Cette étude concerne le développement d’un dispositif innovant de type biocapteur, pour le diagnostic et le traitement local de cancers précoces. Cette technologie vise à diagnostiquer au plus tôt certains cancers, afin de les traiter de façon beaucoup plus efficace, en comparaison avec les techniques actuelles, souvent longues et mutilantes. Des microplots de silice mésoporeuse, fonctionnalisés azotures, sont déposés par impression jet d’encre (IJP) à la surface de fibres optiques. Le matériau présente une porosité auto-organisée, grâce au mécanisme d’auto-assemblage induit par évaporation (EISA). Par la suite, les microplots azotures sont fonctionnalisés spécifiquement par chimie click (click chemistry) par reaction avec des molécules alcynes. Dans le cas du diagnostic, cette fonctionnalisation permet le greffage de protéines et d’anticorps capables de reconnaître les marqueurs surexprimés à la surface des cellules cancéreuses. Les protéines et anticorps sont préalablement marqués par des fluorochromes, pour induire un transfert d’énergie (effet FRET ou Fluorescence Resonance Energy Transfer) lors de la reconnaissance des marqueurs cancéreux. Le principe de détection du dispositif repose ainsi sur une modification de la signature de fluorescence. Dans le cas de la thérapie, des photosensibilisateurs (PS) sont greffés sur les microplots pour permettre un traitement local par photothérapie dynamique (PDT).L’objectif global de l’étude vise à améliorer la sensibilité de détection du dispositif pour le diagnostic et à montrer l’efficacité de traitement dans le cas de la thérapie. Pour cela, les protocoles de réaction click et de greffage des protéines ont été optimisés et l’influence de la structuration de la porosité a été étudiée. Enfin, la sensibilité du dispositif a été caractérisée en fonction de plusieurs paramètres (type de matériaux, type de cellules cancéreuses, etc.). / This study focuses on the development of a new biosensor device for the diagnosis and local treatment of precocious tumors. This technology aims to diagnose cancers at an early stage to increase the treatment efficiency compared to existing techniques that are usually damaging. Mesoporous silica microdots with azide functions are deposited onto the surface of optical fibers using the inkjet-printing (IJP) process. The material shows a self-organized porosity, due to the evaporation-induced self-assembly (EISA) mechanism. Then, the azide microdots can be further functionalized specifically using click chemistry by reaction with alkyne precursors. For the diagnosis, the functionalization allows the grafting of proteins and antibodies capable of recognizing the increase in marker concentration at the surface of cancerous cells. These proteins and antibodies are labelled with fluorophores to induce a fluorescence energy transfer (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) with the recognition of tumorous markers. The detection principle is based on the modification change of the fluorescence signature. For the therapy, photosensitizers (PS) are anchored onto the microdots to allow the local treatment using photodynamic therapy (PDT). The main aim of this study was to optimize the device sensitivity concerning the diagnosis step, and to show the treatment efficiency concerning the therapy step. On that purpose, the protocols of click reaction and the grafting of proteins have been optimized, which are also influenced by the porosity organization that has been studied. Finally, the device sensitivity has been characterized as a function of multiple factors (materials, cancer cells type, etc.).

Le design et l’ingénierie de nanoparticules d’or (AuNPs) polyfonctionnelles suscitent un intérêt considérable en vue d’applications en nanomédecine, reconnaissance moléculaire, dans le domaine des capteurs et en catalyse dans un environnement aqueux. Cette thèse a été dédiée à une variété de fonctionnalisations, en particulier à l’aide de la méthode “click” impliquant la catalyse par le cui vre (I) de lacycloaddition des alcynes terminaux avec les azotures avec le catalyseur [Cu(hexabenzyltren)] Br pour l’introduction de polyéthylène glycol, carborane,ferrocène, coumarine, cyclodextrine, médicaments et molécules fluorescentes sur les AuNPs. Les ligands dits “click”, c’est-à-dire des 1,2,3-triazoles fonctionnalisés en positions 1,4 et formés de cette façon ont été ici largement utilisés afin de stabiliser des AuNPs pour des applications biomédicales et catalytiques en collaboration. / The design and molecular engineering of multi-functional gold nanoparticles (AuNPs) is of considerable interest towards applications in nanomedicine, molecular recognition, sensing and catalysis in aqueous environments. This thesis has been devoted to a variety of functionnalizations, in particular with the copper(I)-catalyzed Alkyne Azide cycloaddition (CuAAC) using thecatalyst [Cu(I)(hexabenzyltren] Br for the introduction of polyethylene glycol,carborane, ferrocene, coumarin, cyclodextrin, drugs and fluorescent probes. The so called “clicked” ligands, 1,4 -bifunctional triazoles, that were formed in this way have been exensively used to stabilize AuNPs for biomedical and catalytic collaborative applications.

In der vorliegenden Dissertation wurden mittels kontrolliert radikalischer Polymerisationstechniken alkinhaltige Blockcopolymere synthetisiert. In effizienten Cu(I)-katalyisierten 1,3-dipolaren Cycloadditionen (Click-Chemie) wurde diese modifiziert. Insbesondere durch die Addition dendritischer Verbindungen gelang die Darstellung nanosopischer Objekte. Darüber hinaus konnten dünne Filme phasenseparierten Blockcopolymere selektiv und ortsaufgelöst funktionalisiert werden. Die Arbeit liefert somit Beiträge zur Entwicklung neuartiger Nanomaterialien sowie ihrer Modifizierung.

Die Radiomarkierung biologisch relevanter Verbindungen mit dem Radionuklid 18F erlaubt Untersuchungen mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Mit Hilfe der PET werden quantitative Informationen über die räumliche und zeitliche Verteilung von Radiotracern im lebenden Organismus erhalten. Diese Radiotracer sind Grundlage für die in vivo-Erforschung der Physiologie des menschlichen Organismus, sowie zur Aufklärung und Nachverfolgung pathologischer Prozesse. Neben bekannten Ansätzen der Acylierung, Thioetherbildung und Hydrazonbildung ist es notwendig neue Markierungsmethoden zu entwickeln, um Probleme bei Markierungsreaktionen, wie niedrige Ausbeuten und Denaturierung empfindlicher biologisch relevanter Moleküle, zu umgehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluation der Click-Chemie, speziell der 1,3 dipolaren [3+2]Cycloaddition von Alkin- und Azid-Derivaten als neue, alternative Reaktion zur Markierung von biologisch relevanten Molekülen. Ziel der Arbeit war es einen 18F markierten, bifunktionellen Markierungsbaustein, versehen mit einer Alkinfunktion durch eine vollautomatisierte Synthese (Modulsynthese) herzustellen. Ein Peptid, ein Protein und ein Oligonukleotid als biologisch relevante Moleküle, sollten mit einer Azidfunktionalität versehen werden. Mit Hilfe eines geeigneten Katalysator-Ligandsystems sollten ein bifunktioneller Markierungsbaustein, sowie ein azidfunktionalisiertes biologisch relevantes Molekül miteinander gekuppelt werden unter Verwendung der 1,3-dipolaren [3+2]Cycloaddition. Die untersuchte Methode sollte mit anderen Markierungsmethoden verglichen werden. Es wurde eine Modulsynthese zur einfachen, schnellen und vollautomatisierten Herstellung eines alkinfunktionalisierten Synthesebausteins, 4-[18F]Fluor-N-methyl-N-(prop-2-inyl)benzolsulfonamid, p[18F]F SA, entwickelt. Dieser basiert auf einem Sulfonamid-Derivat und ist mit dem Positronenstrahler 18F gekuppelt. Ausgehend von einer Trimethylammonium-Markierungsvorstufe kann das p[18F]F SA mit einer radiochemischen Ausbeute von 27-40% und einer radiochemischen Reinheit >99% innerhalb von 80 min hergestellt werden. Die Reaktion läuft in Sulfolan bei 80°C innerhalb von 10 min ab. Das Produkt liegt aufgrund der HPLC-Reinigung mit einem hohen Reinheitsgrad (RCR >99%) vor und weist eine spezifische Aktivität von 120 570 GBq/µmol auf. p[18F]F SA eignet sich zur Markierung von biologisch relevanten Molekülen, da es unter den Markierungsbedingungen der Cycloaddition stabil ist und eine für das Arbeiten im wässrigen Milieu günstige Lipophilie (logP = 1,7) aufweist. Die verschiedenen Beispiele der drei Verbindungsklassen werden mit einer Azidfunktion versehen. Ein Phosphopeptid (H-MQSpTPL-OH), HSA und ein Aminohexylspacer tragendes Oligonukleotid (NH2 (CH2)6 pCCG CAC CGC ACA GCC GC) werden mit Succinimidyl-5-azidvalerat umgesetzt, wodurch eine Funktionalisierung an den Aminogruppen erfolgt. Während das Phosphopeptid und das Oligonukleotid einfach azidfunktionalisiert vorliegen, werden durch diese Methode 27 Azidreste an das HSA angebracht. Damit stehen Alkin- und Azid-Derivat für die Cycloaddition zur Verfügung. Das Phosphopeptid konnte mit einer Ausbeute von 29% innerhalb von 45 min hergestellt werden. Als Katalysator-Ligandsystem wird ein Gemisch aus Kupfersulfat und Natriumascorbat in Boratpuffer (pH = 8,4) eingesetzt. Man geht von 0,3-0,4 mg der peptidischen Markierungsvorstufe aus. Die Methode wurde mit der [18F]SFB-Markierung des Phosphopeptids verglichen. Man erhält ähnliche Ausbeuten und Reinheiten bei ähnlichen Reaktionsbedingungen. Ein wesentlicher Vorteil ist die Höhe der spezifischen Aktivität des eingesetzten p[18F]F SA, die bis zu zehnfach höher ist, als die des [18F]SFB. Das führt vermutlich zu einem ähnlichen Unterschied der spezifischen Aktivitäten der markierten Peptide, die jedoch nicht genau bestimmt wurden. Auch sind die Reaktionszeiten zur Peptidmarkierung bei Nutzung von p[18F]F SA um ein Drittel geringer. Das führt zur Verminderung der gesamten Synthesezeit. Die Markierung von azidfunktionalisiertem HSA (Beispielprotein) erfolgt mit einer radiochemischen Ausbeute von 57% innerhalb von ca. 45 min. Als Katalysator-Ligandsystem wird ein Komplex aus TBTA und Kupfer(I)-Ionen in Phosphatpuffer (pH = 7,4) / Dimethylsulfoxid verwendet. Die Masse der eingesetzten Markierungsvorstufe beträgt 0,3 mg. Ein Vergleich der Markierungsmethode erfolgte mit der Markierung mit den bifunktionellen Markierungsbausteinen [18F]SFB und [18F]FBA. Bei gleicher Proteinkonzentration ist der Umsatz von p[18F]F SA mit 94% am höchsten. Die Reaktion des hydrazinfunktionalisierten HSA mit [18F]FBA erfordert Temperaturen von 50-60°C, um einen Umsatz des Markierungsbausteins in ähnlicher Höhe wie bei Markierungen mit p[18F]F SA und [18F]SFB zu erreichen. Die Bedingungen für die Markierung mit [18F]SFB weicht dahingehend ab, dass ein pH Wert von 8,4 angewandt wird um eine Markierung zu erreichen. Grund ist die Notwendigkeit der Deprotonierung der im HSA vorhandenen, bei niedrigeren pH Werten protonierten Aminogruppen. Das limitiert die Reaktion auf einen Bereich um diesen pH-Wert. Die Untersuchung der Markierung von Oligonukleotiden ergab, dass ebenfalls ein Komplex aus TBTA und Kupfer(I)-Ionen notwendig ist. Als Lösungsmittel dient ein Gemisch aus 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Acetonitril und Dimethylsulfoxid (14:5:1). Nach 20 min Reaktionszeit bei 10°C kann das Produkt mit einem Anteil von 30% im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. Damit ist nachgewiesen, dass auch die Markierung von Oligonukleotiden unter milden Bedingungen mit dieser Reaktion möglich ist. Zusammenfassend kann man feststellen, dass sich die Click-Reaktion hervorragend für die schonende Markierung der biologisch relevanten Moleküle Phosphopeptid, HSA und Oligonukleotid eignet. TBTA wirkt während der Reaktion als Chelatbildner für die Kupfer(I)-Ionen und verhindert somit eine Bindung an die zu markierenden Moleküle oder deren Zersetzung. Damit wird die Stabilität der biologisch relevanten Moleküle gewährleistet und bei in vivo-Anwendung, das Einbringen cytotoxischen Kupfers verhindert. Im Zuge der Untersuchungen wurde ein Vergleich der Markierungsreaktionen Acylierung, Thioetherbildung, sowie Hydrazon- und Oximbildung durchgeführt. Die bifunktionellen Markierungsbausteine [18F]SFB, [18F]FBAM und [18F]FBA wurden dafür herangezogen. Die 1,3-dipolare [3+2]Cycloaddition unterscheidet sich von den zum Vergleich herangezogenen Reaktionen. Sie vereint die positiven Eigenschaften der anderen Markierungsreaktionen in sich: • Die Reaktion läuft unter milden Reaktionsbedingungen ab. • Der verwendete Markierungsbaustein p[18F]F SA ist unter den Markierungsbedingungen stabil und lässt sich in einer Einschrittsynthese mit Hilfe eines vollautomatisierten Synthesemoduls einfach in hohen Ausbeuten und Reinheiten, sowie mit einer hohen spezifischen Aktivität herstellen. Damit erweitert die 1,3 dipolare [3+2]Cycloaddition das Spektrum der Markierungsreaktionen und bietet das Potential zur Markierung verschiedenster biologisch relevanter Moleküle.

Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research. / Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą]

Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą] / Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research.

Cette thèse de doctorat a été réalisée au Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales (CERMAV) sous la direction du Dr Sébastien Fort, responsable de l'équipe Chimie et Biotechnologie des Oligosaccharides (CBO) et du Dr Sami Halila de l'équipe PhysicoChimie des Glycopolymères (PCG). Cette thèse intitulée « Synthèse par chimie click non metallo-catalysée de glycoconjugués macromoléculaires pour des applications médicales» est financée par le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche (bourse MESR). L'objectif de ce travail était de développer de nouvelles méthodes de modification et de couplage regiosélectif d'oligosaccharides pour la préparation de glycoconjugués par une chimie « click » sans catalyse métallique. Ces travaux s'appuient sur l'expertise de l'équipe CBO pour la synthèse chimio-enzymatique d'oligosaccharides complexes ainsi que sur les méthodes de modification sélective de la position réductrice des oses.Un premier aspect concerne l'utilisation des propriétés physico-chimiques des oligosaccharides pour l'obtention de nanoparticules de taille contrôlée. Ces particules sont constituées de copolymères à blocs hybrides obtenus par couplage entre un polymère de synthèse et un oligosaccharide. La structure des nano-objets préparés sera analysée au sein de l'équipe PCG.Le deuxième aspect concerne l'utilisation des propriétés de reconnaissance biochimique des oligosaccharides. Cette partie sera focalisée sur le couplage efficace d'oligosaccharides d'intérêt biologiques sur support solide pour la purification de protéines. / The aim of the project is to develop new anomeric modification of oligosaccharides for the synthesis of glycoconjugates by metal-free click chemistry. Synthetic glycans have shown a great potential in medical and nanotechnology related fields. The current use of metallic catalyst during synthesis and the risk of contamination of the final product represent a drawback which could restrain their applications. Therefore an efficient metal free synthesis of glycoconjugates could be of great interest to circumvent this obstacle.Two distinct synthetic strategies have been explored for the metal free coupling of complex oligosaccharides on polymers to yield block-copolymers and glycoadsorbants. The glycopolymers were synthetized by a Michael addition between a thiol functionalized oligosaccharide and a maleimide or bromo-maleimide functionalized polymer. The nanoparticles obtained from the self-assembly of theses amphiphilic copolymers in water were characterized. The polycaprolactone-b-xylooligosaccharides copolymers presenting a reducible linkage were self-assembled into nanoparticles and assessed as model for the delivery of hydrophobic drugs. This system showed a selective release of the entrapped molecules in reducing environment making it an interesting system for the intra-tumoral delivery of anti-cancer drugs. Glycoadsorbents were prepared by a Diels Alder reaction between a solid matrix displaying a maleimide moiety and furyl functionalized oligosaccharides. The affinity matrixes obtained allowed the selective purification of lectins. The blood group antigen (A;B) grafted matrixes displayed good properties for the trapping of corresponding anti-A or anti-B antibodies. These types of immunoadsorbants have great potential for the treatment of immune diseases like the Guillain-Barré syndrome.To conclude, two efficient anomeric modification and coupling strategies of oligosaccharides have been developed, opening the way to the metal free synthesis of various glycoconjugates.

Dans ce travail, nous avons développé différentes méthodes pour la co-immobilisation sur des électrodes poreuses de carbone de déshydrogénases NAD-dépendantes avec le complexe (2,2'-bipyridyle)(pentaméthylcyclopentadiényl)-rhodium ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) pour des applications de synthèse électroenzymatique d’alcools et de sucres chiraux. L'objectif était d'éviter la dégradation de l'activité enzymatique provenant de l'interaction entre les groupes fonctionnels de surface de l'enzyme (-SH, -NH2) et le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+, et également de permettre le recyclage des catalyseurs. L’électrogreffage de sels de diazonium a été utilisé pour introduire des fonctions alcène et/ou azoture sur une surface de carbone (carbone vitreux plan, feutre de carbone poreux ou couches de nanotubes de carbone). La chimie click « thiol-ène » a été utilisée pour lier de manière covalente une D-sorbitol déshydrogénase modifiée par un tag cystéine (soit 1 ou 2 fragments cystéine à l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique) à des électrodes de carbone. Ensuite, la réaction de cyclo-addition de Huisgen alcyne-azoture a été utilisée pour lier le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ à l’électrode. Ensuite la co-immobilisation des enzymes redox (D-sorbitol et galactitol déshydrogénases) avec le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ a été testée par l'encapsulation des protéines dans une couche de gel de silice, à l'intérieur d'un feutre de carbone poreux préalablement fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur est alors stable pendant plusieurs semaines pour la réaction de régénération de NADH, mais cette architecture d'électrode conduit à l'inhibition de l'activité enzymatique, probablement causée par un microenvironnement local (augmentation du pH et de la concentration du produit). La combinaison des chimies clicks « thiol-ène » et cyclo-addition de Huisgen a ensuite été étudiée pour l'immobilisation séquentielle de [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et d’une D-sorbitol déshydrogénase porteuse d’un tag cystéine, sur une électrode poreuse bi-fonctionnalisée par les groupes azoture et alcène. Enfin, compte tenu de la différence de durée de vie des enzymes et du complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et de la nécessité d'améliorer la séparation de ces éléments du système bioélectrochimique, l’assemblage optimal a été obtenu en associant une couche poreuse de silice dans laquelle est immobilisée l’enzyme avec un papier de nanotubes de carbone fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur [Cp*Rh(bpy)Cl]+ pour la régénération de NADH peut être réutilisé successivement avec plusieurs couches de protéines. Ce système optimal a finalement été appliqué à la conversion bioélectrochimique du D-fructose en D-sorbitol / In this work we developed methods for the co-immobilization of NAD-dependent dehydrogenases and the (2,2'-bipyridyl) (pentamethylcyclopentadienyl)-rhodium complex ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) on porous carbon electrodes for application in the electroenzymatic synthesis of chiral alcohols and sugars. The goal was to avoid the degradation of the enzymatic activity coming from the interaction of functional groups from the enzyme surface (eg.-SH, -NH2) with [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and to promote the recyclability of the catalyst. Diazonium electrografting was used to introduce alkene and azide groups on a carbon surface (flat glassy carbon, porous carbon felt or carbon nanotubes layers). Thiol-ene click chemistry was applied to bind a D-sorbitol dehydrogenase with cysteine tags (either 1 or 2 cysteine moieties at the N terminus of the polypeptide chain) onto carbon electrodes. Azide-alkyne Huisgen cyclo-addition reaction was used to bind an alkyne-modified [Cp*Rh(bpy)Cl]+. Then co-immobilization of the redox enzymes (D-sorbitol and galactitol dehydrogenase) with the complex [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was tested by encapsulation of the proteins in a silica gel layer, inside a rhodium-functionalized porous carbon felt. The immobilized [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was stable over weeks for NADH regeneration, but this electrode architecture led to the inhibition of the enzymatic activity, possibly because of the local environment (increase of pH and product accumulation in the porous electrode). The combination of ‘thiol-ene’ and Huisgen cyclo-addition was then investigated for sequential immobilization of [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and cysteine-tagged D-sorbitol dehydrogenase on an azide-alkene bi-functionalized electrode. Finally, considering the different lifetime of enzymes and [Cp*Rh(bpy)Cl]+ catalyst, and the need for a better separation of these elements from the bioelectrochemical system, the best configuration was achieved by associating a porous silica layer with the immobilized enzyme with a bucky paper of carbon nanotubes functionalized with [Cp*Rh(bpy)Cl]+. The reusability of this functionalized electrode was proved and the designed bioelectrode was successfully applied to a bioelectrochemical conversion of D-fructose to D-sorbitol

Dans ce travail, plusieurs applications des films minces à base de silice mésoporeuse fonctionnalisée, générés par auto-assemblage électrochimiquement-assisté (EASA), organisés et orientés, ont été développées. Au préalable, avant de se concentrer sur les films fonctionnalisés proprement dits, nous avons caractérisé les propriétés de perméabilité de tels films vis-à-vis de sondes redox en solution différemment chargées (neutre, Fc(MeOH)2, positive, Ru(NH3)63+, négatives, Fe(CN)63-/4-), démontrant une limitation électrostatique pour les anions. Ceci nous a amené à étudier l'amplification de la réponse électrochimique des sondes électroactives anioniques (Fe(CN)63-/4-) en présence d’un film de silice chargé négativement sur la surface de l’électrode en ayant recours à des médiateurs neutres ou chargés positivement. La fonctionnalisation de ces films minces de silice a été effectuée en combinant la méthode EASA pour obtenir un film de silice fonctionnalisé par de groupements azoture avec une réaction de couplage avec un groupe alcyne (l’éthynyl-ferrocène dans ce cas). La réponse électrochimique obtenue pour ces films isolants fonctionnalisés par des groupes ferrocene électroactifs est due à un mécanisme de saut d’électrons entre les sites électroactifs adjacents. L'oxydation électrochimique du ferrocène en ion ferricinium génère des charges positives qui sont compensées par l'entrée d'anions permettant une éventuelle détection ampérométrique indirecte d'anions non électroactifs. L’injection d’anions non-électroactifs dans une cellule électrochimique constituée par une électrode de travail fonctionnalisée par ces films de silice porteurs de groupements ferrocène, soumise à l’imposition d’un potentiel positif (+0,5 V), a donné lieu à une réponse ampérométrique proportionnelle à la concentration d'anions. La régénération de l’électrode par réduction du ferricinium était nécessaire afin d’éviter la diminution du signal électrochimique dû à la consommation progressive du ferrocène par des multiples analyses successives. Cette régénération a été réalisée in situ par une méthode ampérométrique à onde carrée. Le films mésoporeux orientés peuvent également être fonctionnalisés par des complexes à base de ruthénium du type [Ru(bpy)2(bpy')]2+ en adaptant la méthode décrite auparavant. Le succès de la fonctionnalisation est vérifié par électrochimie et aussi par spectroscopie UV-Vis au travers de la bande MLCT caractéristique du complexe immobilisé. Une étude plus approfondie est effectuée lors du transfert de charge (saut d'électrons le long des sites adjacents) et le transport de masse de l’anion compensateur de charge au travers des canaux mésoporeux en faisant varier la vitesse de balayage en potentiel. Les propriétés de luminescence de ces films ont été étudiées en présence et en absence d’oxygène, évaluant la possibilité d'utiliser ce type de film pour des applications telles que l'électrochimiluminescence ou la détection d’oxygène. Finalement, ces films à base silice orientés ont été utilisés pour la croissance de nanofilaments de polyaniline (PANI). Ces nanofilaments de polyaniline ordonnée sont générés par voie électrochimique de manière contrôlée. Etant donnée la taille des mésopores (2 nm de diamètre), des chaînes PANI quasi-uniques sont vraisemblablement produites. À partir d'expériences de chronoampérométrie, sur base de films de différentes épaisseurs (100-200 nm), il est possible de prouver l’existence de plusieurs étapes d'électropolymérisation. Chaque étape de la formation du polymère (période d'induction, croissance de la polyaniline au sein et en dehors des canaux mésoporeux) est clairement identifiée. La génération de nanofilaments de polyaniline isolés est démontrée par l'amélioration de la réversibilité entre les états conducteurs et non-conducteurs de la polyaniline. La possibilité de contrôler et d'adapter la croissance des nanofilaments polymères conducteurs offre de nombreuses possibilités [...] / In this work, we exploited the vertically-aligned mesoporous silica thin films generated by electro-assisted self-assembly (EASA). First of all, we present a study about the amplification of charge transfer of a repulsed anionic redox probes [i.e. Fe(CN)63-/4-] through the negatively charged silica film by using neutrally or positively charged redox probes [Fc(MeOH)2 or Ru(NH3)63+ respectively] through redox mediating processes. Furthermore, the functionalization can be conducted by combining EASA method to obtain azide-functionalized silica film and further letting it react with an ethynyl-bearing reactant (e.g. ethynyl-ferrocene) according Huisgen click chemistry. The resulting ferrocene-functionalized silica films are electroactive, involving an electron hopping mechanism between adjacent ferrocene moieties. The electrochemical oxidation of ferrocene into ferricinium ion generates positive charges that are compensated by the ingress of anions into the film, opening the door to possible indirect amperometric detection of non-electroactive anions by flow injection analysis. Operating in an electrolyte-free flow, each injection of an anion (e.g., NO3-) at an electrode biased at a suitable positive potential (i.e., +0.5 V) gave rise to an amperometric response proportional to the anion concentration. However, to avoid the decrease of the electrochemical signal due to the progressive consumption of ferrocene in multiple successive analyses, it was necessary to regenerate the electrode by reduction of ferricinium moieties, which can be achieved in-situ by square wave amperometry. The feasibility to apply such indirect amperometric detection scheme in suppressed ion chromatography (for detecting anions in mixture) was also demonstrated. The oriented mesoporous film can also be functionalized with ruthenium(II)bipyridyl complex [Ru(bpy)2(bpy’)]2+ using the same method. Optimization of the functionalization level is controlled electrochemically by cyclic voltammetry (CV) and monitored through the UV-vis spectra. Further study is conducted upon the charge transfer (electron hopping along the adjacent sites) and the mass transfer of the compensating counter anion through the mesochannels by varying the CV potential scan rate. The emission of the [Ru(bpy)2(bpy’)]2+-functionalized film and its quenching in the presence of oxygen are evidenced in both aqueous and organic solvent, giving opportunities to apply the film for different application, such as electrochemiluminescence sensor and oxygen detection. Lastly, the vertically-aligned mesoporous silica film is used as a hard template to grow polyanilinine nanofilaments. The growth of ordered polyaniline nanofilaments is controlled by potentiostatic polymerization. In such small pore template (2 nm in diameter), quasi-single PANI chains are likely to be produced. From chronoamperometric experiments and using films of various thicknesses (100−200 nm) it is possible to evidence the electropolymerization transients, wherein each stage of polymerization (induction period, growth, and overgrowth of polyaniline on mesoporous silica films) is clearly identified. The advantageous effect of mesostructured silica thin films as hard templates for the generation of isolated polyaniline nanofilaments is demonstrated from enhancement of the reversibility between the conductive and the nonconductive states of polyaniline and the higher electroactive surface areas displayed for all mesoporous silica/PANI composites. The possibility to control and tailor the growth of conducting polymer nanofilaments offers numerous opportunities for applications in various fields including energy, sensors and biosensors, photovoltaics, nanophotonics, or nanoelectronics

Cette thèse présente une nouvelle méthode d’assemblage de nanoparticules (NPs) magnétiques par une approche de chimie « click » sur des surfaces fonctionnalisées par des molécules organiques (self-assembled monolayers, SAMs). Le contrôle précis de la nanostructure des assemblages permet d’étudier les propriétés magnétiques collectives des NPs modulées par les interactions dipolaires. Un état de l’art des travaux décrits dans la littérature est présenté sur la synthèse de NPs d’oxydes métalliques, les enjeux et méthodes d’assemblage de NPs magnétiques ainsi que les propriétés magnétiques des NPs. Plusieurs types de NPs d’oxydes de fer présentant différentes tailles, morphologies (sphère, cube, tétrapode) et structures internes (coeur-coquille) sont synthétisés par la méthode de décomposition thermique La méthode développée d’assemblage des NPs consiste en une réaction dite « Copper (I) catalyzed alkyne-azide cycloaddition » (CuAAC), basée sur les interactions spécifiques entre des groupes alcyne et azoture présents à la surface des NPs et des SAMs. La fonctionnalisation des NPs et la préparation des SAMs sont également décrites. En modulant les conditions opératoires lors de la réaction d’assemblage, différentes nanostructures (films denses, NPs spatialement isolées ou chaînes de NPs) sont obtenues dans le but d’étudier les propriétés magnétiques collectives des NPs dans les assemblages. Un effet de la distance interparticule et de la mise en forme des NPs en 2D sur les interactions dipolaires sont mis en évidence. La réaction de click pour l’assemblage de NPs est ensuite perfectionnée, d’une part, la diminution du temps de la réaction d’assemblage en présence de radiations microondes, et d’autre part la préparation de films multicouches de NPs « one-pot » en contrôlant la réaction de click par électrochimie. Enfin des dispositifs magnéto-résistifs sont élaborés en déposant des assemblages denses de nanoparticules entre deux électrodes distantes d’une centaine de nanomètres. / This thesis aims to develop a new method to control the assembling of iron oxide magnetic nanoparticles (NPs) by “click” chemistry onto surfaces functionalized by organic molecules (self-assembled monolayers, SAMs). The high control on the nanostructure of NP assemblies results in the study of the collective magnetic properties. The state of the art, on the NPs synthesis, on the issues and methods of the assembling of magnetic NPs and on the magnetic properties of NPs films is established. The NPs of different sizes, morphologies and inner structures are synthesised by thermal decomposition. Self assembled monolayers (SAMs) are deposited on the substrates to address their surface for the NPs assembling. This assembling is achieved by specific interactions between alkyne and azide groups worn by the NPs and the SAM by theCopper Catalyzed Alkyne-Azide Cycloaddition (CuAAC) reaction which leads to covalent and irreversible anchoring of the NPs onto the substrate’s surface. Various nanostructures of NP assemblies (spatially isolated NPs, dense films, NPs chains) are obtained in order to study their magnetic properties. The interparticule distance and the dimensionality of the assembly (2D, 1D) are shown to strongly modulate dipolar interactions. The assembling by click chemistry is then improved by two means: (i) microwave activation to shorten the reaction time and (ii) control of the reaction by electrochemistry and 3D films preparation. This method is suitable for the elaboration of magnetoresitive devices by deposition of dense films of NPs between electrodes remote from a hundred of nanometers.