A provocação social é um método utilizado em animais de laboratório para a indução de elevados níveis de agressividade, produzindo padrões comportamentais semelhantes ao de indivíduos violentos. Estudos prévios utilizando drogas que atuam seletivamente sobre os receptores 5-HT1A e 5-HT1B demonstraram uma redução pronunciada no comportamento agressivo. Um dos mais importantes sítios de ação para esses agentes serotonérgicos é o córtex pré-frontal, uma região cerebral particularmente relevante no controle inibitório da agressividade e da impulsividade. O objetivo do presente estudo foi verificar os possíveis efeitos anti-agressivos da microinjeção de 8-OH-DPAT e CP-93,129 (agonistas específicos dos receptores 5-HT1A e 5-HT1B, respectivamente) na região ventro orbital do córtex pré-frontal de camundongos machos provocados socialmente. Para confirmar a especificidade do receptor, antagonistas 5-HT1A e 5-HT1B (WAY-100,635 e SB-224,289, respectivamente) também foram microinjetados na mesma região cerebral. 8-OH-DPAT na dose de 1.0 µg reduziu significativamente a freqüência de mordidas. A menor dose de CP- 93,129 (0.1 µg) também diminuiu o número de mordidas e de ataques laterais. Tais efeitos anti-agressivos não foram acompanhados por alterações no restante do repertório comportamental. A participação específica desses receptores foi verificada pela reversão dos efeitos com a utilização de WAY-100,635 (10.0 µg) e SB-224,289 (1.0 µg). Nossos resultados confirmam o envolvimento da região VO CPF e dos receptores 5-HT1A e 5-HT1B na modulação de altos níveis de agressividade, sem conseqüentes alterações em outras rotinas motoras. / Social instigation is used in rodents to induce high levels of aggression, a pattern of behavior similar to that of violent individuals. This procedure consists of a brief exposure to a provocative stimulus male, before direct confrontation with an intruder. Studies using 5- HT1A and 5-HT1B agonist receptors show a reduction in aggressive behavior. An important site of action for these drugs is the ventral orbito frontal cortex (VO PFC), an area of the brain which is particularly relevant in the inhibitory control of aggressiveness and impulsiveness. The objective of the present study was to assess the anti-aggressive effects of 5-HT1A and 5- HT1B agonist receptors (8-OH-DPAT and CP-93,129) on the VO PFC of socially provoked male mice. To confirm the specificity of the receptor, 5-HT1A and 5-HT1B antagonist receptors (WAY-100,635 and SB-224,289) were microinjected into the same area, in order to reverse the agonist effects. 8-OH-DPAT at 1.0 µg dose reduced the frequency of attack bites. The lowest dose of CP-93,129 (0.1 µg) also decreased the number of attack bites and lateral threats. The anti-aggressive effects were not accompanied by impairment of non-aggressive activities. Specific participation of the 1A and 1B receptors was verified by reversal of antiaggressive effects using selective antagonists WAY-100,635 (10.0 µg) and SB-224,289 (1.0 µg). In conclusion, the decrease in aggressiveness observed with microinjections of 5-HT1A and 5-HT1B receptor agonists into the VO PFC of socially provoked mice, supports the hypothesis that activation of these receptors modulates high levels of aggression in a behaviorally specific manner.

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

O receptor canabinoide CB1, altamente expresso em várias regiões do sistema límbico, possui um importante papel na regulação da plasticidade sináptica implicada nas diferentes fases da memória emocional. Em roedores, embora já estejam bem caracterizados os efeitos da manipulação farmacológica do receptor CB1 na amígdala, no hipocampo e no córtex pré-frontal medial sobre a modulação de memórias aversivas, sua função no córtex retrosplenial (RSC) permanece desconhecida. Neste trabalho, usando o paradigma pavloviano de condicionamento aversivo ao contexto em ratos, exploramos o papel do sistema canabinoide no RSC sobre as fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória. Demostramos que a infusão intra-RSC imediatamente pós-treino de AM251 (11 μg/μL), um antagonista seletivo CB1, causa amnésia retrógrada no teste de retenção da memória conduzido 48 h após o condicionamento, enquanto que a infusão bilateral de CP55940, um agonista canabinoide CB1/CB2 (5μg/μL), facilita a consolidação da memória. No protocolo de reconsolidação (injeção intra-RSC após uma sessão de reativação de 4 min, conduzida 48 h depois do condicionamento) foram encontramos efeitos opostos no teste de retenção da memória realizado 24 h após a reativação: o bloqueio dos receptores CB1 facilita, enquanto que sua ativação prejudica o fenômeno de reconsolidação da memória. Além disso, quando o AM251 é injetado intra-RSC 20 min antes de uma reexposição prolongada (de 30 min), observamos que a consolidação da memória de extinção é prejudicada, enquanto que o CP55940 acelera a extinção e impede sua recuperação espontânea ao longo do tempo. Concluindo, nossos resultados apresentam novas evidências sobre a função do sistema canabinoide no RSC sobre a modulação das fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória emocional. / The CB1 cannabinoid receptor is highly expressed in many regions of the limbic system, having an important role in the regulation of synaptic plasticity implicated in different phases of emotional memory processing. In rodents, although are well characterized the effects of the pharmacological manipulations of the CB1 receptor in the amygdala, hippocampus, and medial prefrontal cortex upon the modulation of aversive memories, their function in the retrosplenial cortex (RSC) remains unknown. In this study, using pavlovian contextual fear conditioning in rats, we explored the role of the cannabinoid system in the RSC on memory consolidation, reconsolidation, and extinction. We showed that posttraining intra-RSC infusion of AM251 (11 μg/μL), a selective CB1 antagonist, causes retrograde amnesia during the test for memory retention conducted 48 h after learning, whereas the bilateral infusion of CP55940 (5 μg/μL), a CB1/CB2 agonist, enhanced fear memory consolidation. In the reconsolidation protocol (postreactivation intra-RSC infusions conducted 48 h after training) we found opposite effects in the test session performed 24 h after memory reactivation: blocking CB1 receptors enhanced, whereas the activation of cannabinoid receptors impaired memory reconsolidation. Furthermore, when AM251 was infused intra-RSC 20 min before a prolonged reexposure (30 min), memory extinction was impaired, whereas the infusion of CP55940 accelerates memory extinction and prevents spontaneous recovery, maintaining memory extinguished over time. In conclusion, these data shed new light about the function of the cannabinoid system in the RSC on the role of contextual-fear related memory consolidation, reconsolidation, and extinction.

(OMIM 246450), também conhecida por acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica (HMGA), é um distúrbio genético caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo predominante dos ácidos 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG), 3-metilglutárico (MGA) e 3-metilglutacônico (MGT), bem como em menor grau do ácido 3- hidroxiisovalérico em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades no córtex cerebral e gânglios da base cuja fisiopatogenia é pouco conhecida. No presente estudo investigamos os efeitos dos principais metabólitos acumulados na HMGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em estriado de ratos injetados com esses compostos e em astrócitos cultivados de córtex cerebral, bem como sobre a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de estriado e córtex cerebral de ratos com 30 dias de idade. Assim, estudamos inicialmente os efeitos da administração intrastriatal de HMG e MGA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em ratos em desenvolvimento. Nossos resultados demonstram que o HMG e o MGA induziram dano oxidativo em lipídios e proteínas. Os dois ácidos também aumentaram a oxidação da 2'- 7'-diclorofluorescina (DCFH), ao passo que apenas o HMG induziu a produção de óxido nítrico. Em relação às defesas antioxidantes o HMG e o MGA provocaram uma diminuição das concentrações de glutationa reduzida e das atividades da superóxido dismutase e glutationa redutase, bem como um aumento da atividade da glutationa peroxidase. Já o HMG também causou um aumento de atividade da catalase e uma diminuição da atividade da glicose-6- fosfato desidrogenase. Finalmente observou-se que antioxidantes preveniram completamente ou atenuaram as alterações dos parâmetros de estresse oxidativo causadas pelo HMG, reforçando a participação de espécies reativas nesses efeitos. Observou-se também que MK-801, um antagonista nãocompetitivo do receptor glutamatérgico do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), preveniu alguns dos efeitos provocados pelo HMG, indicando o envolvimento do receptor NMDA no desequilíbrio redox causado por esse metabólito. Tendo em vista que os astrócitos são importantes para proteção neuronal e são susceptíveis a danos por neurotoxinas, o passo seguinte de nossa investigação foi determinar os efeitos do HMG e MGA sobre parâmetros importantes da homeostase redox e produção de citocinas em astrócitos corticais cultivados. Ambos os ácidos orgânicos reduziram a função mitocondrial astrocitária sem alterarem a viabilidade celular e também diminuíram as concentrações de glutationa reduzida. Em contrapartida, ambos metabólitos aumentaram a formação de espécies reativas (oxidação da DCFH) e também provocaram um aumento na liberação das IL-1β, IL-6 e TNFα através da via de sinalização de Erk. Finalmente investigamos os efeitos do HMG, MGA e MGT sobre a fosforilação da GFAP e subunidades NFL, NFM e NFH dos neurofilamentos (NF) em fatias de estriado e de córtex cerebral. Nossos resultados demonstraram que o HMG, o MGA e o MGT provocaram uma hipofosforilação da GFAP e todas as subunidades dos NF nas duas estruturas cerebrais. Verificamos ainda que a hipofosoforilação induzida por HMG nas proteínas do citoesqueleto foi mediada pela inibição das proteínas cinases, sem alterações de proteínas fosfatases. Assim, demonstramos que uma inibição da PKA estaria envolvida na hipofosforilação da Ser55 na região aminoterminal da NFL, 3 bem como uma inibição da JNK, resultaria na hipofosforilação das repetições do tipo KSP na região carboxiterminal das subunidades NFM e NFH. Observou-se também que a hipofosforilação do citoesqueleto era dependente dos receptores glutamatérgicos sinápticos e extrasinápticos (subunidade NR2B) do tipo NMDA e também do íon Ca2+. Além disso, o inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME, e o antioxidante TROLOX (análogo hidrosolúvel da vitamina E) preveniram completamente a hipofosforilação e a inibição das atividades da PKA e da JNK causada pelo HMG. Podemos então presumir que, os presentes dados fornecem evidências sólidas de que o estresse oxidativo induzido pelo HMG e MGA em estriados de ratos e em astrócitos corticais cultivados, além de uma resposta inflamatória evidenciada nessas células neurais e uma hipofosoforilação em proteínas do citoesqueleto possam representar mecanismos patológicos importantes que contribuem, ao menos em parte, com as alterações cerebrais observadas nos pacientes afetados pela deficiência da HL. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase (HL) deficiency, also known as 3- hydroxy-3-methylglutaric aciduria (HMGA) is a genetic disorder biochemically characterized by predominant accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), 3-methylglutaric (MGA) and 3-methylglutaconic (MGT), as well as lesser amounts of 3-methylglutaconic and 3-hydroxyisovaleric acids in tissues and biological fluids of affected individuals. Clinically, the patients present neurological symptoms and basal ganglia injury, whose pathomechanisms are partially understood. In the present study, we investigated the effects of the main metabolites accumulating in HMGA on important parameters of oxidative stress in intrastriatally injected rats, in cortical cultured astrocytes, as well as on the phosphorylation of striatal and cortical cytoskeletal proteins of 30 day old rats. Thus, we first investigated the effects of the intrastiatal administration of HMG and MGA on important parameters of oxidative stress in developing rats. Our results demonstrate that HMG and MGA induced lipid and protein oxidative damage. HMG and MGA also increased 2',7'-dichlorofluorescein oxidation, whereas only HMG elicited nitric oxide production. Regarding the antioxidant defenses, both organic acids decreased reduced glutathione concentrations and the activities of superoxide dismutase and glutathione reductase and increased glutathione peroxidase activity. HMG also provoked an increase of catalase activity and a diminution of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. We finally observed that antioxidants fully prevented or attenuated HMG-induced alterations of the oxidative stress parameters, further indicating the participation of reactive species in these effects. We also observed that MK- 801, a non-competitive antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, prevented some of these effects, indicating the involvement of the NMDA receptor in the redox imbalance provoked HMG effects. Considering that astrocytes are important for neuronal protection and are susceptible to damage by neurotoxins the next step of this work was investigated the effects of HMG and MGA on important parameters of redox homeostasis and cytokine production in cortical cultured astrocytes. Both organic acids decreased astrocytic mitochondrial function withouth altering cell viability, and also decreased the concentrations of reduced glutathione. In contrast, they increased reactive species formation (DCFH oxidation) and also provoked a significant increase of IL-1, IL-6 and TNFα release through the Erk signaling pathway. Finally, we investigated the effects of HMG, MGA and MGT on the phosphorylation of GFAP and the neurofilaments (NF) subunits NFL, NFM and NFH in striatal and cortical slices. Our results demonstrated that HMG, MGA and MGT caused hypophosphorylation of GFAP and of all NF subunits in both cerebral structures. We also found that the HMG-induced hypophosphorylation on the cytoskeletal proteins was mediated by the inhibition of protein kinases without altering protein phosphatases. Thus, we demonstrated that PKA inhibition was involved in the hypophosphorylation of Ser55 in the amino terminal region of NFL, as well as JNK inhibition resulting in the hypophosphorylation of KSPrepeats in the carboxyl terminal region of NFM and NFH subunits. It was also observed that the cytoskeletal hypophosphorylation was dependent on synaptic and extra synaptic (NR2B subunit) NMDA glutamatergic receptors and also on Ca2+. Furthermore, the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, and the antioxidant TROLOX (polar analog of 5 vitamin E) fully prevented the hypophosphorylation and the inhibition of PKA and JNK activities caused by HMG. We can then presume that all these data provide solid evidence that oxidative stress induced by HMG and MGA in rat striatum and cortical cultured astrocytes, beyond of a inflamatory response verified in this neural cell type and an hypophosphorylation of cytoskeletal proteins could represent important pathomechanisms that contribute, at least in part, the cerebral alterations observed in the patients afected by the HL deficiency.

A provocação social é um método utilizado em animais de laboratório para a indução de elevados níveis de agressividade, produzindo padrões comportamentais semelhantes ao de indivíduos violentos. Estudos prévios utilizando drogas que atuam seletivamente sobre os receptores 5-HT1A e 5-HT1B demonstraram uma redução pronunciada no comportamento agressivo. Um dos mais importantes sítios de ação para esses agentes serotonérgicos é o córtex pré-frontal, uma região cerebral particularmente relevante no controle inibitório da agressividade e da impulsividade. O objetivo do presente estudo foi verificar os possíveis efeitos anti-agressivos da microinjeção de 8-OH-DPAT e CP-93,129 (agonistas específicos dos receptores 5-HT1A e 5-HT1B, respectivamente) na região ventro orbital do córtex pré-frontal de camundongos machos provocados socialmente. Para confirmar a especificidade do receptor, antagonistas 5-HT1A e 5-HT1B (WAY-100,635 e SB-224,289, respectivamente) também foram microinjetados na mesma região cerebral. 8-OH-DPAT na dose de 1.0 µg reduziu significativamente a freqüência de mordidas. A menor dose de CP- 93,129 (0.1 µg) também diminuiu o número de mordidas e de ataques laterais. Tais efeitos anti-agressivos não foram acompanhados por alterações no restante do repertório comportamental. A participação específica desses receptores foi verificada pela reversão dos efeitos com a utilização de WAY-100,635 (10.0 µg) e SB-224,289 (1.0 µg). Nossos resultados confirmam o envolvimento da região VO CPF e dos receptores 5-HT1A e 5-HT1B na modulação de altos níveis de agressividade, sem conseqüentes alterações em outras rotinas motoras. / Social instigation is used in rodents to induce high levels of aggression, a pattern of behavior similar to that of violent individuals. This procedure consists of a brief exposure to a provocative stimulus male, before direct confrontation with an intruder. Studies using 5- HT1A and 5-HT1B agonist receptors show a reduction in aggressive behavior. An important site of action for these drugs is the ventral orbito frontal cortex (VO PFC), an area of the brain which is particularly relevant in the inhibitory control of aggressiveness and impulsiveness. The objective of the present study was to assess the anti-aggressive effects of 5-HT1A and 5- HT1B agonist receptors (8-OH-DPAT and CP-93,129) on the VO PFC of socially provoked male mice. To confirm the specificity of the receptor, 5-HT1A and 5-HT1B antagonist receptors (WAY-100,635 and SB-224,289) were microinjected into the same area, in order to reverse the agonist effects. 8-OH-DPAT at 1.0 µg dose reduced the frequency of attack bites. The lowest dose of CP-93,129 (0.1 µg) also decreased the number of attack bites and lateral threats. The anti-aggressive effects were not accompanied by impairment of non-aggressive activities. Specific participation of the 1A and 1B receptors was verified by reversal of antiaggressive effects using selective antagonists WAY-100,635 (10.0 µg) and SB-224,289 (1.0 µg). In conclusion, the decrease in aggressiveness observed with microinjections of 5-HT1A and 5-HT1B receptor agonists into the VO PFC of socially provoked mice, supports the hypothesis that activation of these receptors modulates high levels of aggression in a behaviorally specific manner.

As deficiências da β-cetotiolase mitocondrial e da 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (MHBD) são erros inatos do catabolismo da isoleucina. Os pacientes afetados pela deficiência da β-cetotiolase apresentam crises agudas de cetose e acidose metabólica, podendo apresentar convulsões que podem evoluir ao coma e morte. Bioquimicamente, são caracterizados por excreção urinária aumentada de ácido 2-metilacetoacético (MAA), 2-metil-3-hidroxibutírico (MHB) e tiglilglicina (TG). Alguns indivíduos apresentam acidemia láctica durante as crises de descompensação metabólica. Por outro lado, os indivíduos afetados pela deficiência da MHBD são caracterizados por retardo mental, convulsões e acidose láctica severa, apresentando excreção urinária aumentada de MHB e TG. O aumento do ácido láctico em ambas as enfermidades sugere um comprometimento do metabolismo energético. Tendo em vista que os mecanismos fisiopatogênicos de ambas desordens são totalmente desconhecidos e que os achados bioquímicos sugerem um déficit na produção de energia dos pacientes, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do MAA e do MHB sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MAA inibiu a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato, indicando um bloqueio do ciclo do ácido cítrico. Em adição, o complexo II da cadeia respiratória bem como a enzima succinato desidrogenase foram inibidos na presença do MAA. Portanto, é possível que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição secundária do ciclo de Krebs. As enzimas Na+,K+-ATPase e creatina quinase (CK) não foram afetadas pelo MAA. O MHB inibiu a produção de CO2 a partir dos três substratos testados bem como o complexo IV da cadeia respiratória, sugerindo que a inibição da cadeia respiratória tenha levado à inibição da produção CO2 pelo ciclo de Krebs. A enzima Na+,K+- ATPase não foi afetada pelo ácido. No entanto, o MHB inibiu a atividade total da CK às custas da CK mitocondrial (mi-CK). A presença do inibidor da enzima óxido nítrico sintase L-NAME e do antioxidante glutationa reduzida (GSH) preveniram a inibição da atividade total da CK, enquanto que a GSH preveniu a inibição da mi-CK, sugerindo que os efeitos do MHB sobre a CK estejam relacionados à oxidação de grupamentos tióis essenciais à atividade enzimática. Tais resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro pelo MAA e pelo MHB. Caso estes achados se confirmem nas deficiências da β-cetotiolase e da MHBD, é possível que um prejuízo no metabolismo energético causado pelo acúmulo destes metabólitos possa explicar, ao menos em parte, o dano neurológico encontrado nos pacientes portadores destas doenças.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Statins are drugs used in dislipidemias treatment. These agents are reversible inhibitors of the rate-limiting enzyme in cholesterol biosynthesis,the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, and preventing de conversion of HMG-CoA to mevalonate. Besides reducing the plasma cholesterol, statins also present effects which seem cholesterol-independent, the so-called pleiotropic effects of statins. Date in literature has been shown that HMG-CoA inhibitors display neuroprotective properties, mainly related to improvement in vascular function due to increase in nitric oxide production, in this context, this class of drugs has proven usefull in treatment and prevention of neurodegenerative disorders such as Alzheimer´s and Parkinson´s. On the other hand, studies based on clinical data have shown that after abrupt discontinuation of statin therapy occurs a period in which the protective properties are lost, and deleterious effects are activated, leading to the appearance of rebound deterioration of vasculature which seems to be associated with alterations in enzymes activities endhotelial nitric oxide synthase and NADPH oxidase. However, little is known about whether these effects of statin withdrawal syndrome in the central nervous system. Therefore, this study aimed to investigate the effect of atorvastatin treatment withdrawal in the rat cerebral cortex. For this purpose, different parameters of oxidative/nitrosative stress were measured, including nitric oxide levels, the immunoreactivity for damage markers 3-nitrotyrosine, 4-hydroxynonenal and carbonyl, the activity of pro-oxidant enzymes NADPH oxidase and xanthine oxidase and the activity of antioxidant enzymes mitochondrial and citoplasmatic superoxide dismutase, catalase and glutathione-S-transferase. The results indicate that atorvastatin withdrawal decreases mitochondrial superoxide dismutase activity and increases NADPH oxidase activity, which may increase superoxide radical levels. Associated with this was seen a decreased in the level of nitric oxide ans increased in 3-nitrotyrosine immunoreactivity, suggesting that superoxide is reacting with nitric oxide leading the formation of peroxinitrite, which leads to proteins nitration. Increasing in the 3-NT/MnSOD ratio, and enzyme expression seen by western blot confirms the assumption that MnSOD is being nitrated, that nitration leads to lower superoxide detoxification. In conclusion, withdrawal of atorvastatin treatment occasioned oxidative/nitrosative damage in the rat cerebral cortex due to alterations in pro-oxidant and antioxidant enzymes activities. / As estatinas são fármacos utilizados no tratamento das dislipidemias. Esses agentes são inibidores reversíveis da enzima limitante da via de biossíntese do colesterol, a 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase, e impedem a conversão do HMG-CoA a mevalonato. Além da capacidade de diminuir o colesterol plasmático, as estatinas também possuem efeitos que são independentes da inibição da via de biossíntese do colesterol, são os chamados efeitos pleiotrópicos. Dados da literatura tem demonstrado que os inibidores da HMG-CoA redutase possuem propriedades neuroprotetoras, relacionadas à melhora na função vascular devido ao aumento da produção de óxido nítrico, neste contexto, essa classe de fármacos tem se mostrado útil no tratamento e na prevenção de doenças neurodegenerativas tais como, Alzheimer e Parkinson. Por outro lado, estudos baseados em dados clínicos mostram que a após a interrupção abrupta do tratamento com estatinas ocorre um período em que as propriedades protetoras geradas são perdidas, e efeitos deletérios são ativados, levando ao aparecimento de uma deterioração rebote na vasculatura, o qual parece estar associado a alterações na atividade das enzimas óxido nítrico sintase endotelial e NADPH oxidase. Contudo, até o momento, pouco se sabe sobre esse feito da síndrome da retirada da estatina no sistema nervoso central. Sendo assim, esse estudo teve por objetivo verificar o efeito da retirada do tratamento com atorvastatina no córtex cerebral de ratos. Para isso, diferentes parâmetros do estresse oxidativo/nitrosativo foram medidos, tais como a imunoreatividade para os marcadores de dano 3-nitrotirosina, 4-hidroxinonenal e carbonil, a atividade das enzimas pró-oxidantes NADPH oxidase e xantina oxidase e das enzimas antioxidantes superóxido dismutase mitocondrial e citoplasmática, catalase e glutationa-S-transferase, bem como, o nível de óxido nítrico medido através do nitrito e nitrato. Os resultados obtidos mostram que a retirada do tratamento provoca diminuição na atividade da superóxido dismutase mitocondrial aumento na atividade da NADPH oxidase, o que sugere estar ocorrendo aumento na quantidade de radical superóxido. Associado a isso, foi visto diminuição no nível de óxido nítrico e aumento na imunoreatividade para 3-nitrotirosina, o que sugere que o superóxido está reagindo com o óxido nítrico levando a formação de peroxinitrito. Este último provoca a nitração de proteínas. O aumento da razão 3-NT/MnSOD, e da expressão da enzima visto por western blot, comprova a suposição de que a superóxido dismutase mitocondrial está sendo nitrada, essa nitração leva a uma menor detoxificação do superóxido, de modo que assim, é formado um ciclo. Assim, conclui-se que a retirada do tratamento com atorvastatina provoca dano oxidativo/nitrosativo no córtex cerebral de ratos devido a alterações na atividade das enzimas pró e anti-oxidantes.

Com o aumento da expectativa de vida, estima-se um aumento na incidência de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA). Vários processos fisiopatológicos interligados estão envolvidos tanto no processo do envelhecimento, quanto na etiologia das desordens neurodegenerativas, como por exemplo, o estresse oxidativo e a neuroinflamação. Têm sido descrito que mecanismos epigenéticos podem estar relacionados com o processo de envelhecimento, ocasionando modificações na expressão gênica em diferentes regiões do cérebro, como por exemplo, a acetilação de histonas que é responsável em parte, pela transcrição gênica, sendo esse processo controlado por duas enzimas, a histona acetiltransferase (HAT) e a histona desacetilase (HDAC). A HAT é responsável por ocasionar um relaxamento da cromatina e com isso uma maior acessibilidade para o processo de transcrição gênica enquanto que a HDAC causa uma maior compactação da cromatina, resultando uma supressão na transcrição gênica. Considerando o papel da acetilação de histonas no processo de envelhecimento, em especial em doenças neurodegenerativas, tem sido sugerido o uso de estratégias que aumentem a acetilação com finalidade neuroprotetora como, por exemplo, o uso de inibidores de HDAC. Diversos estudos demonstram que os inibidores da HDAC são capazes de melhorar as funções cognitivas e a formação de memória. Nesse contexto, a curcumina, um composto polifenólico encontrado no açafrão (Curcuma longa) tem demonstrado ser capaz de atuar sobre os mecanismos epigenéticos, sendo sugerido como um potente inibidor da HDAC. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar o tratamento agudo com extrato etanólico de Curcuma longa sobre a atividade da enzima histona desacetilase em estruturas cerebrais, hipocampo e córtex frontal, de ratos Wistar. Ratos Wistar machos adultos (3 e 20 meses de idade) foram aleatoriamente distribuídos nos seguintes grupos: salina, veículo (DMSO), extrato etanólico de Curcuma longa 10mg/Kg e 50mg/Kg. A atividade da histona desacetilase (HDAC) foi mensurada após 2 e 18 horas da administração, utilizando kit de ELISA específico. A ANOVA de três vias indicou um efeito do tempo (F(1,71)=4.238,p=0.044) após a administração do extrato etanólico de Curcuma longa e um efeito da idade em hipocampos (F(1,71) =10.430, p=0.002), ou seja, animais com 20 meses apresentaram atividade maior da HDAC quando comparados com os animais de 3 meses de idade. Em córtex frontal, a ANOVA de três vias indicou um efeito da idade (F(1,75)=4.438,p=0.039) e uma interação entre idade e tempo (F(1,75)=1.765,p=0.001). Em ambas as estruturas analisadas, não houve efeito da administração com extrato de Curcuma longa. Nossos resultados demonstram que a atividade da histona desacetilase foi aumentada em ambas as estruturas testadas de ratos com 20 meses de idade, sugerindo que no processo de envelhecimento cerebral ocorra uma redução na acetilação de histonas, o que pode reduzir a transcrição gênica. Além disso, a atividade da HDAC parece ser influenciada pelo ritmo circadiano, uma vez que houve um efeito do tempo nos níveis da atividade da HDAC em ambas as estruturas analisadas. A atividade da HDAC foi maior no tempo de 18 horas (correspondendo ao período da manhã) quando comparado ao tempo de 2 horas, que corresponde ao turno da tarde, este dado pode estar relacionado à cronobiologia, onde a organização circadiana permite que o organismo mantenha a homeostase em resposta a variações diárias decorrentes do ambiente externo e do próprio organismo. Cabe descrever que os ratos Wistar são notívagos, onde o período da manhã é o início do período de sono; assim poderíamos sugerir uma redução da acetilação e consequentemente uma redução na expressão gênica nesse período. / With the increase of life expectancy, an increase in the incidence of neurodegenerative diseases, for example, the Alzheimer‟s disease (AD),is estimated. Several interconnected pathophysiological processes are involved both in the aging process and neurodegenerative diseases, oxidative stress and neuroinflammation. It has been described that epigenetic alterations may be related to the aging process, causing changes in gene expression in different regions of the brain, such as, histone acetylation (HAT), and histones deacetylases (HDAT). The HAT is responsible for causing a relaxation of chromatin and, thus, a better accessibility to the process of gene transcription, while HDAC causes further compactation of chromatin, resulting in gene transcription suppression. Considering the role of histone acetylation in the aging process, especially in neurodegenerative diseases, it has been suggested the use of strategies to increase the acetylation with neuroprotective purposes, such as, for example, the use of HDAC inhibitors. Several studies have shown that HDAC inhibitors are capable of improving the cognitive functions and memory formation. In this context, curcumin, a polyphenolic compound found in turmeric (Curcuma longa) has been shown to be capable of acting on epigenetic mechanisms, being suggested as potent inhibitor of HDAC. The aim of this work was to investigate the effect of acute treatment with ethanol extract of Curcuma longa on the activity of histone deacetylases enzymes in brain structures, hippocampus and frontal cortex of Wistar rats. Male Wistar rats (3 and 20 months old) were randomly distributed into four groups: saline, vehicle (DMSO), Curcuma longa ethanol extract (10mg/kg and 50mg/Kg.) The histone deacetylase (HDAC) activity was measured 2 and 18 hours after administration, using specific ELISA kit. The three-way ANOVA showed a time effect (F(1,71)=4.238,p=0.044) after the administration of Curcuma longa ethanol extract and an age effect in hippocampus (F(1,71)=10.430,p=0.002), that is, 20-months Wistar rats presented a higher HDAC activity when compared to 3-months Wistar rats. In frontal cortex, the three-way ANOVA showed an age effect (F(1,75)=4.438,p=0.039) and an interaction between age and time (F(1,75)=1.765,p=0.001). In both structures, there was no effect of Curcuma longa extract administration. Our results show that the activity of histone deacetylase was increased in both structures of 20-months Wistar rats, suggesting that in the brain aging process it occurs a reduction in histone acetylation, which can reduce gene transcription. Furthermore, as there was a time effect on the levels of HDAC activity in both analyzed structures, the HDAC activity may be influenced by the circadian rhythm. The HDAC activity was higher in 18 – hour period (corresponding to the morning period) as compared to 2 - hour period (corresponding to the afternoon period). This finding may be related to chronobiology, in which the circadian organization allows the body to maintain homeostasis in response to daily changes arising from the external environment and the body itself. It is important to highlight that Wistar rats are nocturnal creatures, having the morning as the beginning of the sleep period. So, they can present a reduction in acetylation and a consequent reduction in gene expression during this period.

A doença de Nicmann - Pick tipo C (DNPC) é uma desordem genética lisossomal neurodegenerativa causada pelo acúmulo de lipídios, principalmente colesterol, esfingomielina e glicoesfingolipídios no espaço perinuclear. U18666A é um agente inihidor no transporte de colesterol, que vem sendo utilizado em diversos modelos tanto in vivo quanto in vitro para mimificar DNPC, principalmente em fihrohlastos. Diversas doenças ncurodcgcncrativas estão associadas ao estresse oxidativo c acredita-se que radicais livres, produtos de lipoperoxidação e alterações na fluidez da membrana possam inibir a enzima Na+, K+-A TPase, levando a célula a um "déficit" energético. A deficiência de algumas proteínas como a GF AP parecem tornar os astrócitos menos eficientes em lidar com estados de injúrias no SNC, além de algumas pesquisas mostrarem um decréscimo na fosforilação de vimentina em fihrohlastos humanos com NPC. MK-801 é um receptor não competitivo de NMDA (N-mctil D-aspartato), sendo considerado um ncurotransmissor primário do cérebro. O objetivo desse estudo foi observar os efeitos da droga U 18666A, que causam o acúmulo de colesterol no citoplasma de astrôcitos de ratos jovens e a partir daí verificar a atividade de algumas hidrolascs lisossomais, parâmetros do estresse oxidativo, metabolismo energético e a hipelfosforilação de filamentos intermediários (GFAP e vimcntina) em astrócitos de ratos jovens. Através da coloração de Filippin c microscopia de fluorescência e através da utilização do CellM software, foi feita a visualização e quantificação do colesteroL A melhor dose de U18666A que permitiu o acúmulo de colesterol foi de 0,25 j..tg/mL em um período de incubação de 48 horas. Astrócitos de ratos incubados com a droga (DNPC) mostraram um significativo aumento de colesterol em relação aquelas culturas sem a droga. A medida da atividade da csfingomielinasc c enzimas beta-glicosidase em astrócitos de ratos com NPC foi significativamente menor do que astrócitos controle, o que é consistente com a atividade da DNPC humana. Verificando as alterações sofridas em nível de enzimas antioxidantcs c estresse oxidativo observamos que U 18666A leva a um aumento nos gmpos TBARS e Carbonil, porém a uma diminuição nos grupos tióis medidos por ensaios sulfidril. Além disso, ocorre um decréscimo na atividade de CAT e SOD e aumenta a produção de NO, ao analisarmos a atividade de Na+, K+ A TPase verifica-se um efeito inibitório na atividade dessa enzima. Os presentes resultados mostram que o acúmulo de colesterol nas culturas de células, induz o estresse oxidativo, o que indica que é potencialmente tóxico e confirma os resultados observados em outras doenças neurodegenerativas. Por fim, ao utilizarmos 4 grupos diferentes, fazendo uso ou não da droga c do MK-801 verificou-se que com o acúmulo de colesterol nas células ocorre uma hiperfosforilação dos Filamentos Intermediários, tanto de GFAP quanto de vimentina, porém o MK-801, sendo um antagonista de NMDA e agindo sobre os receptores de glutamato demonstram inibirem a cxcitotoxicidadc provocada pelo Ul8666A. Além dos parâmetros que foram testados em nosso trabalho, como extresse oxidativo, enzimas antioxidantcs c metabolismo energético, fazendo uso da droga para minriticar NPC, outros parâmetros bioquímicas das células, os quais ainda não foram testados em nossos estudos, podem ser testados com este modelo animal, contribuindo assim para uma melhor compreensão da doença. Podemos fazer uso ainda de substâncias que diminuam a excitotocicidade causada pelo aumento do colesterol, observados na NPC, a exemplo do antagonista do receptor NMDA, MK-801, podendo se tomar ferramentas viáveis para auxiliar no tratamento de doenças ncurodcgcncrativas relacionadas a cxcitotocicidadc glutamatérgica. / The Niemann - Pick type C (NPC) is a disorder genetic neurodegenerative caused by lysosomal accumulation of lipids, cspccially cholcstcrol, sphingomyclin and glycosphingolipids in the perinuclear space. U 18666A is an inhibitory agent in choiesteroi transport, which has heen used in several models hoth in vivo and in vitro to mimificar NPC, cspccially in fibroblasts. Various ncurodcgencrativc discases are associatcd with oxidative stress and it is believed that the free radicais, lipid peroxidation products and changes in membrane fluidity may inhibit the enzyme Na+, K + -ATPase, causing the cell suftcring a dcficit of cncrgy. Thc dcficiency of ccrtain protcins as GFAP sccm to makc astrocytes iess efficient in dealing with states of injury in the CNS, and some research shows a decrease in phosphorylation of vimentin in human fibroblasts with NPC. MK-801 is a noncompctitive NMDA receptor, bcing considercd a primary ncurotransmitter. Thc ohjective of this study was to observe the effects of U 18666A drug, eausing the accumulation of cholcstcrol in thc eytoplasm of young rat astrocytcs and thus verify thc activity of some lysosomai hydroiases, oxidative stress parameters, energy metabolism and hyperphosphorylation of intermediate filaments (vimentin and GFAP) in astrocytes of young rat. Through Filippin staining and fluorescence microscopy and by using the software Cel!M was made visualization and quantitation of cholesterol. The hest dose U18666A which allowed thc aceumulation of cholcstcrol was 0.25 mg I mL in a 48 hour period of incubation. Rat astrocytes (NPC) incubated with the drug showed a significant increase in total cholesterol relative to the cultures without drug. The measure of activity of sphingomyclinase and bcta-glucosidasc enzymes in rat astroeytcs NPC was signiticantly lower than contrai astrocytes, which is consistent with the activity of the human NPC. Noting the changcs suftcred in thc levei of antioxidant enzymcs and oxidativc stress U 18666A observed that ieads to an increase in TBARS and carbonyl groups, but a decrease in the thiol groups as measured by sulfl1ydryl tests. Moreover, there is a decrease in SOD and CAT activity and incrcascs the production of NO, by analyzing thc activity ofthe Na+, K + -ATPase there is an inhibitory effect on this enzyme. The present results show that the accumulation of cholesterol in cell cultures induces oxidative stress, which indicates that it is potcntially toxic, confirming the results observed in othcr ncurodcgcnerative discascs. Finally, we used four different groups, with or without the use of the dmg MK-801, and found that the accumulation of cholesterol in cells leads to hyperphosphorylation FI both GFAP and vimcntin, howcver, MK-801, an NMDA antagonist acts on the glutamatc receptor, and inhibit excitotoxicity caused by U 18666A. Besides the parameters that were tcstcd in our study, as oxidative stress, antioxidant cnzymcs and encrgy mctabolism, causing the dmg to mimificar NPC other biochemical parameters of the cells, which were not tested in our study may he tested with this model animal, thus contributing to a better undcrstanding of thc diseasc. Wc can still makc use of substances that rcduec thc excitotocicidade caused by increased choiesteroi, observed in NPC, such as the NMDA receptor antagonist, MK-801, which can hecome viahle tools to aid in the treatment of ncurodcgcnerativc diseascs rclatcd to cxcitotoeicidadc glutamatcrgic.

O receptor canabinoide CB1, altamente expresso em várias regiões do sistema límbico, possui um importante papel na regulação da plasticidade sináptica implicada nas diferentes fases da memória emocional. Em roedores, embora já estejam bem caracterizados os efeitos da manipulação farmacológica do receptor CB1 na amígdala, no hipocampo e no córtex pré-frontal medial sobre a modulação de memórias aversivas, sua função no córtex retrosplenial (RSC) permanece desconhecida. Neste trabalho, usando o paradigma pavloviano de condicionamento aversivo ao contexto em ratos, exploramos o papel do sistema canabinoide no RSC sobre as fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória. Demostramos que a infusão intra-RSC imediatamente pós-treino de AM251 (11 μg/μL), um antagonista seletivo CB1, causa amnésia retrógrada no teste de retenção da memória conduzido 48 h após o condicionamento, enquanto que a infusão bilateral de CP55940, um agonista canabinoide CB1/CB2 (5μg/μL), facilita a consolidação da memória. No protocolo de reconsolidação (injeção intra-RSC após uma sessão de reativação de 4 min, conduzida 48 h depois do condicionamento) foram encontramos efeitos opostos no teste de retenção da memória realizado 24 h após a reativação: o bloqueio dos receptores CB1 facilita, enquanto que sua ativação prejudica o fenômeno de reconsolidação da memória. Além disso, quando o AM251 é injetado intra-RSC 20 min antes de uma reexposição prolongada (de 30 min), observamos que a consolidação da memória de extinção é prejudicada, enquanto que o CP55940 acelera a extinção e impede sua recuperação espontânea ao longo do tempo. Concluindo, nossos resultados apresentam novas evidências sobre a função do sistema canabinoide no RSC sobre a modulação das fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória emocional. / The CB1 cannabinoid receptor is highly expressed in many regions of the limbic system, having an important role in the regulation of synaptic plasticity implicated in different phases of emotional memory processing. In rodents, although are well characterized the effects of the pharmacological manipulations of the CB1 receptor in the amygdala, hippocampus, and medial prefrontal cortex upon the modulation of aversive memories, their function in the retrosplenial cortex (RSC) remains unknown. In this study, using pavlovian contextual fear conditioning in rats, we explored the role of the cannabinoid system in the RSC on memory consolidation, reconsolidation, and extinction. We showed that posttraining intra-RSC infusion of AM251 (11 μg/μL), a selective CB1 antagonist, causes retrograde amnesia during the test for memory retention conducted 48 h after learning, whereas the bilateral infusion of CP55940 (5 μg/μL), a CB1/CB2 agonist, enhanced fear memory consolidation. In the reconsolidation protocol (postreactivation intra-RSC infusions conducted 48 h after training) we found opposite effects in the test session performed 24 h after memory reactivation: blocking CB1 receptors enhanced, whereas the activation of cannabinoid receptors impaired memory reconsolidation. Furthermore, when AM251 was infused intra-RSC 20 min before a prolonged reexposure (30 min), memory extinction was impaired, whereas the infusion of CP55940 accelerates memory extinction and prevents spontaneous recovery, maintaining memory extinguished over time. In conclusion, these data shed new light about the function of the cannabinoid system in the RSC on the role of contextual-fear related memory consolidation, reconsolidation, and extinction.