bone marrow stem cells associated with PRP activated by sodium chloride (BMSC + PRP). Histological, histomorphometric and immunohistochemical analysis were assessed 120 days after reimplantation. Analysis of variance (ANOVA) and Tukey post-hoc test were used for the statistical analysis, with the level of significance set at 5%. FCA showed 55.98% of CD34+ and 33.28% of CD90+ after BMA. Group V (BMSC + PRP) presented the largest areas of replacement resorption, confirmed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Aparecida Custódio Domingues / Resumo: Introdução: A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) consiste em uma neoplasia hematopoiética maligna de células-tronco, caracterizada pela aquisição do gene de fusão BCR-ABL1 associado à translocação [t(9;22) (q34;q11)]. O início é insidioso com progressão lenta seguida por uma fase acelerada, que culmina na crise blástica. Os nichos da medula óssea estão relacionados com o microambiente tumoral, afetando a sobrevivência e a proliferação das células-tronco leucêmicas. Objetivos: Análise da quantidade e distribuição de células-tronco hematopoiéticas nos diferentes nichos na LMC em diferentes fases e correlação destes achados com a distribuição de galectina-3 nas fases acelerada e blástica. Material e métodos: Revisão clínico-morfológica de 20 pacientes na fase crônica da LMC, 1 paciente na fase acelerada e 1 paciente na crise blástica. Análise imunofenotípica (CD34, CD31, CD44, CD117 e galectina-3) em Tissue Microarrays para avaliação dos diferentes nichos e sua correlação com a matriz proteica. Resultados: Observou-se aumento na expressão de todos os marcadores na fase crônica quando comparados ao controle. Na fase acelerada há aumento na expressão de CD44 e galectina-3 quando comparado ao controle enquanto que na crise blástica há aumento na expressão de CD44 e CD117. Conclusão: A LMC constitui uma neoplasia mieloproliferativa em que o remodelamento dos nichos malignos favorece a manutenção das células-tronco leucêmicas. O presente estudo demonstrou elevação em todos os marcadores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a malignant hematopoietic stem cell neoplasm, characterized by the acquisition of the translocation-associated BCR-ABL1 gene [t(9;22)(q34;q11)]. The onset is insidious with the slow progression followed by an accelerated phase, culminating in the blast crisis. The bone marrow niches are related to the tumor microenvironment, the survival and proliferation of the leukemic stem cells. Objectives: To analyze the amount and distribution of hematopoietic stem cells in different niches in CML in different phases and correlate these findings with the galectin-3 distribution in the accelerated and blastic phases. Material and methods: Clinical-morphological review of 20 patients in CML chronic phase, 1 patient in the accelerated phase and 1 patient in the blast crisis. Immunophenotypic analysis (CD34, CD31, CD44 and galectin-3) in Tissue Microarrays to evaluate the different niches and correlation with the protein matrix. Results: We observed the presence of all markers in the chronic phase when compared to the control. In the accelerated phase there is an increase in expression of CD44 and galectin-3, when compared to control while in blast crisis there is an increase in expression of CD44 and CD117. Conclusion: CML is a myeloproliferative neoplasm in which remodeling of malignant niches favors the maintenance of leukemic stem cells. The present study demonstrated an increase in expression of all immunohistochemical markers at differen... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O Acidente Vascular Encefálico (AVE) é a segunda causa de morte mundial, anualmente mais de 20 milhões de indivíduos são acometidos por esta patologia, 5 milhões destes vão a óbito. No Brasil, é a principal causa de morte. Pesquisas demonstram que é crescente o uso de inúmeros modelos animais validos em pesquisas que buscam terapias funcionais para os Acidentes Vasculares. Numerosas espécies são usadas, ratos, coelhos, caninos, suínos, ovelhas e espécies de primatas. Um grande número de estudos tem sido realizado com células-tronco de diferentes fontes em diferentes modelos animais de lesão medular, e tentativas terapêuticas até mesmo em humanos, apresentando resultados promissores. As células-tronco ideais para a realização de transplantes devem ser imunologicamente inertes, provenientes de fontes de fácil acesso, possuir rápida expansibilidade em cultivo, apresentar capacidade de sobrevivência em longo prazo e de integração no sítio hospedeiro além de serem propícias a transfecção e expressão de genes exógenos. Os objetivos desta pesquisa são o de estabelecer um modelo de AVE em coelhos (Oryctolagus cuniculus) para o uso da terapia com células-tronco e avaliar através de Fluroscopia, avaliação comportamental, parâmetros clínicos e exame histopatológico a lesão induzida. Desta forma realizamos o delineamento experimental, a indução do acidente vascular encefálico em coelhos, o cultivo das células-troco do epitélio olfatório de cães e de coelhos, a transdução com retrovírus, a análise da expressão dos genes exógenos, a preparação de células-tronco transduzidas para transplante nos animais, a Fluroscopia, a avaliação comportamental, a avaliação macroscópica e a histológica. Desta forma o modelo experimental foi validado e comprovada a ação celular no tecido lesado via implante das células no tecido, pós-lesado, comprovado clinicamente pelos nossos resultados. Ainda podemos ressaltar que a ausência de trabalhos utilizando marcadores para o rastreamento de células-tronco após o transplante em lesões vasculares encefálicas, aliado a possibilidade de utilização desta terapêutica celular em animais com lesão vascular encefálica proveniente de traumas e diversas patologias na clínica veterinária são fatos que justificam essa pesquisa, desta forma devemos ressaltar a importância de pesquisas com terapia celular sempre visando inserções diretas e indiretas desta biotecnologia à medicina veterinária e humana. / Stroke is the second cause of death worldwide, each year more than 20 million individuals are affected by this disease, 5 million of these die. In Brazil, this is the leading cause of death. Polls show the use of numerous animal models valid in research seeking treatments for stroke functional is increasing. Numerous species are used, rats, rabbits, dogs, pigs, sheep and species of primates. A large number of studies have been done with stem cells from different sources in different animal models of spinal cord injury, and even therapeutic trials in humans, showing promising results. The ideal stem cells for the performance of transplants should be immunologically inert, from sources of easy access, have rapid expansion in culture, ability to provide long-term survival and integration in the host site as well as being suitable for transfection and expression of exogenous genes. The objectives of this research is to establish a model of stroke in rabbits (Oryctolagus cuniculus) to the use of therapy with stem cells and measure the induced lesion and its consequences by fluoroscopic, behavioral assessment, clinical parameters and histological examination. We designed the experiment, the induction of stroke in rabbits, the cell culture of the olfactory epithelium of dogs and rabbits, transduction with retroviruses, the analysis of exogenous gene expression, the preparation of transducted stem cells for transplantation in animals, fluoroscopic, the behavioral assessment, macroscopic evaluation and histology. Thus, the experimental model was validated and the cell implantation in damaged tissue was confirmed. We emphasize that the lack of studies using markers for the tracking of stem cells after transplantation into brain vascular lesions, the possibility of combined use of cell therapy in animals with vascular brain injury from trauma and various diseases in veterinary clinics are facts that justify such a search. So we must reinforce the importance of research on cell therapy to direct and indirect insertions of this biotechnology in human and veterinary medicine.

Esta pesquisa teve como objetivo estudar a aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos com o uso da videolaparoscopia na face costal do músculo diafragma do modelo mdx. A cirurgia laparoscópica foi utilizada como recurso visualizador da cavidade abdominal, com finalidade de guiar precisamente a aplicação de células-tronco no tecido lesionado. Foram utilizados 10 animais controles, BALB/C57 (grupo A) para padronizar a intervenção cirúrgica; 03 mdx controles (grupo B) que não receberam terapia celular e 03 mdx que receberam terapia celular (grupo C). Padronizou-se a videolaparoscopia em decúbito dorsal com elevação de vinte graus dos membros torácicos e realizou-se 1 aplicação de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos, 3x105. Após 8 dias estes animais foram eutanasiados com overdose anestésica e o músculo diafragma e intercostal foram coletados. Na análise estrutural do músculo diafragma no grupo A, observou as fibras musculares com mesmo diâmetro e núcleos das células periféricos. Os fascículos musculares encontravam-se organizados com presença de fibras reticulares em pequena quantidade. As mesmas características estruturais foram observadas no músculo intercostal. No grupo B, as fibras musculares apresentavamse com diferentes diâmetros, núcleos celulares centralizados, com presença de fibrose perimisial. O músculo intercostal apresentou os mesmos achados, entretanto de forma mais branda. Os fascículos musculares tanto do m. diafragma e intercostal estavam desorganizados e observou-se uma grande quantidade de fibras colágenas e reticulares. No grupo C, observou-se uma leve diminuição do infiltrado inflamatório, porém os núcleos das células ainda se apresentavam centrais. Diferentemente dos dois grupos descritos acima, no grupo C observou-se a presença de células de degranulação e de cordões de mioblastos, demonstrando uma moderada reorganização muscular. Em relação aos fascículos musculares e a quantidade de fibras colágenas e reticulares, estes se mantiveram com as mesmas características do grupo B. Na análise de migração das células-tronco, observamos a marcação positiva da Proteína verde fluorescente (GFP) no músculo diafragma a fresco e na análise imunoistoquímica confirmando os achados estruturais obtidos. Contudo não houve marcação positiva para os cordões de mioblastos. Sugerimos que a aplicação local de células-tronco do epitélio olfatório de coelhos utilizando a videolaparoscopia foi capaz de implantar células-tronco no músculo diafragma. Entretanto, não podemos atribuir os resultados estruturais obtidos nos animais que receberam terapia celular às células-tronco. Acredita-se que alguma sinalização até o momento desconhecida, possa ter estimulado tais alterações histológicas. Portanto, este experimento pode acrescentar novas perspectivas na utilização futura das célulastronco no modelo distrófico canino, por exemplo, o GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), além de estimular a pesquisa para maior esclarecimento sobre as células do epitélio olfatório de coelho. / This research aimed to investigate the application of stem cells from the rabbit olfactory epithelium with the use of laparoscopy in the diaphragm costal face of the of the mdx model. Laparoscopic surgery was used as a visualizer resource of the abdominal cavity; with the purpose to precisely direct stem cells application in the injury tissue. Were used 10 control animals, BALB/C57 (group A) to standardize the surgical intervention, 03 mdx controls (group B) that did not receive cell therapy and 03 mdx that received cell therapy (group C). The laparoscopic technique was standardized in the supine position with twenty degrees elevation of the thoracic members, subsequently was held an application of stem cells from the olfactory epithelium of rabbits, 3x105. After 8 days the animals were euthanized by using anesthetic overdose and the diaphragm and intercostal muscles were collected. The structural analysis of the group A diaphragm presented muscles fibers with same diameter and the cells nuclei presented peripheral. The muscle fascicles were organized with the presence of reticular fibers in small quantities. The same structural characteristics were observed in the intercostal muscle. The group B, presented muscle fibers with different diameters, centralized nuclei cell, with perimisial fibrosis. The intercostal muscle showed similar findings, less severely though. The muscle fascicles of both diaphragm and intercostal muscles were disorganized and presented a large amount of collagen and reticular fibers. In group C, were found a slight decrease of the inflammatory infiltrates, but, at this point, the cells nuclei were central. Differently from the two groups described above, the group C presented cell degranulation and myoblasts cords, demonstrating moderate muscle reorganization. The muscle fascicles and the amount of collagen and reticular fibers remained with the same characteristics of the group B. When examining the stem cells migration, it could be observed, in the fresh diaphragm, a positive marking of green fluorescent protein (GFP). The immunoistochemical analysis confirmed the findings obtained. However, the myoblasts cords were not positive stained. It could be suggested that the rabbit olfactory epithelium stem cells application using the laparoscopic technique was able to conduct stem cells to the diaphragm. Meanwhile, this cannot attribute the structural results obtained from animals which received cell therapy. It is believed that some signaling until the moment unknown may have stimulated these histological changes. Therefore, this experiment can add new perspectives for cell therapy in dystrophic canine model, for example, GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy).

A Ceratoconjuntivite Seca (KCS Keratoconjunctivitis Sicca) é uma desordem imunomediada e resulta de alterações do componente aquoso do filme lacrimal e da deficiência dos componentes lipídicos e mucoso.Seu diagnóstico é baseado no Teste Lacrimal de Schirmer (TLS) e no Teste de Ruptura do Filme Lacrimal (TRFL) e tem como sinais clínicos: secreção mucopurulenta, hiperemia conjuntival, blefaroespasmos, fotofobia, incômodo, dor, vascularização, opacidade corneana e pigmentação, além de cegueira em casos avançados. O tratamento convencional consiste em aplicações diárias de Ciclosporina 0,2% ou Tacrolimus 0,03% (pomada ou colírio oftálmicos), que apesar de controlar a doença, são custosos, não curativos e exigem alto comprometimento da interação paciente-proprietário. A terapia celular usando células-tronco (CT) traz uma nova esperança para doenças sem tratamento efetivo. Neste trabalho utilizamos CT mesenquimais (CTM) obtidas a partir de membrana amniótica (CTMA) de cães obtidas a partir do descarte destes tecidos em campanhas de castrações em diferentes tempos gestacionais, sem formação tumoral quando submetidas ao teste tumorigênico durante 60 dias. Dois animais com KCS crônica foram tratados com duas injeções de CTMA com intervalo de 30 dias, sendo a primeira de 0,5x106 células e a segunda de 1x106 células em cada glândula. Na segunda semana após a terapia foi observado aumento da TLS sugerindo um benéficio da terapia que foi diminuindo com o passar das semanas. O TRFL oscilou durante os testes e não apresentou diferenças significativas. A terapia celular utilizando CTMA de cães melhorou a condição ocular nos dois casos em momentos e parâmetros variados, com repercussão na melhoria da superfície, mas não houve regressão do quadro clínico. Investigações futuras em estágios menos avançados da doença podem ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais esse efeito foi obtido / Keratoconjunctivitis Sicca (KCS) is an immune-mediated disorder and results from changes in the aqueous component of the tear film and also from the impairment of lipid and mucous components. Diagnosis is based on Lacrimal Schirmer Test (LST) and Tear Film Break Test (TFBT) and its clinical signs: purulent discharge, conjunctival hyperemia, blefaroespasmos, photophobia, discomfort, pain, vascularization, corneal opacity and pigmentation, addition of blindness in advanced cases. The standard treatment consists of daily applications of 0.2% cyclosporin or tacrolimus 0.03% (ophthalmic ointment or drops), that in spite of controlling the disease are expensive, require the patient does not curative and and require greater involvement of the patient-owner interaction. Cell therapy using stem cells (SC) brings new hope for diseases without effective treatment. In this work we used CT mesenchymal cells (MSCs) obtained from dogs amniotic membrane (AMSC) in the capanhas of castration at different times gestacionai without tumor formation tumorigenic when subjected to the test during 60 days. Two animals with chronic KCS were treated with two injections of CTMA with 30-day intervals, the first of which 0,5x106 cells and the second of 1x106 cells in each gland. In the second week after therapy was an increase in LST that has been decreasing over the weeks. The BTTF fluctuated during testing and no significant differences. Cell therapy using AMSC dogs improved the eye condition in both cases at times and different parameters, with consequent improvement in ocular surface but there was no regression of the clinical picture. Future research in less advanced stages of the disease may help to elucidate the mechanisms by which this effect was obtained

Neste trabalho de tese aplicamos a espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) junto com a chamada técnica do grupo repórter, aliada a simulação espectral por meio do programa NLSL, para investigar a interação da nicotina dependente com membranas. Também empregamos Ressonância Ferromangnética (RFM), que é uma técnica similar em muitos aspectos ao RPE, para investigamos células-tronco marcadas com nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (NSOF), previamente preparada no laboratório de nanotecnologia do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE). Os resultados relativos à primeira parte da tese, mostraram que a nicotina quando em meio ácido interage com a região da cabeça polar dos fosfolipídios estudados e tem ação penetrante em meio básico. A interação da nicotina com o DPPC resulta em uma desestabilização da fase gel do fosfolipídio. Este fato pode estar relacionado com a ocorrência de doenças respiratórias em tabagistas devido ao fato de que o DPPC é o maior constituinte do complexo surfatante pulmonar. Na segunda parte, fomos capazes de marcar células-tronco com nanopartículas superparmangéticas e também quantificá-las pelo cálculo da área, dupla integral do espectro de RFM das NOSF. Finalmente, fizemos uma caracterização das nanopartículas por meio de experimentos de RFM dependente da variação de temperatura, que confirmaram o comportamento superparamagnético das NOSF. / In this work, we made use of the Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy along with the so-called reporter group technique and extensive spectral simulations by means of the software NLSL to investigate the interaction of nicotine with model membranes. Besides that we also employed Ferromagnetic Resonance (FMR), which is a technique similar in many aspects to EPR, to investigate stem cells labeled with superparamagnetic nanoparticles of iron oxide (NSOF) previously made at the Nanotechnology Laboratory of the Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE). The results concerning the first part of our work showed that nicotine in acidic pH value interacts with the polar headgroup region of the phospholipids under investigation, whereas it penetrates the model membrane in alkaline pH value. Also, the interaction of nicotine with DPPC resulted in destabilization of the phospholipid gel phase. This fact could be related to some of the effects of nicotine in respiratory diseases since DPPC is the major constituent of the pulmonary surfactant complex. In the second part of our work, we were able to successfully label stem cells with the superparamagnetic nanoparticles and also quantify that labeling by calculating the area under the double integrated NSOF FMR spectra. We also performed a characterization of the nanoparticles by means of temperature-variation FMR experiments, which showed that the iron oxide nanoparticled indeed had a superparamagnetic behavior.

Um dos grandes problemas da saúde pública no país esta diretamente ligada à dengue, uma vez que aproximadamente 550 mil pessoas são infectadas anualmente, e cerca de 20 mil vêm a óbito. Esta doença é causada pelo vírus da família Flaviviridae, transmitido pela fêmea ao hospedeiro durante o repasto sanguíneo. Este projeto teve como objetivo isolar e caracterizar células indiferenciadas de ovos embrionados e do tubo digestivo de larvas em quarto instar de Aedes aegypti, como fonte de pesquisa na área de biologia celular e estrutural destes vetores. Mediante cultura celular, as células foram isoladas e recultivadas em meio de cultura DMEM-High, e temperatura de 28 ºC. As seguintes análises foram feitas: morfologia celular, ciclo celular, testes de imunofenotipagem pelo método de citometria de fluxo e analise de imunohistoquimica. As células de Aedes aegypti analisadas pela morfologia celular, apresentaram formato globóide, tamanho pequeno e população heterogênica. A análise das fases do ciclo Sub-G1, G0-G1, S e G2-M após cultura primaria de ovos embrionados atingiram (27,5%; 68%; 30,2% e 1,9%, respectivamente). Após 24 horas atingiram (10%; 92,4%; 6,2% e 0,6%, respectivamente). A análise de imunofenotipagem realizada pelo método de citometria de fluxo demonstrou em ovos embrionados, marcações positivas para pluripotencia, assim como baixa expressão para Oct 3/4, e alta expressão para o (Sox2). As células mesenquimais tiveram alta expressão para os marcadores (Stro-1, Vimentina e Nestin). O marcador de morte celular por apoptose (Caspase3), teve alta expressão nas células cultivadas, enquanto que os marcadores endossomicos específicos para células de insetos (Anti GM130 e Anti RAB-5) também foram altamente expressos. Na cultura celular derivada do tubo digestivo de larvas de Aedes aegypti, as analises dos marcadores para pluripotencia tais como Oct 3/4 não demonstrou expressão, entretanto, o marcador Sox2 foi altamente expresso na cultura. Para as células mesenquimais não houve expressão de nenhum marcador utilizado, ou seja, (Stro-1, Vimentina e Nestin). No entanto para o marcador de morte celular por apoptose (Caspase 3) as células em cultura demonstraram alta expressão, enquanto que para os marcadores endossomicos específicos de insetos os mesmos foram altamente marcados. O teste de imunohistoquímica realizado em ovos embrionados no final do período embrionário demonstrou que as células tinham potencial ploriferativo mediante marcação positiva para PCNA. As células pluripotentes foram pouco expressas pelos marcadores Nanog, Oct 3/4, e muito expressas pelo marcador Sox2. As células de origem mesenquimais foram altamente expressas pelos marcadores SSEA-4, Stro-1, Vimentina e Nestin assim como para os marcadores endossomicos específicos para células de insetos, os quais demonstraram alta expressão nas células de embriões de Aedes. Sendo assim, conclui-se que tanto ovos embrionados quanto larvas de quarto instar de Aedes aegypti possuem células indiferenciadas, com grande potencial para estudos com biologia molecular, visando o controle biológico deste vetor / A major problem of public health in the country is directly linked to dengue, as approximately 550 million people are infected annually, and about 20,000 have died. This disease is caused by the virus of the Flaviviridae family, transmitted by the female to the host during blood feeding. This project aimed to isolate and characterize stem cells from fertilized eggs and larvae gut fourth instar Aedes aegypti, as a source of research in cell biology and structural area of these vectors. Upon cell culture, the cells were isolated and recultured in DMEM-high culture temperature and 28 º C. The following analyzes were performed: cell morphology, cell cycle tests immunophenotyping by flow cytometry and immunohistochemistry analysis. The Aedes aegypti cells analyzed by cell morphology showed globular shape, small size and heterogenic population. The analysis of sub-G1 phase of the cycle, G0, G1, S and G2-M after primary culture reached embryonated eggs (27.5%, 68%, 30.2% and 1.9%, respectively). Achieved after 24 hours (10%, 92.4%, 6.2% and 0.6%, respectively). Immunophenotyping analysis by flow cytometry demonstrated in embryonated eggs, positive for pluripotency markers, as well as low expression of Oct 3/4 and high expression for the (Sox2). The mesenchymal cells had high expression for markers (Stro-1, vimentin and Nestin). The marker of cell death by apoptosis (Caspase3) had high expression in cultured cells, whereas the endosomal markers specific for insect cells (GM130 and Anti-Anti RAB 5) were also highly expressed. In cell culture derived from the gut of larvae of Aedes aegypti, the analysis of pluripotency markers such as Oct for 3/4 showed no expression, however, the marker Sox2 was highly expressed in the culture. For mesenchymal cells no expression of any label used, ie (Stro-1, Nestin and vimentin). However marker for cell death by apoptosis (caspase 3) cells in culture showed high expression, whereas for the specific endosomal markers insects they were highly labeled. The immunohistochemistry test on embryonated eggs at the end of the incubation period the cells have demonstrated potential ploriferativo by positive staining for PCNA. Pluripotent cells were slightly expressed by markers Nanog, Oct 3/4, Sox2, and expressed by the marker. The cells of mesenchymal origin were highly expressed by SSEA-4 markers, Stro-1, Nestin and vimentin as well as the specific endosomal markers for insect cells, which showed high expression in cells of Aedes embryos. Therefore, it is concluded that both embryonated eggs as room instar larvae of Aedes aegypti have undifferentiated cells, with great potential for studies of molecular biology, targeting the biological control of this vector

A doença renal crônica é uma doença de alta incidência na espécie felina, sendo responsável por altas taxas de mortalidade e morbidade. O tratamento clínico é paliativo. Atualmente as células-tronco têm sido estudadas para várias doenças degenerativas e crônicas, entre elas a doença renal. O presente estudo testou a utilização uma nova linhagem de células, progenitoras do tecido renal na terapia de gatos domésticos acometidos naturalmente com doença renal crônica, nos estágios 1, 2 e 3 da doença (creatinina <1,6 a 5,0 mg/dl), por meio de avaliações clínicas e laboratoriais. Os animais foram divididos em dois grupos, experimental e controle. No grupo experimental foi aplicado pela via intraperitoneal 2x106 células progenitoras renais e os animais do grupo controle receberam a aplicação de PBS. Os animais foram avaliados nos dias 0, 7 e 14 e monitorados clinicamente e por meio de exames laboratoriais, incluindo hemograma, creatinina, urinálise e o SDMA. A análise estatística foi realizada pelo teste Scheirer Ray Hare para dados não paramétricos (p=0,05). A aplicação intraperitoneal ocorreu sem intercorrências e aparenta ser segura para utilização em gatos. Dos 4 animais do grupo experimental 3 apresentaram melhora clínica, melhora do apetite e ganho de peso, o quarto animal apresentou perda de peso inicial, mas retornou ao peso do início do estudo 14 dias após a aplicação das células. Não houve diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina, ureia, fósforo e densidade urinária. Os leucócitos do grupo experimental apresentaram uma redução significativa em relação ao grupo controle. O SDMA apresentou redução em 3 animal do grupo experimental e aumento nos animais do grupo controle, mas a análise não apresentou diferença estatística devido ao aumento dos valores no em um dos animais. A aplicação de células progenitoras renais no tratamento da DRC em gatos é promissora e pode ser realizada pela via intraperitoneal, sem que ocorra intercorrências. / Chronic kidney disease is a high incidence disease in the feline species, responsible for high rates of mortality and morbidity. The clinical treatment is palliative. Currently, stem cells have been studied for various degenerative and chronic diseases, including kidney disease. The present study tested the use of a new lineage of renal tissue progenitor cells in the therapy of naturally occurring chronic kidney disease in cats at stages 1, 2 and 3 of the disease (creatinine <1.6 to 5.0 mg/dl), through clinical and laboratory evaluations. The animals were divided into two groups, experimental and control. In the experimental group 2x106 renal progenitor cells were administered intraperitoneally and the animals in the control group received PBS application. The animals were evaluated on days 0, 7 and 14 and monitored clinically and through laboratory tests, including complete blood count, creatinine, urinalysis and SDMA assay. Statistical analysis was performed by the Scheirer Ray Hare test for non-parametric data (p = 0.05). The intraperitoneal application occurred uneventfully and appeared to be safe for use in cats. Of the 4 animals in the experimental group 3 showed clinical improvement, food intake and weight gain, the fourth animal presented initial weight loss, but returned to the weight of the study beginning 14 days after the application of the cells. There were no statistical differences in the parameters of creatinine, urea, phosphorus and urinary density. Leukocytes in the experimental group showed a significant reduction in relation to the control group. The SDMA showed reduction in 3 animals from the experimental group and increase in the animals from the control group, but the analysis did not show statistical difference due to the increase values in one of the animals. The application of renal progenitor cells in the treatment of CKD in cats is promising and can be performed intraperitoneally, without causing intercurrences.