CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / EmbriogÃnese SomÃtica à o processo pelo qual, tecidos somÃticos vegetais dÃo origem a embriÃes de plantas sob condiÃÃes indutivas. A embriogÃnese somÃtica à atualmente a ferramenta mais empregada para a propagaÃÃo de plantas em escala comercial. Recentemente foram identificados alguns genes envolvidos no processo. Alguns desses genes estÃo envolvidos com a manutenÃÃo do meristema, outros estÃo envolvidos com a formaÃÃo de padrÃo. Existem genes que quando expressos ectopicamente podem induzir a formaÃÃo de embriÃes somÃticos. Existem poucos trabalhos na literatura sobre a embriogÃnese somÃtica em feijÃo-de-corda. AlÃm disso, esses trabalhos apresentam uma freqÃÃncia de regeneraÃÃo pequena e um complicado sistema de regeneraÃÃo que envolve muitas etapas. O objetivo deste trabalho foi isolar linhagens de calos embriogÃnicos de feijÃo-de-corda e estabelecer as condiÃÃes de cultivo ideais para estes calos. AnÃlises histolÃgicas foram utilizadas para a caracterizaÃÃo anatÃmica das linhagens de calos isolados. Das 4 linhagens de calos isolados trÃs apresentam cÃlulas com caracterÃsticas de cÃlulas embriogÃnicas, sendo que apenas a linhagem 2 deu origem a estruturas embriogÃnicas em suspensÃo celular. Essas linhagens de calos foram subcultivadas por mais de um ano sem perder as suas caracterÃsticas. Os experimentos de crescimento das suspensÃes celulares mostraram que as suspensÃes devem ser subcultivados em perÃodos de 5 dias. Os prÃximos trabalhos que envolvam a regeneraÃÃo em feijÃo-de-corda devem trabalhar com essa linhagem de calo facilmente isolÃvel e altamente estÃvel em cultura. / Somatic embryogenesis is the process by which somatic plant tissues gives rise to plant embryos under inductors conditions. Somatic embryogenesis represents the most commonly employed tool in commercial propagation of plants. In recent times, genes involved in the process have been identified, partucularly those involved in the maintenance of meristems and pattern formation. There are genes which, when ectopically expressed, can induce the formation of somatic embryos. In cowpea, there are few reports on somatic embryogenesis. In addition, the reports on the process recorded a very low frequency and a complicated system of regeneration involving several steps. This work attempted to isolate callus lines of cowpea and establish an ideal culture condition necessary for their maintenance. Histological analysis was conducted to characterize the isolated lines of callus anatomically. From the four lines obtained, 3 presented cells exhibiting the charactersitc embryogenic potential and of this, Line 2 actually gave rise to embryogenic structures when cultured in liquid media. The lines of callus were maintained in cultured condition for over a year without loss of their characteristics. Experiments that monitored the growth of cell suspension from the callus revealed that five days is the best period for subculture of the cells. Regeneration experiments in cowpea will find the different callus lines isolated in this work useful in the attempt to optimize the different strategies of regeneration of the crop in vitro.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

A teca (Tectona grandis L. f) é uma espécie lenhosa originária da Ásia que possui grande interesse econômico devidos as características nobres de sua madeira. Muito usada para construção de embarcações e móveis de luxo para exposição em ambientes abertos, seu consumo tem aumentado a cada ano, principalmente nos países produtores. Com a pressão das políticas ambientais sobre o uso da madeira de espécies nativas, a teca se mostra uma ótima alternativa para o mercado de madeira serrada. Contudo, a produção comercial desta espécie encontra algumas barreiras, sendo a principal delas, a propagação de matrizes adultas cujas características se adequam ao manejo silvicultural. Para possibilitar a reprodução fiel das árvores selecionadas e, para se realizar o rejuvenescimento do material adulto procedente dessas matrizes, faz-se uso de algumas técnicas, sendo uma delas, o uso da cultura de tecidos. Uma maneira bastante considerada no processo de rejuvenescimento e obtenção de mudas de espécies agrícolas e florestais é a formulação de protocolos de embriogênese somática. A embriogênese somática pode ser descrita como o processo pelo qual células somáticas desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma sequência ordenada de estágios embriogênicos característicos, sem ocorrência de fusão de gametas. Para tanto, o desenvolvimento de um protocolo eficiente de tal técnica exige muitos estudos preliminares. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a calogênese em diferentes explantes de teca, através de uma sequência de indução utilizando difrentes fitorreguladores visando a obtenção de embriões somáticos. Para avaliar a resposta dos calos a cada etapa da indução foram realizadas análises histológica e histoquímica dos tecidos. Como respostas foram encontrados os balanços auxina/citocinina mais adequado para produção de calos, sendo eles 1,5/1,0 e, 1,5/4,0mgL-1 de picloram e BAP respectivamente. Verificou-se que o pulse com TDZ foi responsivo na obtenção de massas próembriogênicas, e que o uso da zeatina e da glutamina, não favorecem a maturação de tais estruturas, além de ocasionarem a morte celular programada das células da massa calosa. Contudo, os resultados mostram-se positivos e auxiliam na formulação de novos tratamentos e técnicas de indução da embriogênese somática para a espécie estudada. / Teak (Tectona grandis L. f) is a native woody species from Asia that has great economic interest due the noble characteristics of its wood. Widely used for building ships and luxury furniture for display outdoors, their consumption has increased every year, especially in producing countries. With the pressure of environmental policies on the use of native species of wood, teak shown a great alternative to the market for lumber. However, commercial production of this species has some barriers, the main one, being the propagation of mature breeders whose characteristics are suited to forestry management. In order to enable the faithful reproduction of the selected trees, and to perform the rejuvenation of these matrices derived of adult material, some techniques can be used, one of them is the use of tissue culture. Considered in a way quite rejuvenating and seedlings of agricultural and forest species process is the formulation of somatic embryogenesis protocols. Somatic embryogenesis can be described as the process by which somatic cells develop structures similar to zygotic embryos, through an ordered sequence of characteristic embryogenic stages without occurrence of the fusion of gametes. Thus, the development of an efficient protocol for this technique requires a lot of preliminary studies. Thus, the present work aimed to study the callus induction in different explants of teak, through a sequence induction using different growth regulators in order to obtain somatic embryos. To assess the response of each stage during callus induction, histological and histochemical tissue analysis were performed. Responses as the most suitable for callus production auxin / cytokinin balance sheets were found, they 1.5 / 1.0 and 1.5 / 4,0mgL-1 picloram/BAP, respectively. It was found that TDZ pulse was responsive to obtain pro-embryogenic masses, and that the use of zeatin and glutamine, are not conducive to maturation of such structures, and enacting the programmed cell death of the cell calli mass. However, the results show up positive and assist in the formulation of new treatments and techniques for induction of somatic embryogenesis of this species.

A cana-de-açúcar é um dos cultivos mais importantes no Brasil. Estima-se que uma parte do nitrogênio total de algumas variedades de cana-de-açúcar seja obtida pela interação com microrganismos endofíticos diazotróficos. Na maior parte de sua vida, os endofíticos habitam o interior de plantas sem causar nenhum sintoma aparente de doença. O estudo de interação microrganismos/plantas foi realizado utilizando-se co-culturas entre bactérias endofíticas diazotróficas e calos de cana-de-açúcar. Em presença do calo: Enterobacter sp. ICB113, ICB117 e ICB481 foram estimuladas e mantidas em elevadas populações; Klebsiella sp. ICB375 e Pseudomonas sp. ICB383 tiveram seu número reduzido e mantiveram-se em números estáveis; e Pantoea sp. ICB409 foi totalmente eliminada, demonstrando, assim, que a planta exerce um controle sobre os microrganismos. O modelo calo de cana-de-açúcar/bactéria endofítica diazotrófica foi capaz de evidenciar diferentes interações entre vegetal e bactéria, assim como, diferentes níveis de resposta de defesa da célula vegetal. / The sugarcane is one of the most important crops in Brazil. It is estimated that a portion of the total nitrogen of some varieties of sugarcane is obtained by interaction with diazotrophic endophytic microorganisms. In most of his life, the endophytes inhabit the interior of plants without causing any obvious signs of disease. The interaction study microorganisms/plants was performed using co-cultures among endophytic diazotrophic bacteria and sugarcane calluses. In the presence of callus : Enterobacter sp . ICB113 , ICB117 and ICB481 were stimulated and maintained in large populations ; Klebsiella sp . ICB375 and Pseudomonas sp. ICB383 had their numbers reduced and remained in stable numbers, and Pantoea sp. ICB409 was completely eliminated, thus demonstrating that the plant has a control over microorganisms. The model sugarcane callus/endophytic diazotrophic bacteria was able to show different interactions between plants and bacteria , as well as different levels of defense response of the plant cell.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-07T17:17:10Z No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:17:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) Previous issue date: 2007-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The somatic embryogenesis is a technique of plant tissue culture with several application potentials, as in the clonal propagation of plants, in the regeneration of transformed cells and in the basic studies of the molecular, biochemical and morphologic events that happen duringthe embryogenesis. In spite of the several works reporting somatic embryogenesis in cotton, several problems still persist in the regeneration through embryogenesis. The most of the works is with the line cocker, due to the fact of the cotton to be recalcitrant for the somatic embryogenesis. This way, the present study was conceived with the intention of analyzing the morphogenic response of the cotton to several growth regulators and stressful agents during the induction of embryogenic callus and somatic embryos, correlating the callus production with the antioxidant enzymes expression. For induction of the embryogenic callus, hypocotyl of germinated cotton (BRS – 187 – 8H) surface-sterilized seeds was used. The embriogenic callus induction medium (MICE) consisted of the MSB medium with different combinations and concentrations of 2,4-D, Kinetin, 2iP and Picloram. For conversion of embryogenic callus, it was used the embryo induction medium (MIE) that consistes of MSB medium and MSB supplemented with zeatin; L-glutamine, asparagine; espermine, espermidine or different concentrations of NH4NO3 and KNO3. The results show that among the MICE tested, the medium with 0,1 mg L-1 2,4-D and 0,3 mg L-1 Kinetin (MSB1 medium) and the MCIM medium showed the largest average in the production of embryogenic callus by explant. Explants in the MIE-1 presented the best proliferation of the embryogenic callus. However, the formation of globular and embryogenic structures was only visualized in the embryogenic callus formed in MSB1 medium, which were transferred for MSB medium and subcultivated in MIE-4 medium. It was concluded that different growth regulators can induce the formation of embryogenic callus in cotton cultivar BRS – 187 – 8H and the suppression of the growth regulators favors the appearance of globular and pre-embryogenic structures. In the experiments of the influence of the stress in cotton callus formation and the isozymic antioxidant system expression, it was used for induction of embryogenic callus, thecombination of MSB and MSB1 medium with two concentrations of FeEDTA: the concentration standard of the MS medium; and a concentration five times larger. It wasestablished three regimes of luminous intensity: darkness; 3,4 Klx and 6,0 Klx. Embryogenic callus were obtained on the MSB1 (3,4 Klx), MSB1 (6,0 Klx) and MSB1+FeEDTA (5X) medium. The electrophoretic system of the catalase and peroxidase showed variation in the intensity of the bands. The results show that the embryogenic callus formation dependent of the action of growth regulators and of the light presence, and the isozymic standards of catalase and peroxidase present similar pattern and they are related with the embryogenic aspect of the calluses. / A embriogênese somática é uma técnica de cultura de tecidos vegetais com diversos potenciais de aplicação, como na propagação clonal de plantas, na regeneração de células transformadas geneticamente e nos estudos básicos dos eventos moleculares e bioquímicos e morfológicos que ocorrem durante a embriogênese. Apesar dos diversos trabalhos relatando embriogênese somática em algodão, vários problemas ainda persistem na regeneração via embriogênese e a maioria dos trabalhos é com a linha cocker, devido a recalcitrância do algodão a embriogênese somática. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de analisar a resposta morfogênica do algodão a vários reguladores de crescimento e agentes estressantes durante a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos, correlacionando a calogênese com a expressão de isoformas do sistema antioxidativo. Para indução dos calos embriogênicos utilizou-se sementes desinfestadas da cultivar de algodão BRS – 187 – 8H. Os meios de indução de calos embriogênicos (MICE) utilizados consistiram no meio MSB acrescido de varias combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 2,4-D; Cinetina, Picloram e 2-iP. Já para conversão dos calos embriogênicos em embriões, utilizouse o meio de indução de embiões (MIE) que consiste no meio MSB e MSB acrescido dezeatina, ou diferentes concentrações de NH4NO3 e KNO3, ou acrescido de L glutamina; asparagina; espermina; espermidina. Os dados obtidos mostram que entre os MICE testados, o meio contendo 0,1 mg L-1 de 2,4-D e 0,3 mg L-1 de cinetina (meio MSB1) e o meio MCIM mostraram as maiores médias na produção de calos embriogênicos por explante. Entre os MIE, o MIE-1 apresentou melhor proliferação dos calos embriogênicos. Contudo, a formação de estruturas globulares e embriogênicas só foi visualizada nos calos embriogênicos formados em meio MSB1 e transferidos para meio MSB e subcultivados em meio MIE-4. Concluiu-se então que diferentes reguladores podem induzir a formação de calos embriogênicos na cultivar BRS – 187 – 8H, e a supressão dos reguladores de crescimento favorece o surgimento de estruturas globulares e pré-embriogênicas. Nos experimentos da influência do estresse na calogênese e a expressão de isoenzimas do sistema antioxidativo, utilizou-se para a induçãode calos embriogênicos a combinação do meio MSB e MSB1 com duas concentrações de FeEDTA: a concentração padrão do meio MS; e uma concentração cinco vezes maior. E foiestabelecido três regimes de intensidade luminosa: escuro; 3,4 Klx e 6,0 Klx. Calos embriogênicos foram obtidos nos meios MSB1(3,4 Klx), MSB1(6,0 Klx) e MSB1+FeEDTA(5X). Analises de eletroforese de isoenzimas da catalase e peroxidase mostraram variação na intensidade das bandas. Os resultados obtidos permitiram concluir que formação de calos embriogênicos é dependente da ação de reguladores de crescimento e da presença de luz, e que as isoformas de catalase e peroxidase apresentam padrão similar e estão relacionadas com o aspecto embriogênico dos calos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 μM methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of β-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 μg.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of β-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881362 bytes, checksum: 0e498263c87a06e3c091110afa80ddfe (MD5) Previous issue date: 2012-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Tissue culture techniques are often associated with the occurrence of somaclonal variation, characterized by a genetic/epigenetic alteration found in cells, embryos, organs or in vitro grown plants, due to stress conditions imposed by the system. The propagation process involving the calogenesis step has a higher susceptibility to variation, because of many cell divisions. Calli are disorganized cell masses, whose cells divide at different rates depending on where they are located in relation to the culture medium, therefore, they are not considered homogeneous materials. Flow cytometry is a tool that has been used to evaluate the competence of somatic embryogenesis in callus, both to identify the different types as possible and to detect early changes in DNA content of their cells. However, there are no reports in the literature of the flow cytometry use to determine the existence of heterogeneity in relation to the DNA content in callus. In this perspective, the present work adapted this methodology for friable Passiflora cincinnata calli in order to verify the existence of vertically regionalized heterogeneity in relation to DNA ploidy level, and relate it to factors inductors of somaclonal variation, such as cultivation time and subculture numbers. Initially, P. cincinnata cotyledonary leaves were inoculated onto semi-solid medium containing 2, 4-D and BA, for friable embryogenic callus induction. The calli were multiplied and subcultured at different times, thus generating three callus types: new, intermediate and old. Twenty calli of each type were subjected to sagittal cuts resulting two layers (I, II) in new calli, and three layers (I, II and III) in intermediate and old calli, totalizing 160 layers, which were analyzed by flow cytometry. Six different DNA ploidy levels and multiploidies were detected in the layers. In new calli, 25% were heterogeneous, i.e. at least one callus layer showed different DNA ploidy level from the others, differently from intermediate and old calli, which 75% and 63% were heterogeneous, respectively. The homogeneous new calli were predominantly diploid. The highest DNA ploidy levels were observed in the layers in contact with the culture medium on intermediate calli, and 4C and 4C/8C cells were more evident in older calli. These observations suggest that the appearance of new DNA ploidy levels between the layers and between the different callus types is related to the exposure time to the medium containing relatively high concentration of 2,4-D. It was also possible to verify that the layer in contact with the culture medium is more proliferative when compared the percentages of the G2 peaks in homogeneous diploid calli. The heterogeneity in DNA ploidy level between the layers was observed, and it implies that parts of a callus cannot infer about a whole callus. This work suggests that time influences the appearance of different DNA ploidy levels in calli induced in vitro. / Técnicas de cultura de tecidos estão frequentemente associadas com a ocorrência de variação somaclonal, caracterizada pela alteração genética e/ou epigenética encontrada em células, embriões, órgãos ou plantas cultivadas in vitro, em decorrência das condições de estresse impostas pelo sistema. O processo de propagação que envolve a etapa de calogênese apresenta maior susceptibilidade à ocorrência de variação, em função das inúmeras divisões celulares. Calos são massas celulares não organizadas, cujas células se dividem a diferentes velocidades dependendo de onde se localizam em relação ao meio de cultura; portanto, não são considerados materiais homogêneos. A citometria de fluxo é uma ferramenta que tem sido utilizada para avaliar a competência da embriogênese somática em calos, tanto para identificar seus diferentes tipos quanto para detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA de suas células. No entanto, não há relatos na literatura da utilização da citometria de fluxo para verificar a existência da heterogeneidade quanto ao conteúdo de DNA em calos. Nesta perspectiva, o presente trabalho adaptou essa metodologia para calos friáveis de Passiflora cincinnata, a fim de verificar a existência de heterogeneidade verticalmente regionalizada, em relação à ploidia de DNA, e relacioná-la com fatores de indução de variação somaclonal, como tempo de cultivo e número de subcultivos. Inicialmente, folhas cotiledonares de P. cincinnata foram inoculadas em meio semissólido contendo 2,4-D e BA, para indução de calos embriogênicos friáveis. Os calos foram multiplicados e subcultivados em diferentes tempos, gerando, assim, três tipos de calos, denominados como novos, intermediários e velhos. Vinte calos de cada tipo foram submetidos a cortes sagitais que resultaram duas camadas (I e II) em calos novos, e três camadas (I, II e III) em calos intermediários e velhos, totalizando 160 amostras que foram analisadas por citometria de fluxo. Seis diferentes ploidias de DNA e multiploidias foram detectadas nas camadas. Em calos novos, 25% deles foram heterogêneos, ou seja, pelo menos uma camada apresentou nível de ploidia de DNA diferente das demais, diferentemente dos calos intermediários e velhos, os quais 75% e 63% foram heterogêneos, respectivamente. Os calos novos homogêneos foram predominantemente diploides. As ploidias de DNA mais altas foram observadas nas camadas em contato com o meio de cultura em calos intermediários, e células 4C e 4C/8C foram mais evidentes em calos velhos. Essas observações sugerem que o surgimento de novos níveis de ploidia entre as camadas e entre os calos de diferentes tipos está relacionado com o tempo de exposição ao meio contendo concentração relativamente alta de 2,4-D. Foi possível, também, verificar que a camada em contato com o meio é mais proliferativa quando se comparou os percentuais dos picos G2 de calos diploides homogêneos. A heterogeneidade quanto ao nível de ploidia de DNA entre as camadas foi constatada e isto implica que partes de um calo não podem inferir sobre um calo inteiro. Esse trabalho sugere que o tempo influenciou o surgimento de diferentes ploidias de DNA em calos induzidos in vitro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 μM, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de β-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 μg.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de β-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 μM methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of β-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 μg.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of β-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

A cana-de-açúcar é um dos cultivos mais importantes no Brasil. Estima-se que uma parte do nitrogênio total de algumas variedades de cana-de-açúcar seja obtida pela interação com microrganismos endofíticos diazotróficos. Na maior parte de sua vida, os endofíticos habitam o interior de plantas sem causar nenhum sintoma aparente de doença. O estudo de interação microrganismos/plantas foi realizado utilizando-se co-culturas entre bactérias endofíticas diazotróficas e calos de cana-de-açúcar. Em presença do calo: Enterobacter sp. ICB113, ICB117 e ICB481 foram estimuladas e mantidas em elevadas populações; Klebsiella sp. ICB375 e Pseudomonas sp. ICB383 tiveram seu número reduzido e mantiveram-se em números estáveis; e Pantoea sp. ICB409 foi totalmente eliminada, demonstrando, assim, que a planta exerce um controle sobre os microrganismos. O modelo calo de cana-de-açúcar/bactéria endofítica diazotrófica foi capaz de evidenciar diferentes interações entre vegetal e bactéria, assim como, diferentes níveis de resposta de defesa da célula vegetal. / The sugarcane is one of the most important crops in Brazil. It is estimated that a portion of the total nitrogen of some varieties of sugarcane is obtained by interaction with diazotrophic endophytic microorganisms. In most of his life, the endophytes inhabit the interior of plants without causing any obvious signs of disease. The interaction study microorganisms/plants was performed using co-cultures among endophytic diazotrophic bacteria and sugarcane calluses. In the presence of callus : Enterobacter sp . ICB113 , ICB117 and ICB481 were stimulated and maintained in large populations ; Klebsiella sp . ICB375 and Pseudomonas sp. ICB383 had their numbers reduced and remained in stable numbers, and Pantoea sp. ICB409 was completely eliminated, thus demonstrating that the plant has a control over microorganisms. The model sugarcane callus/endophytic diazotrophic bacteria was able to show different interactions between plants and bacteria , as well as different levels of defense response of the plant cell.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andressa_reis.pdf: 1497210 bytes, checksum: 3cf7185be01a988c5b3fa63e14d8a302 (MD5) Previous issue date: 2013-08-19 / A characteristic of plants and other sessile organisms is their ability to synthesize a wide variety of low molecular weight compounds, called secondary metabolites. Among these compounds are the betalains, hydrophilic molecules of two types: red-violet betalains and yellow betaxanthins. These phytochemicals have been widely used because of their high antioxidant activity and free radicals scavenging. The light intensity and quality are important factors in plant growth and development and specific changes in light quality severely affect physiological, morphological and biochemical plant parameters. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effect of light quality on growth and accumulation of secondary metabolites from callus and plant species of the genus Alternanthera, as well as a protocol establishment for callus induction of these plants. The species A. brasiliana, A. philoxeroides and A. sessilis had their explants placed on MS medium with different combinations of growth regulators. In the experiment of callus induction only plants of A. brasiliana were used, which were maintained for 45 days of culture under white light and in the second experiment, with the induction protocol already established, were used the three species of Alternanthera and the callus maintained in culture for 40 days under different light qualities (blue , white and red). The analysis to quantify betacyanin in HPLC-MS on experiment in A. brasiliana callus confirmed that they have expressive content of amaranthin and on calluses of different species experiment, the best response was observed in A. brasiliana plants and the internodes were considered the best explants. Studies of callus in different light qualities demonstrated that blue light induces the production of glycosylated betacyanin and betaxanthins. Thus, it is concluded that the quality of light significantly affects the biosynthesis of betacyanin, betaxanthins and flavonoids, as well as the growth patterns of Altemanthera plants. / Uma característica de plantas e outros organismos sésseis é a sua capacidade de sintetizar uma enorme variedade de compostos de baixo peso molecular, chamados de metabólitos secundários. Dentre estes compostos, encontram-se as betalaínas, moléculas hidrofílicas de dois tipos: betalaínas vermelho-rosáceas e betaxantinas amarelas. Esses fitoquímicos têm sido amplamente utilizados devido as suas elevadas atividades antioxidantes e eliminadora de radicais livres. A intensidade e qualidade de luz são fatores importantes no crescimento e desenvolvimento vegetal e mudanças específicas na qualidade de luz afetam severamente os parâmetros fisiológicos, morfológicos e bioquímicos das plantas. Dessa maneira o presente trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da qualidade de luz no crescimento e acúmulo de metabólitos secundários de calos e plantas de espécies do gênero Alternanthera, assim como o estabelecimento de um protocolo para indução de calogênese destas plantas. As espécies A. brasiliana, A. philoxeroides e A. sessilis tiveram seus explantes, colocadas em meio MS, com diferentes combinações de reguladores de crescimento. No experimento de indução de calogênese foram utilizadas somente plantas de A. brasiliana, as quais foram mantidas por 45 dias de cultivo sob luz branca e no segundo experimento, já com o protocolo de indução estabelecido, foram utilizadas as três espécies de Alternanthera e os calos mantidos por 40 dias em cultivo sob diferentes qualidades de luz (azul, branco e vermelho). As análises de quantificação das betacianinas em HPLC-MS no experimento com calos de A. brasiliana confirmaram que estes apresentam conteúdo expressivo de amarantina e no ensaio com calos de diferentes espécies, a melhor resposta foi observada em plantas de A. brasiliana e os entrenós foram considerados os melhores explantes. Os estudos de calos em diferentes qualidades de luz demonstraram que a luz azul induz a produção de betaxantinas e betacianinas glicosiladas. Dessa forma, conclui-se que a qualidade de luz afeta sensivelmente a biossíntese de betacianinas, betaxantinas e flavonoides, assim como os padrões de crescimento em plantas de Alternanthera.