L’infertilité est considérée actuellement par l’organisation mondiale de la santé (OMS) comme une préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié des couples qui ont recours à l’AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs est expliquée par l’altération de la gamétogenèse. Chez l’homme, la spermatogenèse fait interagir des centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L’abondance de ces gènes suggère que les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les avancées techniques ont favorisé l’identification de gènes responsables de ces anomalies mais la grande majorité des cas d’infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L’objectif de la thèse est d’identifier de nouvelles causes génétiques responsables d’infertilité masculine et d’élucider les mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.Au cours de ma thèse j’ai participé avec l’équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de l’infertilité) à l’exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d’anomalies spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d’azoospermie non obstructive (ANO) et le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique (AMMF). Enfin j’ai joué un rôle important dans la création et l’analyse de modèles murins pour caractériser la pathogénie de ces anomalies.L’analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d’identifier un variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases. L’étude des souris KO pour ce gène nous a permis d’observer que les souris mâles adultes sont infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients. Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l’acrosome à partir du stade de spermatide ronde. En l’absence de Spink2, l’activité protéolytique non-neutralisée des protéases cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d’anomalies morphologiques et une baisse de la mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour la première fois que l’oligo-tératozoospermie et l’azoospermie peuvent constituer un continuum pathologique dû à une même pathogénie.Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 78 individus AMMF non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de 63%. Ces résultats confirment l’hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l’efficacité diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé l’implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out créé par la nouvelle technologie d’édition du génome, CRISPR/Cas9.Dans son ensemble, ce travail montre l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et l’infertilité masculine. / Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility) in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in Human.Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny.We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in 49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9.Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility.

Malgré les diagnostics précoces et les avancées thérapeutiques, le taux de mortalité chez les patients diagnostiqués d’un CCR au stade métastatique reste très élevé. L’objectif de ce travail a été d’étudier le rôle de la chimiokine CXCL12 et ses deux récepteurs CXCR4 et CXCR7 dans processus métastatique. J’ai comparé l’expression de la chimiokine CXCL12 dans des tumeurs coliques humaines avec les tissus sains associés puis je me suis intéressée aux mécanismes de régulation de cette expression et plus particulièrement la régulation épigénétique. J’ai montré que le promoteur de CXCL12 est méthylé dans 35% des CCR et qu’un défaut d’acétylation des histones du promoteur entraîne la perte d’expression de CXCL12. Des enzymes impliquées dans la régulation des mécanismes épigénétiques, potentiellement liées à ce défaut d’acétylation ont été identifiées par l’analyse des tumeurs par PCR Array et parmi ces facteurs, j’ai identifié l’histone acétyl-transférase PCAF dont l’expression est diminuée dans les tumeurs. Enfin, pour comprendre le rôle respectif de CXCR4 et de CXCR7 dans la dissémination métastatique, j’ai invalidé l’expression du gène des récepteurs dans la lignée colique humaine SW480 par Crispr-Cas9, puis j’ai comparé la capacité migratoire des cellules in vitro et leur potentiel métastatique in vivo. L’induction d’une perte d’expression du récepteur CXCR7 n’a pas eu d’impact sur le développement des métastases pulmonaire et hépatique in vivo, mais a entraîné une baisse de la migration in vitro. / Despite early cancer detection and therapeutic advances, the mortality rate in patients diagnosed with CRC at the metastatic stage remains very high. The aim of this work was to study the role of the chemokine CXCL12 and its two receptors CXCR4 and CXCR7 in the metastatic process. I compared the expression of the chemokine CXCL12 in human colon tumors with the associated healthy tissues, then I focused on the mechanisms regulating this expression and more particularly the epigenetic regulation. I have shown that the CXCL12 promoter is methylated in 35% of the CCR and that a lack of histone acetylation of the CXCL12 promoter causes the loss of its expression. Enzymes involved in the regulation of epigenetic mechanisms, potentially related to this acetylation defect, were identified by Array PCR on tumors and among these factors, the histone acetyl transferase PCAF, whose expression is decreased in tumors, was identified. Finally, to understand the respective role of CXCR4 and CXCR7 in metastatic spread, I invalidated the expression of both receptor genes in the human colonic line SW480 by Crispr-Cas9, and then compared the migratory capacity of the cells in vitro and their metastatic potential in vivo. Inducing a loss of expression of CXCR7 receptor did not have an impact on the development of pulmonary and hepatic metastases in vivo, but resulted in a decrease in in vitro migration.

L'hétérochromatine, de nature compacte et répétitive, limite l’accès à l'ADN et fait de la réparation des DSBs un processus difficile que les cellules doivent surmonter afin de maintenir leur intégrité génomique. Pour y étudier la réparation des DSBs, nous avons conçu un système CRISPR / Cas9 dans lequel les DSB peuvent être efficacement et spécifiquement induites dans l'hétérochromatine de fibroblastes de souris NIH3T3. En développant un système CRISPR / Cas9 hautement spécifique et robuste pour cibler l'hétérochromatine péricentrique, nous avons montré que les DSB en G1 sont positionnellement stables et réparés par NHEJ. En S / G2, ils se déplacent vers la périphérie de ce domaine pour être réparés par HR. Ce processus de relocalisation dépend de la résection et de l'exclusion de RAD51 du domaine central de l'hétérochromatine. Si ces cassures ne se relocalisent pas, elles sont réparées dans le cœur du domaine de l'hétérochromatine par NHEJ ou SSA. D'autre part, les DSBs dans l'hétérochromatine centromérique activent NHEJ et HR tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats révèlent le choix de la voie de réparation différentielle entre l'hétérochromatine centromérique et péricentrique, ce qui régule également la position des DSBs. / Heterochromatin is the tightly packed form of repetitive DNA, essential for cell viability. Its highly compacted and repetitive nature renders DSB repair a challenging process that cells need to overcome in order to maintain their genome integrity. Developing a highly specific and robust CRISPR/Cas9 system to target pericentric heterochromatin, we showed that DSBs in G1 are positionally stable and repaired by NHEJ. In S/G2, they relocate to the periphery of this domain to be repaired by HR. This relocation process is dependent of resection and RAD51 exclusion from the core domain of heterochromatin. If these breaks fail to relocate, they are repaired within heterochromatin by NHEJ or SSA. On the other hand, DSBs in centromeric heterochromatin activate both NHEJ and HR throughout the cell cycle. Our results reveal the differential repair pathway choice between centromeric and pericentric heterochromatin that also regulates the DSB position.

Leishmania est un parasite eucaryote divergent responsable d’un large spectre de maladies à travers le monde. Ce parasite est caractérisé par une aneuploïdie mosaïque, constitutive, c’est-à-dire qu’au sein d’une population chaque cellule comporte une combinaison unique de mono-, di- et trisomies de chacun de ses 36 chromosomes. L’aneuploïdie mosaïque est générée et maintenue chez les générations suivantes grâce à un taux élevé de répartition asymétrique des chromosomes lors de la mitose, entrainant le gain ou la perte de chromosomes entiers. Ceci implique une régulation non-conventionnelle de la réplication, suivie d’une ségrégation permissive des chromosomes.L’objectif général de cette étude était de comprendre la dynamique de la réplication de l’ADN ainsi que de cartographier les sites d’initiation de la réplication chez Leishmania, en utilisant la technique du peignage moléculaire d’une part et celle du ChIP-seq d’une autre part. Nous avons ainsi pu caractériser les différents paramètres de progression de la fourche de réplication. Un des résultats majeurs qui ressort de cette étude est que Leishmania possède les plus grandes distances inter-origines et la plus grande vitesse de réplication parmi les autres eucaryotes déjà étudiés. Nous avons également pu estimer que le génome de Leishmania possède environ 168 origines de réplication. Afin d’étudier les acteurs impliqués dans la réplication de l’ADN chez Leishmania, nous avons développé l’outil génétique CRISPR/Cas9. Pour développer cet outil, nous avons basé notre approche sur une stratégie à deux vecteurs : l’un permet l’expression du single guide (sg)RNA et l’autre celle de l’endonucléase Cas9. La validation de cet outil génétique a été réalisée par le knock-out du locus PFR2 codant une protéine flagellaire. Dans un second temps, nous avons fait évoluer le CRISPR/Cas9 vers un système inductible pour réaliser les knock-out et des étiquetages au locus endogène de protéines d’intérêt. Nous avons utilisé ce nouveau système pour étudier la fonction de deux protéines potentiellement impliquées dans le complexe de reconnaissance des origines de réplication. Malgré une fuite du système, nous avons pu réaliser le KO des gènes Orc1b et Orc1/Cdc6 et suivre la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu constater que la perte de ces gènes conduisait à un défaut de croissance ainsi qu’à l’apparition de cellules sans noyau. L’insertion d’une étiquette au locus endogène d’Orc1b nous a parmi de confirmer la localisation que nous avions obtenue avec une construction épisomale et va permettre d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine.En conclusion, nous avons mis en évidence des paramètres de réplication originaux et démontré, en utilisant le CRISPR/Cas9, que les protéines Orc1b et Ocr1/Cdc6 étaient impliquées dans la duplication du noyau de Leishmania, ce qui est en accord avec leur rôle putatif dans la réplication de l’ADN. / Leishmania, a protozoan parasite which causes a large range of diseases worldwide, is characterized by a constitutive 'mosaic aneuploidy', i.e. each cell in a population possesses a unique combination of mono-, di- and trisomies for each of its 36 heterologous chromosomes. Mosaic aneuploidy is generated and maintained via high rates of asymmetric chromosomal allotments during mitosis, leading to the gain or loss of whole chromosomes. This implies an unconventional regulation of the replication, followed by a permissive segregation.The main objective of this study was to unravel DNA replication dynamics and to map the replication initiation sites in Leishmania using DNA combing and ChIP-seq analyses. First, we have characterized DNA replication fork parameters. One of the major findings of this study was that Leishmania exhibits the fastest replication speed and the largest interorigin distances among the eukaryotes tested so far. We have also estimated that the Leishmania major genome possesses 168 origins of replication.To study the actors involved in DNA replication, we first had to develop novel genetic tools. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated endonuclease 9) system is a recently discovered powerful technique for genome editing. In order to adapt this system to Leishmania, we have chosen a two-plasmid strategy: one for the expression of the single guide (sg) RNA and a second for the expression of the endonuclease CAS9. The proof of concept has been based on the disruption of the paraflagellar rod-2 (PFR2) loci by the CRISPR-Cas9 system. In a second attempt, we have developed an inducible CRISPR-Cas9 system, both to obtain knock outs and to perform marker-free endogenous gene tagging. We used the system to investigate the function of Origin Recognition Complex proteins. Although the system was leaky, the genome was edited as expected. We thus deleted Orc1b and Orc1/Cdc6 and monitored the cell cycle progression of the parasite. We found that the depletion of these nuclear proteins lead to a growth defect and to the appearance of zoids (anucleated cells). The endogenous tagging of Orc1b confirmed the localization previously obtained using an episomal expression vector, and will allow further investigation on the role of this protein.In total, we have shown the presence of original replication dynamics parameters in Leishmania, and using CRISPR Cas9, we have demonstrated that Orc1b and Orc1/Cdc6 are involved in the nuclear duplication of Leishmania, in agreement with their putative in DNA replication.

Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are a major cause of Parkinson’s disease (PD), which is why modelling PD by replicating effects in animal models attracts great interest. However, the exact mechanisms of pathogenesis are still unclear. While a gain-of-function hypothesis generally receives consensus, there is evidence supporting an alternative loss-of-function explanation. Yet, neither overexpression of the human wild-type LRRK2 protein or its pathogenic variants, nor Lrrk2 knockout recapitulates key aspects of human PD in rodent models. Furthermore, there is conflicting evidence from morpholino knockdown studies in zebrafish regarding the extent of zygotic developmental abnormalities. Because reliable null mutants may be useful to infer gene function, and because the zebrafish is a more tractable laboratory vertebrate system than rodents to study disease mechanisms in vivo, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) genomic editing was used to delete the ~60-kbp-long zebrafish lrrk2 locus containing the entire open reading frame. Constitutive removal of both the maternal and the zygotic lrrk2 function (mzLrrk2 individuals) causes a pleomorphic phenotype in the larval brain at 5 days post-fertilisation (dpf), including increased cell death, delayed myelination, and reduced and morphologically abnormal microglia/leukocytes. However, the phenotype is transient, spontaneously attenuating or resolving by 10 dpf, and the mutants are viable and fertile as adults. These observations are mirrored by whole-larva transcriptome data, revealing a more than eighteen-fold drop in the number of differentially expressed genes in mzLrrk2 larvae from 5 to 10 dpf. Additionally, analysis of spontaneous swimming activity shows hypokinesia as a predictor of Lrrk2 protein deficiency in larvae, but not in adult fish. Because the catecholaminergic (CA) neurons are the main clinically relevant target of PD in humans, the CA system of larvae and adult fish was analysed on both cellular and metabolic level. Despite an initial developmental delay at 5 dpf, the CA system is structurally intact at 10 dpf and later on in adult fish aged 6 and 11 months. However, monoamine oxidase (Mao)-dependent degradation of biogenic amines, including dopamine, is increased in older fish, possibly suggesting impaired synaptic transmission or a leading cause of cell damage in the long term. Furthermore, decreased mitosis rate in the larval brain was found, in the anterior portion only at 5 dpf, strongly and throughout the whole organ at 10 dpf. Conceivably, lrrk2 may have a more general role in the control of cell proliferation during early development and a more specialised one in the adult stage, possibly conditional, for example upon brain damage. Because the zebrafish can regenerate lost neurons, it represents a unique opportunity to elucidate the endogenous processes that may counteract neurodegeneration in a predisposing genetic background. To this aim, the regenerative potential of the adult telencephalon upon stab injury was tested in mzLrrk2 fish. Indeed, neuronal proliferation was reduced, suggesting that a complete understanding of Lrrk2 biology may not be fully appreciated without recreating challenging scenarios. To summarise, the present results demonstrate that loss of lrrk2 has an early effect on zebrafish brain development that is later often compensated. Nonetheless, perturbed aminergic catabolism, and specifically increased Mao-dependent aminergic degradation, is reported for the first time in a LRRK2 knockout model. Furthermore, a link between Lrrk2 and the control of basal cell proliferation in the brain, which may become critical under challenging circumstances such as brain injury, is proposed. Future directions should aim at exploring which brain cell types are specifically affected by the mzLrrk2 hypoproliferative phenotype and the resulting consequences on a circuitry level, particularly in very old fish (i.e., over 2 years of age).

Un des objectifs de la biologie de synthèse est de concevoir et produire des organismes « à façon », pour des applications thérapeutiques et industrielles. Une des voies envisagées pour atteindre cet objectif repose sur des techniques de synthèse et de transplantation de génomes entiers, afin de créer des organismes mutants.Le but de cette thèse est de développer des outils de biologie de synthèse qui permettront de construire une cellule minimale et non pathogène, à partir de Mycoplasma pneumoniae. Cette bactérie est l'un des plus petits organismes vivants, avec une taille inférieure au micron et un génome de 816 kpb. Ce mycoplasme est l’un des plus étudiés, avec une collection de données génétiques et multi-« omiques » disponibles. Ces caractéristiques font de cette cellule naturellement « quasi minimale » un point de départ idéal pour la construction d’un châssis bactérien. Néanmoins, la manipulation génétique de ce mycoplasme est difficile, en raison du nombre restreint d'outils disponibles.Une approche récemment développée propose de contourner ces limitations en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae comme plateforme d’ingénierie du génome de M. pneumoniae. L’étape préliminaire à cette approche consiste à cloner le génome bactérien dans la levure. Pour ce faire, une cassette « éléments levure » est insérée dans le génome de M. pneumoniae, pour permettre son maintien comme chromosome artificiel. Les travaux menés au cours de cette thèse ont permis d’insérer cette cassette par le biais d’un transposon, et de cloner ce génome marqué dans la levure. La stabilité du génome cloné a ensuite été étudiée, mettant en évidence que le chromosome bactérien est maintenu durant une dizaine de passages. Nous avons ensuite développé une nouvelle stratégie d’insertion des « éléments levure » en utilisant le système CRISPR/Cas9 pour cloner et éditer simultanément un génome de mycoplasme chez la levure : le CReasPy-Cloning. Cette méthode a été utilisée pour supprimer trois loci différents contenant des gènes impliqués dans la virulence : MPN372 (toxine CARDS), MPN142 (protéine de cytoadhérence) et MPN400 (protéine bloquant les IgG). Elle a ensuite été utilisée pour en cibler deux puis trois en une seule étape.Une fois le clonage et l’ingénierie du génome bactérien réalisés dans la levure, il est nécessaire de pouvoir transférer le chromosome modifié dans une cellule receveuse, afin de produire une cellule mutante. Ce processus nommé transplantation de génome n’étant pas décrit pour M. pneumoniae, une part importante de cette thèse a été dédiée au développement de cet outil. Nous avons utilisé la transformation de plasmides comme mécanisme modèle pour étudier le processus d’entrée de l’ADN dans M. pneumoniae et tester l’utilisation du polyéthylène glycol, le réactif clé de la transplantation. Bien qu’ayant réussi à mettre au point un protocole de transformation de plasmides, nous n’avons pas réussi pour l’instant à réaliser la transplantation de génomes.En parallèle, nous avons développé une stratégie alternative d’édition de génome qui ne dépend pas de la transplantation. Cette approche, nommée « Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange » (GT-RMCE), consiste à capturer dans un vecteur une section du génome bactérien édité présent dans la levure. Ce vecteur est transformé dans M. pneumoniae, et grâce au système Cre-lox la section éditée est introduite dans le génome. Ce mécanisme permet de réaliser des modifications de grande ampleur, et est actuellement utilisé pour introduire chez M. pneumoniae les délétions ΔMPN372, ΔMPN400 et ΔMPN372-ΔMPN400 produites par CReasPy-cloning. Nous avons également utilisé le GT-RMCE pour générer une souche de M. pneumoniae portant deux copies de l’opéron ribosomal S10.Au final, les outils d’ingénierie du génome de M. pneumoniae développés au cours de cette thèse permettent de réaliser un pas significatif vers la construction de nouveaux châssis bactériens. / A goal of synthetic biology is to create and produce “custom” organisms, for therapeutic and industrial applications. One of the contemplated approaches to achieve this goal is based on synthesis techniques and transplantation of whole genomes, in order to create mutant organisms.The aim of this thesis is to develop synthetic biology tools that will enable the construction of a minimal and non-pathogenic cell based on Mycoplasma pneumoniae. This bacterium is one of the smallest living organisms, with a size smaller than one micron and a genome of 816 kbp. This mycoplasma is one of the most studied, with a large set of genetic and multi- “omics” data available. These characteristics make this naturally “almost minimal” cell an ideal starting point for the construction of a bacterial chassis. Nevertheless, the genetic manipulation of this mycoplasma is difficult, due to the limited number of available tools.A recently developed approach offers the possibility to circumvent these limitations by using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a genome engineering platform for M. pneumoniae. The preliminary step to this strategy is to clone the bacterial genome in yeast. To do so, a "yeast elements" cassette is inserted into the genome of M. pneumoniae, to allow its maintenance as an artificial chromosome. The work carried out during this thesis allowed us to insert this cassette through a transposon, and to clone this marked genome in yeast. Then, the stability of the cloned genome was studied, demonstrating that the bacterial chromosome is maintained during ten passages. We then developed a new strategy for the insertion of the "yeast elements", using the CRISPR/Cas9 system to simultaneously clone and edit a mycoplasma genome in yeast: the CReasPy-Cloning. This method was used to remove three different loci containing genes involved in virulence: MPN372 (CARDS toxin), MPN142 (cytoadherence protein) and MPN400 (IgG blocking protein). This method was also used to target two and then three different loci in one step.Once in-yeast cloning and bacterial genome engineering is achieved, it is necessary to transfer the modified chromosome into a recipient cell, to produce a mutant organism. This process, called genome transplantation, is not described for M. pneumoniae, so a significant part of this thesis was dedicated to the development of this tool. We used plasmid transformation as a model mechanism to study the process of DNA entry into M. pneumoniae and to test the use of polyethylene glycol, the key reagent for transplantation. Although we succeeded in developing a plasmid transformation protocol, we have not yet been able to perform genome transplantation.Concurrently, we have developed an alternative strategy for genome editing that does not depend on transplantation. This approach, named "Genomic Transfer - Recombinase-Mediated Cassette Exchange" (GT-RMCE), is used to capture in a vector a section of the edited bacterial genome borne by the yeast. This vector is then transformed into M. pneumoniae, and through to the Cre-lox system the edited section is introduced into the genome. This mechanism allows to carry out large-scale modifications, and is currently used to introduce into M. pneumoniae the ΔMPN372, ΔMPN400 and ΔMPN372-ΔMPN400 deletions produced by CReasPy-cloning. We also used the GT-RMCE to generate a strain of M. pneumoniae carrying two copies of the S10 ribosomal operon.Overall, the M. pneumoniae genome engineering tools developed during this thesis constitute a significant step towards the construction of new bacterial chassis.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) fait partie des maladies musculaires génétiques les plus fréquentes. Elle se caractérise par une dégénérescence progressive et asymétrique d’un groupe spécifique de muscles striés squelettiques, dont principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. D’un point de vue génétique, la FSHD est une maladie multifactorielle qui résulte d’évènements génétiques situés sur la région sub-télomérique du chromosome 4, ainsi que d’évènements épigénétiques altérant l’organisation chromatinienne du locus 4q35. Ces anomalies provoquent une relaxation chromatinienne et une surexpression de la majorité des gènes du locus 4q35, dont DUX4, gène majeur impliqué dans la FSHD. Les répercussions de l’ensemble de ces altérations se traduisent notamment par une dérégulation de la signature transcriptionnelle des myoblastes primaires issus des patients FSHD, et par des anomalies de leur différenciation myogénique in vitro et leur hypersensibilité au stress oxydant. Plusieurs aspects de la maladie demeurent incompris, et la complexité de cette myopathie rend difficile le choix d’une stratégie thérapeutique optimale. Cependant, la découverte des outils de l’édition du génome et la multiplication de leurs applications à visée thérapeutique dans le cadre de maladies humaines, notamment les myopathies, ouvre de nouvelles perspectives pour la FSHD qui reste, jusque-là, incurable.Le travail de thèse a concerné, dans un premier temps, l’implication des dommages de l’ADN et du stress oxydant dans la pathophysiologie de la FSHD. Nous avons mis en évidence l’omniprésence de ces caractéristiques cellulaires dans les myoblastes FSHD, leur lien à l’expression aberrante de DUX4 et leur participation à la morphologie défectueuse des myotubes FSHD in vitro. Dans un second temps, le travail de thèse a consisté à concevoir et à développer des outils de l’édition génomique et épigénomique, capables de cibler spécifiquement un des évènements génétiques causal de la FSHD, le variant pathogénique 4qA161 touchant un site d’attachement à la matrice nucléaire, FR-MAR. A partir de ces outils développés, deux stratégies de corrections génomique et épigénomique à visée thérapeutique peuvent être alors envisagées in vitro, ayant pour but ultime de rétablir la fonction d’insulation de FR-MAR et la conformation chromatinienne de la région 4q35. / Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) is one of the most common genetic myopathies characterized by a progressive and asymmetric weakening of a specific group of skeletal muscles, typically facial, shoulder girdle and upper arms muscles. FSHD is a multifactorial disease that results from the combination of genetic and epigenetic events mapped at the 4q35 locus. These genetic and epigenetic alterations lead to chromatin relaxation and the subsequent overexpression of the majority of 4q35 genes, notably DUX4, the major actor in FSHD pathology. These genomic alterations lead to molecular and cellular defects observed in vitro. Cultured-FSHD myoblasts show a distinct transcription profile, they exhibit morphological differentiation defects and are sensitive to oxidative stress. Several aspects of the disease remain poorly understood, and the elaboration of an appropriate therapeutic strategy is limited by the complexity of this myopathy. However, the discovery of genome editing tools and their successful therapeutic applications in vitro and in animal models of several human diseases, including myopathies, open doors to potential therapeutic strategies for FSHD.This work highlighted the involvement of DNA damage and oxidative stress in the pathophysiology of FSHD, by revealing their constitutive presence in FSHD myoblasts, their link to DUX4 expression and their participation in morphological defects of FSHD myotubes observed in vitro. The second part of this work was aimed at developing genome- and epigenome-editing tools capable of specifically targeting one of the genetic events causing FSHD, a pathogenic variant 4qA161 that contains an insulator and a nuclear matrix attachment site (FR-MAR). These engineered tools will be then used to develop in vitro therapeutic strategies, with the intention of restoring the insulator activity of FR-MAR and the chromatin organization of 4q35 locus.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale est caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et asymétrique. Elle affecte principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. L’association de plusieurs évènements épigénétiques à trois facteurs génétiques de la région subtélomérique du chromosome 4 résulte en un changement dans l’organisation chromatinienne la rendant permissive à l’expression aberrante des gènes de la région 4q35. Les myoblastes DFSH présentent des défauts de différenciation in vitro et des dérégulations dans des voies majeures comme celle de la réponse cellulaire au stress oxydant et de la différenciation myogénique. L’enjeu génétique et épigénétique complexe dans la DFSH et les limitations de la thérapie cellulaire dans son contexte laissent la DFSH jusque-là incurable. Toutefois les avancées dans les thérapies cellulaires et génétiques des myopathies ouvrent des horizons pour de futures applications dans le cadre de la DFSH.Le travail de thèse s’articule autour de trois thématiques. Premièrement, nous démontrons la faisabilité de la correction phénotypique et fonctionnelle des myotubes DFSH in vitro par la fusion de 50% de myoblastes normaux avec des myoblastes DFSH. Ensuite, nous évaluons deux approches d’édition génomique. Dans la première approche, nous ciblons le site de rattachement du chromosome 4 à la matrice nucléaire, FR-MAR avec la protéine CTCF à l’aide du système CRISPR/dCas9 en vue du rétablissement de l’organisation chromatinienne et de la fonction isolatrice de FR-MAR. Dans la deuxième, nous échangeons par translocation les régions homologues 4q35 et 10q26 dans le but de corriger les myoblastes DFSH comme les trois facteurs génétiques du locus 4q35 ne sont pathogéniques que sur un fond génétique lié au chromosome 4. Finalement, nous étudions le rôle du stress oxydant dans la DFSH. / Facio-Scapulo-Humeral dystrophy is characterized by progressive and asymmetrical muscle weakness. It mainly affects the facial, scapular and humeral muscles. The association of several epigenetic events with three genetic factors of the subtelomeric region of chromosome 4 results in a chromatin organization modification making it permissive to the aberrant expression of genes in the 4q35 region. FSHD myoblasts exhibit differentiation defects in vitro and dysregulations in major pathways such as the cellular response to oxidative stress and myogenic differentiation. The limitations of cell therapy and the complex genetic and epigenetic interplay in FSHD leave it, till now, incurable. However advances in cellular and genetic therapies of myopathies open up new horizons for future applications in the FSHD context. The thesis work is structured around three themes. First, we demonstrate the feasibility of phenotypic and functional correction of FSHD myotubes in vitro by fusing 50% of normal myoblasts with FSHD myoblasts. Next, we evaluate two genomic editing approaches. In the first one, we target the site of attachment of chromosome 4 to the nuclear matrix, FR-MAR with the CTCF protein using the CRISPR / dCas9 system for the purpose of restoring the chromatin organization and the insulating function of FR-MAR. In the second one, we exchange the homologous regions 4q35 and 10q26 by translocation in order to correct the FSHD myoblasts as the three genetic factors of the 4q35 locus are pathogenic only on a genetic background linked to chromosome 4. Finally, we study the role of the oxidative stress in the FSHD.

Même si les acteurs majeurs du développement musculaire ont été identifiés et les voies de transductions décrites, d’autres régulateurs restent encore à découvrir. Un crible ARNi pratiqué sur un modèle cellulaire couramment utilisé, la lignée myoblastique C2C12, a identifié 20 nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la myogenèse in vitro. Au cours de ma thèse, deux de ces gènes ont été invalidés sur modèle souris en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 pour valider in vivo leur implication. Pour l’un d’entre eux, seuls les animaux hétérozygotes ont pu être étudiés puisqu’une létalité précoce a été observée chez les homozygotes mutés. Aucune anomalie du développement musculaire n’a été mise en évidence. Une étude plus fine dans les premières phases du développement embryonnaire nous a permis de montrer le rôle indispensable de cette protéine précocement. L’étude du second gène – dont les analyses se poursuivent – semble confirmer in vivo le rôle de ce gène au cours de la myogenèse. Pour éviter la survenue de létalité embryonnaire et observer rapidement les effets de l’invalidation d’autres gènes, une technique de transgenèse somatique s’appuyant sur l’ARN interférence a été mis en place via l’injection de lentivirus contenant une cassette d’expression de shRNA directement dans le tibialis antérieur des souris. La validation de cette approche a été faite sur le gène de la myostatine, régulateur négatif du développement musculaire, et a montré une diminution de l’expression du gène associée à une augmentation de l’aire des fibres musculaires. La même approche appliquée à trois autres gènes renforce l’hypothèse de l’implication d’un des gènes dans le développement musculaire. Cette approche permet donc un crible rapide « in vivo » de gènes identifiés in vitro. Cependant, certaines améliorations doivent être apportées au protocole au regard des résultats obtenus. / Even if the major actors and transduction pathways of muscle development have been identified, there are still unknown regulatory factors. An in vitro RNAi screening performed on C2C12 myoblastic cells has permitted to identify 20 novel genes potentially implicated in myogenesis. During my thesis, two of these genes were invalidated on mouse model using CRISPR/Cas9 technology in order to confirm their implication in vivo. For the first gene, due to an early lethality occurring in homozygous mutated animals, only heterozygous animals were studied and there was no muscular development anomaly detected. A refined study of earlier stages of embryonic development permitted to show the essential role of the protein in these phases. The study of the second gene, still in progress, seems to confirm in vivo the implication of the gene on the myogenesis. In order to avoid embryonic lethality due to germline invalidation and to observe more rapidly the effects of gene invalidation in muscle, we developed a technique of somatic transgenesis based on RNA interference. Lentivirus containing a shRNA expression cassette was injected directly into the tibialis anterior of mice. We validated this approach on Myostatin gene, a well-known negative regulator of muscle development, showing that the decrease of Myostatin gene expression was associated to an increase of muscle fibers area. The same approach was used with three genes and support the hypothesis of the implication of one of them in muscle development. Thus, this approach allows a rapid “in vivo” screening of in vitro identified genes. Nonetheless, some improvements should be brought on the protocol according to the first results.

Au cours de l'évolution, les cellules eucaryotes ont acquis une enveloppe nucléaire (NE) renfermant et protégeant le génome organisé en chromatine, une structure où l'ADN s’enroule autour de protéines histones. La NE est composé de deux membranes : du côté nucléoplasmique, la membrane nucléaire interne (INM) et du côté cytoplasmique, la membrane nucléaire externe. La NE permet la communication entre les deux compartiments par le biais des complexes de pores nucléaires et relie le cytosquelette au nucléosquelette via le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton to Cytoskeleton). Ainsi, le nucléosquelette associé à l'INM est nécessaire pour transmettre des signaux au noyau et induire des changements dans l'organisation de la chromatine et finalement dans l'expression des gènes.Une nouvelle famille de protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAP),proposées comme nouveaux composants du nucléosquelette de la plante, a récemment été mise en évidence dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ces protéines sont codées par une famille de trois gènes et sont ciblées vers le noyau via un NLS où elles sont ancrées à l'INM via leur domaine transmembranaire C-terminal. Les protéines AtNEAPs possèdent également plusieurs longs domaines en spirale (coiled-coil) rappelant la structure des lamines chez les animaux. Cette thèse visait à réaliser une analyse fonctionnelle des AtNEAPs à l'aide de lignées mutantes T-DNA et CRISPR/Cas9. L'interactome AtNEAP a été étudié par des approches moléculaires (Yeast Two Hybrid), indiquant des interactions entre AtNEAPs pouvant former des homo- ou hétéro-dimères; ainsi que la localisation et la co-localisation in vivo couplées à de l’imagerie (apFRET), qui ont confirmé les interactions avec le facteur de transcription (TF) AtbZIP18. Les anticorps spécifiques à AtNEAP générés au cours de cette étude ont été utilisés pour confirmer l'expression in vivo. En outre, les résultats ont indiqué que les AtNEAPs font partie du nucléosquelette et jouent un rôle dans l’ancrage des TF à l’INM afin de maintenir la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine. / During evolution, eukaryotic cells have acquired a nuclear envelope (NE) enclosingand protecting the genome, which is organized in chromatin, a structure wrapping DNAaround histone proteins. The NE is composed of two membranes: on the nucleoplasmic side,the Inner Nuclear Membrane (INM) and on the cytoplasmic side, the Outer NuclearMembrane. The NE allows communication between both compartments through Nuclear PoreComplexes and bridges the cytoskeleton to the nucleoskeleton through the LInker ofNucleoskeleton to Cytoskeleton complex. Thus, the nucleoskeleton associated with the INMis needed to transmit signals to the nucleus and induce changes in chromatin organisation andultimately gene expression.A novel family of NUCLEAR ENVELOPE ASSOCIATED PROTEINS (NEAPs)proposed to be new components of the plant nucleoskeleton has been recently evidenced inthe model plant Arabidopsis thaliana. AtNEAP proteins are encoded by a small gene familycomposed of three genes and are targeted through a nuclear localisation signal to the nucleuswhere they are anchored at the INM through their C-terminal transmembrane domain.AtNEAPs also possess several long coiled-coil domains reminiscent of the lamin structure inanimals. This thesis aimed at performing a functional analysis of AtNEAPs using T-DNAinsertion and CRISPR/Cas9 mutant lines. The AtNEAP interactome was investigated bymolecular approaches (Yeast Two Hybrid), which indicated AtNEAP interactions with eachother to form homo or hetero-dimers; as well as in vivo localisation and co-localisationcoupled to image analyses (apFRET, acceptor photobleaching Fluorescence ResonanceEnergy Transfer), which confirmed interactions with the transcription factor (TF) AtbZIP18.AtNEAP specific antibodies generated during this study were used to confirm expression invivo. Altogether, results indicated that AtNEAPs are part of the nucleoskeleton, with a role inanchoring TFs at the INM to maintain nuclear morphology and chromatin organisation.