Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine and human pathogen causing meningitis and septicemia. Recent studies suggest that S. suis possesses several virulence factors, including the capsular polysaccharide, which enable this pathogen to modulate dendritic cell (DCs) functions. DCs are key immune cells that bridge innate and adaptive immunity. Moreover, the difficulties in developing an effective vaccine suggest that S. suis interferes with the T-cell dependent response. The main objective of the project was to evaluate the effect of S. suis on CD4+ T-cell activation, as well as on the antigen presentation ability of DCs. We investigated the CD4+ T-cell memory response in an in vivo mouse model. A poor central memory response was obtained following primary and secondary infections with S. suis, thus suggesting that the adaptive immune response against this pathogen is limited. The major histocompatibility complex (MHC) class II is central to the antigen presentation pathway. We thus investigated in vitro and in vivo the expression of these molecules on DCs. We observed a modulation in the expression of MHC-II by S. suis. Transcriptional analysis of genes involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of MHC-II suggests that S. suis downregulates synthesis of MHC-II molecules and promotes their lysosomal degradation. This strategy, in which the CPS would play only a partial role, might allow S. suis to evade the T-cell dependent adaptive response. Overall, these results provide new insights into the comprehension of the adaptive immune response during the infection by S. suis.

Hintergrund: Die Funktion von Immunzellen hängt von einer konstanten und ausreichenden Energieversorgung ab, die über die OXPHOS in den Mitochondrien und die Glykolyse im Zytosol realisiert wird. Die wichtigsten Substrate dafür sind Sauerstoff und Glukose. Fragestellung: Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten ist die zelluläre Energieversorgung stark beeinträchtigt, weil in der Mikroumgebung der Zelle Sauerstoff und Nährstoffe inadäquat bereitgestellt werden. Ziel war herauszufinden, ob und wie humane Immunzellen ihre Lebensfähigkeit und funktionellen Aktivitäten unter solchen Umständen aufrechterhalten. Methoden: Humane CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten wurden durch MACS aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Die Sauerstoffverbrauchsmessung mittels Clark-Elektrode war Maß der oxidativen Energiebildung, die mit Myxothiazol und Glukoseentzug gehemmt wurde. Die CD3/CD28-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde durchflußzytometrisch mittels CFDA SE analysiert. Basierend auf dem Paraformaldehyd-Saponin-Prozedere wurde die Zytokinsynthese ebenfalls am FACS bewertet, nachdem die T-Zellen in Anwesenheit von Brefeldin A mit PMA/Ionomycin stimuliert wurden. Mit einem käuflichen Testsystem (FACS-Technik) wurde die monozytäre Phagozytose untersucht. Die HIF-1alpha-Expression wurde nach PMA-Ionomycin-Stimulation von Myxothiazol-behandelten T-Zellen auf mRNA- und Proteinebene gemessen. Ergebnisse: Bei Glukoseanwesenheit waren alle untersuchten Immunfunktionen trotz vollständig gehemmter OXPHOS unbeeinträchtigt. Erst bei gleichzeitigem Glukoseentzug, der per sé Proliferation und Phagozytose signifikant beeinträchtigte, waren sie signifikant vermindert. Es wird vermutet, daß T-Zellen die Energieverluste mit einem überschießenden Effekt ihres Sauerstoffverbrauchs und stark angetriebener Glykolyse kompensieren. HIF-1alpha ist dabei nicht entscheidend für die Umschaltung auf anaerobe Energiesynthese. Schlußfolgerung: Die Daten quantifizieren die Energieanforderungen der funktionellen Aktivität in hochgereinigten humanen Immunzellfraktionen. Es wurde nachgewiesen, daß sich Immunzellen unerwartet lange an eine massiv beeinträchtigte Energetik adaptieren können und ihre spezifischen Funktionen aufrechterhalten. / Background: The function of immune cells is dependent upon a constant and adequate supply of energy. Energy is formed via OXPHOS in the mitochondria and via cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose are the main substrates for energy synthesis. Objective: In severe diseases or in inflamed areas cellular energy supply is significantly impaired due to inadequate supply of cellular microenvironment with oxygen and nutrients. The aim of this study was to answer the question, whether and how human immune cells maintain viability and functional activity under these circumstances. Methods: Human CD4+ T cells and CD14+ monocytes were isolated by MACS from peripheral blood of healthy donors. The extent of oxidative energy formation was determined via measurement of oxygen consumption using a Clark type electrode. Energy production was restricted in glucose-free cell culture medium and by gradually inhibited OXPHOS using myxothiazol. T cell proliferation was flow-cytometrically analysed using CFDA SE after stimulation with CD3 and CD28 antibodies. Cytokine synthesis was assessed by flow-cytometrical immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure after stimulation of T cells with PMA/ionomycin in the presence of brefeldin A. Phagocytosis of monocytes was measured using a commercial test system (FACS technique). HIF-1alpha expression was assessed by semiquantitative PCR and immunoblot after the stimulation of myxothiazol treated T cells with PMA/ionomycin. Results: In glucose-containing medium all investigated immune functions were unaffected even under complete suppression of OXPHOS. Only when OXPHOS and glycolysis were simultaneously and almost completely suppressed a significant decrease was found. Glucose deprivation per se caused both a significantly reduced proliferation and phagocytosis. It is supposed, that T cells are able to compensate for an energy deficit by an excess of oxygen consumption and strongly induced glycolysis. However, HIF-1alpha was found to be not crucial for switching to anaerobic energy synthesis. Conclusion: These data quantify the energy requirement of functional activity in highly purified human immune cell fractions. An unexpectedly high adaptive potential of immune cells to maintain specific functions even under massively impaired energetic conditions could be demonstrated.

La maladie cœliaque est une entéropathie inflammatoire chronique se développant chez des individus génétiquement prédisposés par l’expression des haplotypes HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 et survenant suite à la consommation de gluten. Elle se caractérise par le développement d’une atrophie des villosités de la muqueuse intestinale débouchant sur un syndrome de malabsorption alimentaire. La seule thérapie actuelle est le suivi d’une diète sans gluten mais cette éviction totale du gluten n’est pas toujours efficace et est lourde en concessions. Il est par conséquent urgent de développer des thérapies alternatives mais ce domaine constitue un pipeline évoluant lentement, notamment suite à l’absence d’un modèle animal pertinent et complet sur le plan physiologique. L’objectif de cette thèse doctorale est de répondre à ce besoin crucial en développant un modèle murin capable de récapituler les caractéristiques de la maladie. Le chapitre 1 dresse le portrait de la maladie en quatre parties amenant progressivement le lecteur dans les détails de sa pathogenèse. Cette introduction débute par un rappel sur la physiologie et l’immunité intestinale puis elle définit la face clinique de la maladie. Ensuite, le lecteur évolue dans une partie plus détaillée de la pathogenèse aidant au discernement de ses acteurs cellulaires et moléculaires. Finalement, elle se termine par une revue de la littérature sur les actuels modèles animaux. Le chapitre 2 brossent les objectifs de la thèse sur base de données clés de la littérature, notamment, les patients présentent au minimum une copie de l’halplotype HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 et plus des deux-tiers sur-expriment la cytokine pro-inflammatoire interleukine-15 au niveau de leur muqueuse intestinale. Il est donc raisonnable de penser qu’ensemble, le gluten, l’haplotype HLA et l’interleukine-15 contribuent activement à la pathogenèse. Bien que soupçonnés, leurs rôles et interactions nécessitent l’apport de preuves tangibles in vivo. Le chapitre 3 détaille ainsi ces interactions démontrées à l’aide du développement de notre nouveau modèle murin. Ce dernier est caractérisé par la surexpression de l’interleukine-15 dans l’épithélium et dans la lamina propria intestinale et par l’expression de l’haplotype HLA-DQ8. Ce travail démontre que l’exposition de cette souris au gluten s’accompagne d’une atrophie villositaire et de la signature complète de la maladie, tant sur le plan sérologique, cellulaire que transcriptionnel. Nous démontrons que la surexpression simultanée de l’interleukine-15 dans les deux compartiments de la muqueuse intestinale que sont la lamina propria et l’épithélium est une condition sine qua non au développement de l’atrophie. Aussi, cette étude permet de mettre en lumière la nécessité des cellules T CD4+ et de l’interféron-gamma dans l’activation des lymphocytes intraépithéliaux et le développement de l’atrophie. Finalement, cette recherche établit le rôle central joué par l’haplotype HLA-DQ8 et par l’enzyme transglutaminase II tissulaire dans la survenue de ces lésions. De manière générale, les résultats issus de ce modèle et présentés au chapitre 3 reflètent toute la complexité des interactions entre le gluten, la génétique et l’IL-15 dans le développement de la maladie cœliaque. Enfin, le chapitre 4 apporte une conclusion à ce travail et le chapitre 5 discute des futures directions envisagées pour ce modèle préclinique. Ce dernier va sans doute contribuer à une meilleure compréhension de la maladie cœliaque et permettre l’identification de potentielles cibles thérapeutiques. / Coeliac disease is a chronic inflammatory enteropathy characterized by autoimmune features. This disease occurs in genetically predisposed individuals expressing HLA-DQ2 or HLA-DQ8 haplotypes and is triggered following gluten consumption. The disease is characterized by the development of intestinal villous atrophy leading to malabsorption. The only current therapy is the adherence to a gluten-free diet, but the diet is not always effective and is heavy in concessions. Therefore, the development of alternative therapies is urgent but is a slowly evolving pipeline, mainly due to the absence of a physiologically relevant animal model. The aim of this thesis is to answer this unmet need by developing an animal model capable of recapitulating the main characteristics of the disease. Chapter 1 depicts a portrait of the disease in four points, gradually leading the reader into the details of its pathogenesis. This introduction begins with a review of the physiology and intestinal immunity and then draws a clinical portrait of the disease. Third, the reader evolves in a more detailed part of the pathogenesis helping him to discern its cellular and molecular actors. Finally, the introduction ends with a review of the literature on current animal models. Chapter 2 outlines the thesis objectives based on key data from the literature, in particular, patients present at least one copy of the HLA-DQ2 or HLA-DQ8 haplotype and more than two-thirds over-express the proinflammatory cytokine interleukin-15 at the level of their intestinal mucosa. It is therefore reasonable to hypothesize that gluten, HLA haplotype and interleukin-15 together contribute to the pathogenesis. Although suspected, their roles and interactions still require the provision of tangible evidence in vivo. Chapter 3 details these interactions based on the proposed new mouse model. This model is characterized by the overexpression of interleukin-15 in the intestinal epithelium and lamina propria and by the expression of the HLA-DQ8 haplotype. This work demonstrates that the exposure of this mouse to gluten is accompanied by villous atrophy and the complete serological, cellular and transcriptional signature of the disease. We also demonstrate that simultaneous overexpression of interleukin-15 in both mucosal compartments is a prerequisite for the development of atrophy. This study also highlights the need for CD4+ T cells and interferon-gamma in the activation of intraepithelial lymphocytes and the development of villous atrophy. Finally, this research establishes the central role played by the HLA-DQ8 haplotype and the enzyme tissue transglutaminase II in the occurrence of these lesions. In general, the results from this model presented in Chapter 3 reflects the complexity of the interactions between gluten, genetics and IL-15 in the development of coeliac disease. Finally, chapter 4 concludes this work and chapter 5 discusses future directions for this powerful preclinical model that will undoubtedly contribute to a better understanding of coeliac disease and will allow the identification of new potential therapeutic targets.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) caractérisée par de l’infiltration leucocytaire et de la démyélinisation axonale. Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) jouent un rôle primordial dans ce processus en activant dans la périphérie les lymphocytes T réactifs contre la myéline. Les lymphocytes activés peuvent traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et infiltrer le SNC. Les lymphocytes sont ensuite réactivés dans l’espace périvasculaire par les APC, suite à quoi ils contribuent à la démyélinisation et aux dommages axonaux. Nétrine-1 (N1) est une protéine de guidance axonale possédant d’importantes propriétés anti-inflammatoires. L’importance de N1 dans le maintien de la BHE et l’inhibition de l’infiltration leucocytaire dans le SNC a été bien démontrée, mais son implication dans la présentation antigénique et la régulation de l’activation lymphocytaire n’a jamais été étudiée. Le présent ouvrage propose l’hypothèse que N1 est produite par les APC afin de réguler la neuro-inflammation. Il cherche à caractériser l’expression de N1 par les APC, déterminer l’influence de N1 sur l’activation lymphocytaire et explorer le rôle de la production de N1 par les APC dans la neuro-inflammation. Les expériences menées à terme dans le cadre de ce projet démontrent que N1 est exprimée par les cellules dendritiques matures et les macrophages de type M1. De plus, N1 a pour effet de stimuler la prolifération des lymphocytes TH1, TH17 et CD8+. N1 inhibe également la production de cytokines par les lymphocytes TH17 et diminue l’expression de perforine par les lymphocytes T CD8+. N1 n’a toutefois pas d’influence sur l’expression des molécules d’adhérence par les lymphocytes T. Enfin, les cellules dendritiques, macrophages et cellules microgliales n’expriment pas N1 dans le SNC des souris dans le cadre de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de SEP. En somme, les résultats ici présentés suggèrent que N1 est produite par les APC afin d’influencer le fonctionnement des lymphocytes T. / Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disorder of the central nervous system (CNS) characterized by leukocytic infiltration and axonal demyelination. Antigen presenting cells (APCs) play a crucial role in this process by activating myelin-reactive lymphocytes in the periphery. Activated lymphocytes subsequently cross the blood-brain barrier (BBB) and infiltrate the CNS. These lymphocytes are reactivated in the perivascular space by APCs, following which they contribute to demyelination and axonal damage. Netrin-1 (N1) is an axonal guidance protein with considerable anti-inflammatory properties. The relevance of N1 in maintaining BBB function has been thoroughly established, but its involvement in antigen presentation and T cell activation has yet to be studied. This project investigates the hypothesis that N1 is produced by APCs to regulate neuroinflammation and aims to characterize N1 production by APCs, delineate the impact of N1 on T cell activation and clarify the role of APC-derived N1 in neuroinflammation. The results presented in this thesis demonstrate that N1 is produced by mature dendritic cells and M1 macrophages. Furthermore, N1 is shown to increase T cell proliferation, decrease TH17 cell cytokine production and decrease CD8+ T cell perforin expression. N1 does not alter T cell expression of adhesion molecules. Finally, N1 is not expressed by the CNS dendritic cells, macrophages or microglial cells of mice undergoing experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model for MS. In summary, these results suggest that N1 is produced by APCs to modulate T cell function.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Immunotherapy for cancer has held much promise as a potent modality of cancer treatment. The ability to selectively destroy diseased cells and leave healthy cells unharmed has been the goal of cancer immunotherapy for the past thirty years. However, the full capabilities of cancer immunotherapies have been elusive. Cancer immunotherapies have been consistently hampered by limited immune reactivity, a diminishing immune response over time, and a failure to overcome self-tolerance. Many of these deficiencies have been borne-out by immunotherapies that have focused on the adoptive transfer of activated or genetically modified mature CD8+ T cells. The limitations inherent in therapies involving terminally differentiated mature lymphocytes include limited duration, lack of involvement of other components of the immune system, and limited clinical efficacy. We sought to overcome these limitations by altering and enhancing long-term host immunity by genetically modifying then transplanting HSCs. To study these questions and test the efficiency of gene transfer, we cloned a tumor reactive HLA-DR4-restricted CD4+ TCR specific for the melanocyte differentiation antigen TRP-1, then constructed both a high expression lentiviral delivery system and a TCR Tg expressing the same TCR genes. We demonstrate with both mouse and human HSCs durable, high-efficiency TCR gene transfer, following long-term transplantation. We demonstrate the induction of spontaneous autoimmune vitiligo and a TCR-specific TH1 polarized memory effector CD4+ T cell population. Most importantly, we demonstrate the destruction of subcutaneous melanoma without the aid of vaccination, immune modulation, or cytokine administration. Overall, these results demonstrate the creation of a novel translational model of durable lentiviral gene transfer, the induction of spontaneous CD4+ T cell immunity, the breaking of self-tolerance, and the induction of anti-tumor immunity.

Mémoire en cotutelle avec le Dr. Daniel Kaufmann et le Dr. Nicolas Chomont / Dans les dernières années, il a été montré que les provirus intacts et défectueux du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) codent pour des protéines virales qui contribuent à l’activation chronique des lymphocytes T spécifiques au VIH, et ce même sous traitement antirétroviral (ART). Nous avons développé deux méthodes pour étudier, d’un côté, l’intégrité et la clonalité de séquences provirales (virologie), et de l’autre, les réponses T spécifiques au VIH (immunologie). Tout d’abord, nous avons développé une bibliothèque R nommée « IntegrityAlgorithm », automatisant une séquence d’analyse utilisée précédemment pour déduire l’intégrité et la clonalité de séquences quasi-pleine longueur (NFL) de provirus. Chaque séquence provirale est analysée pour la présence, dans cet ordre, d’inversions, d’hypermutations, de grandes délétions internes, de codons stops, de défauts dans la région Ψ et de défauts dans les cadres de lectures ouverts (ORFs). Les provirus dépourvus de ces défauts sont identifiés comme « intacts ». Nous montrons que la hiérarchisation des défauts sous-estime certains défauts, comme les codons stops et les défauts dans le Ψ. L’algorithme produit des résultats en accord avec les données publiées et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres algorithmes de prédiction. Nous avons aussi multiplexé l’essai de marqueurs induits par l’activation (AIM), couramment utilisé pour la détection de cellules T spécifiques à un antigène, en mesurant simultanément la co-expression de quatre AIMs (CD69, 4-1BB, OX40 et CD40L) plutôt que deux. En utilisant une stratégie de gating booléen ET/OU, l’approche augmente la fréquence de détection des cellules T CD4+ spécifiques à un antigène en comparaison aux paires d’AIMs standards. La détection des cellules T CD8+ était plutôt dominée par la paire d’AIMs CD69+4-1BB+. Le multiplexage réduit les biais dans la qualification et la quantification des cellules T spécifiques à un antigène, tel qu’il a été montré avec des analyses de phénotypage et des comparaisons intra- et inter-cohorte. Nous avons ensuite modifié la stratégie de gating booléen ET/OU pour une stratégie de gating en « L », nous permettant de trier des cellules vivantes T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH et au cytomégalovirus (CMV). En considérant l’étroite relation qu’entretiennent les provirus du VIH et le système immunitaire, améliorer nos méthodes pour la caractérisation à la fois des provirus, mais aussi des réponses T spécifiques au VIH, demeure essentielle pour une meilleure compréhension de la persistance des réservoirs et pour élaborer des stratégies de vaccination et d’éradication du virus. / In the past years, intact and defective human immunodeficiency virus (HIV) proviruses have been shown to code for viral proteins that contribute to sustaining chronic HIV-specific T cell responses, even under antiretroviral therapy (ART). We have developed two methods to study, on one side, the intactness and clonality of proviral sequences (virology), and on the other, the HIV-specific T cell responses (immunology). We developed an R package named “IntegrityAlgorithm” that automates a previous analysis pipeline used to infer intactness and clonality of near full-length proviral sequences (NFL). Each proviral sequence undergoes analysis to identify, in this order, the presence of inversions, hypermutations, large internal deletions, stop codons, Ψ defects, and defects in the open reading frames (ORFs). Proviruses exhibiting none of these defects are inferred as “intact.” We show that the hierarchization of defects underestimate some defects, such as stop codons or Ψ defects. The algorithm produces consistent results with the data published and presents several advantages over other prediction algorithms. We also multiplexed the activation-induced marker (AIM) assay, commonly used to detect antigen (Ag)-specific T cells, by simultaneously measuring the co-expression of four AIMs (CD69, 4-1BB, OX40, and CD40L) instead of two. When combined in an AND/OR Boolean gating strategy, the approach increases the frequency of Ag-specific CD4+ T cells detected in comparison to single AIM pairs. CD8+ T cell detection is rather dominated by the AIM pair CD69+4-1BB+. Multiplexing reduces biases in the qualification and quantification of Ag-specific T cells, as shown with phenotyping analyses and intra- and inter-cohort comparisons. We then modified the Boolean AND/OR gating strategy to an “L gating” strategy for the purpose of sorting live Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells. Considering the interdependent relationship between HIV proviruses and the immune system, improving our methods to characterize both the intactness of proviruses and the HIV-specific T cell responses will remain essential for a better understanding of the reservoirs persistence and to elaborate vaccine and viral eradication strategies.