Made available in DSpace on 2016-04-28T14:58:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Thais Moreira Hidalgo de Almeida.pdf: 3286442 bytes, checksum: 491a402cc8bf5539730d0625fcbf7b31 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Germination, conservation and physical characteristics of seeds of four cacti species that occurs on Rio de Janeiro State coastal regions, Cereus fernambucensis Lem., Coleocephalocereus fluminensis (Miq.) Backeb., Pilosocereus arrabidae (Lem.) Byles & G.D. Rowley and Pilosocereus ulei (K. Schum.) Byles & G.D. Rowley were evaluated in this study. The first experiment, mounted in a completely randomized design and factorial system, tested two substrates (agar 1% and paper) and three temperatures (20?C, 25?C and 20-30?C) using four replicates of 40 seeds. The evaluation parameters were germination percentage (normal seedlings) and germination average time (ANOVA and Tukey; P<0,05). According to the germination analysis, the best combination of temperature and substrate is 20?C in agar for C. fernambucensis, 20?C and 20-30?C in paper or agar for C. fluminensis, 25?C in agar for P. arrabidae and 20, 25 and 20-30?C in paper, as well as, 20 and 25?C in agar for P. ulei. The use of agar 1% was suitable for germination of this cacti seeds, being necessary, however, studies that lead to reduction in the incidence of plant health problems. In another experiment the effects of storage and seed water content were evaluated on the germination percentage and germination average time of these four species. To better define the salts to be used in the seed drying process for this experiment, adsorption isotherms were built using static gravimetric method, with saturated salt solutions. The isotherms of all species showed a reverse sigmoidal pattern with increase of seed water content according to the increase in relative humidity. In the conservation experiment, also arranged in completely randomized design and factorial system, three different storage conditions (control, 30 days at 10?C and 30 days at -196?C) under three levels of water content, around 5, 7 and 9% (dry basis) were tested, with four replicates of forty seeds (ANOVA and Tukey; P<0,05) at the following conditions: C. fernambucensis in agar at 20?C, C. fluminensis and P. ulei in paper at 20?C and P. arrabidae in agar at 25?C. All four species showed dehydration and sub-zero temperature tolerance. Seed viability and four species showed dehydration and sub-zero temperature tolerance. Seed viability and vigour showed no changes when stored with water content around 7%, at 10?C and cryopreserved at -196?C. Cryopreservation can be recommended for the storage of this cacti species. / As caracter?sticas f?sicas, germina??o e conserva??o de sementes de quatro esp?cies de cact?ceas ocorrentes nas ?reas litor?neas do estado do Rio de Janeiro, Cereus fernambucensis Lem., Coleocephalocereus fluminensis (Miq.) Backeb., Pilosocereus arrabidae (Lem.) Byles & G.D. Rowley e Pilosocereus ulei (K. Schum.) Byles & G.D. Rowley foram avaliadas neste estudo. O primeiro experimento, montado em delineamento inteiramente casualizado e esquema fatorial, testou dois substratos (?gar 1% e sobre papel ) e tr?s temperaturas (20?C, 25?C e 20-30?C) utilizando quatro repeti??es de 40 sementes. Os par?metros de avalia??o foram porcentagem de germina??o (pl?ntulas normais) e tempo m?dio de germina??o (ANAVA e Tukey; P<0,05). De acordo com a an?lise de germina??o, as melhores temperaturas e substratos para a germina??o de sementes de C. fernambucensis s?o 20?C e ?gar; para C. fluminensis, 20?C e 20-30?C, tanto no substrato papel como em ?gar, para P. arrabidae, 25?C em ?gar e para P. ulei em papel a 20, 25 e 20-30?C e ?gar a 20 e 25?C. O uso de ?gar 1% se mostrou adequado a germina??o das sementes destas cact?ceas, sendo necess?rios, no entanto, estudos que levem a redu??o da incid?ncia de problemas fitossanit?rios. Em outro experimento foram avaliados os efeitos de armazenamento e teor de ?gua das sementes sobre o percentual e o tempo m?dio de germina??o destas quatro esp?cies. Para melhor defini??o dos sais a serem usados na secagem das sementes para este experimento, foram constru?das isotermas de adsor??o utilizando-se o m?todo gravim?trico, est?tico, com solu??es salinas saturadas. As isotermas de todas as esp?cies revelaram um padr?o sigmoidal inverso com o acr?scimo de teor de ?gua das sementes em fun??o do aumento da umidade relativa do ar. No experimento de conserva??o, tamb?m montado em delineamento inteiramente casualizado e esquema fatorial, foram testadas tr?s diferentes condi??es de armazenamento (controle, 30 dias a 10?C e 30 dias a -196?C) sob tr?s diferentes teores de ?gua, pr?ximos a 5, 7 e 9% (base seca), utilizando quatro repeti??es de 40 sementes (ANAVA e Tukey; P<0,05) e nas seguintes condi??es: C. fernambucensis em ?gar a 20?C, C. fluminensis e P. ulei em papel a 20?C e P. arrabidae em ?gar a 25?C. As quatro esp?cies demonstraram toler?ncia a desidrata??o e a temperatura sub-zero. A viabilidade e o vigor das sementes n?o apresentaram altera??es quando armazenados com teores de ?gua pr?ximos a 7%, tanto em c?mara fria a 10?C como criopreservado a -196?C. A criopreserva??o pode ser recomendada para o armazenamento das esp?cies estudadas.

Les nombreuses pressions naturelles et anthropiques qui pèsent sur les écosystèmes coralliens font craindre leur disparition pour les années futures. Parmi les mesures de conservation, la cryoconservation permet de maintenir en sécurité les échantillons sur le long terme et à coût réduit. Les premiers travaux sur la cryoconservation des Anthozoaires incitent à développer davantage la méthode de vitrification plutôt que la congélation lente. Dans ce contexte, cette thèse propose d'expérimenter la technique de vitrification sur plusieurs formes pluricellulaires dont les apex, les planulae, les polypes primaires, les polypes isolés et les balles tissulaires (TB), toutes issues du Scléractiniaire Pocillopora damicornis. Les meilleurs résultats ont été produits avec les TB obtenues après exposition à une solution de KSW puis traitées selon la méthode V Cryo-plate. L'éthylène glycol (EG) s'est avéré le cryoprotecteur (CPA) le mieux toléré jusqu'à 4.0 M pendant 20 min à température ambiante (RT). Les mélanges binaires et ternaires de CPA ont cependant permis d'obtenir de meilleures tolérances des TB qu'avec les solutions individuelles. L'utilisation de solutions successives a permis d'obtenir des survies jusqu'à 4.5 M selon le protocole : 1.5 M EG + 0.5 M Glycérol (Gly) (5 min, RT) puis 1.5 M DMSO + 1.5 M EG + 1.5 M Gly (10 min, 0°C) et enfin 1.5 M EG + 0.5 M Gly (5 min, RT). L'intégrité des cellules épithéliales de l'ectoderme apparaît essentielle au maintien des TB durant et après les traitements. Si le protocole de vitrification n'a pu être mis au point, en revanche, l'utilisation des TB à des fins de cryoconservation apparaît très intéressante pour de futures investigations. / Numerous environmental and anthropic pressures threaten reef ecosystems, rising concerns on species loss in coming years. Among conservation measures, cryopreservation ensures the safe and cost-effective long-term conservation of biological material. The first publications focusing on Anthozoa cryopreservation reported that the vitrification approach was preferable to the slow-cooling approach. In this context, this thesis aimed at investigating a vitrification technique with several pluricellular forms of the Scleractinian Pocillopora damicornis including apexes, planulae, primary polyps, isolated polyps and tissue balls (TB). The best results were obtained using TBs produced by exposing coral branches to a KSW solution. TBs were cryopreserved using the V Cryo-plate method. The highest TB tolerance was obtained after exposure to solution containing ethylene glycol (EG) concentrated to 4.0 M for 20 min at room temperature (RT). Binary and ternary cryoprotectant (CPA) solutions were better tolerated by TBs compared with individual cryoprotectant solutions. Exposure of TBs to a series of cryoprotectant solutions with progressively increased concentration allowed obtaining TB tolerance to cryoprotectant with a concentration of 4.5 M with: 1.5 M EG + 0.5 M Glycerol (Gly) (5 min, RT), 1.5 M DMSO + 1.5 M EG + 1.5 M Gly (10 min, 0°C) and then 1.5 M EG + 0.5 M Gly (5 min, RT). Epithelial cells from the ectoderm were essential to maintain TB integrity during and following CPA treatments. Successful cryopreservation was not achieved in this work; however, it demonstrated that the use of TBs constitutes a promising way for further cryopreservation research.

Cryopreservation is a promising approach to long-term biopreservation of living cells, tissues and organs. The use of cryoprotective agents (CPAs) in combination with extremely low temperatures is mandatory for optimum biopreservation. CPAs (e.g., glycerol, trehalose, dimethyl sulphoxide (DMSO)), however, are relatively cytotoxic and compromise biopreserved cell quality. This is usually resultant in oxidative damage, diminishing cell functionality and survival rate. The growing market of cell therapy medicinal products (CTMPs) demands effective cryopreservation with greater safety, of which the currently available CPAs are unable to provide. The present study was aimed at developing cryomedia formulation to enhance the cryopreservation of nucleated and anucleated mammalian cells. Here, eleven compounds of a polyol nature were selected and examined for their cryoprotective properties. These compounds are derived from plants and honey, thereby ensuring their safety for human consumption. The selection was based on their molecular structure and chemical properties. Here, the presented study is divided into three main phases: 1) Screening the compounds panel for cryo-additive effects on cells during and post-cryopreservation and optimising the dose response and time course for trehalose and glycerol with and without the novel compounds; 2) Assessing the influence of biophysical criteria on biospecimen cryopreservation (e.g., biosampling procedure, cell age, donor age); 3) Establishing the mechanisms of action underpinning the modulatory effect of novel CPAs on biological pathways during cryopreservation. For the stated purposes, red blood cells (RBCs) obtained from sheep and humans were used to screen the compounds for novel cryo-additive agents. Cryosurvival rate was employed as an indication of the compounds' cryoprotective performance. Cellular biochemical profiles, including lipid and protein oxidative damage as well as key redox enzymatic activities (e.g., lactate dehydrogenase (LDH), glutathione reductase (GR)) were measured. The study revealed that nigerose (Nig) and salidroside (Sal) were significantly effective in protecting cells during the freeze-thaw cycle and recovery phases. Both compounds promoted the activity of GR and reduced oxidative stress mirrored by diminished LDH activity. This was also reflected in the protein and lipid oxidation levels, which was limited to a comparable level with the cells' prior freezing. Further studies on human leukaemia (HL-60) were carried out to elucidate the molecular and biological pathways associated with cryodamage and the modulatory effects of adding novel CPAs. The proteome profile and the corresponding biological functions were evaluated and iii showed that Nig and Sal protected cells against cryodamage. The additive compounds (Nig and Sal) demonstrated a unique and overlapping modulation effect pattern. Nig was found to highly influence proteins engaged with metabolic and energetic pathways, whereas Sal greatly affected nuclear and DNA-binding proteins. The current study concluded that novel CPAs have high potency in protecting cells and each compound has a unique effect on the cellular proteome. These features can be applied to designing cryomedia formulae with higher protective efficiency for targeted applications in cell based therapy and biopharmaceutical industries.

OBJETIVO: Comparar dois meios de congelamento para sêmen: o comercialmente disponível Meio de Congelamento TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) e o crioprotetor sintético suplementado com fosfatidilcolina (PC) e antioxidante L-acetil-carnitina (ANTIOXPC - delineado pela Invitra Tecnologia de Reprodução Assistida - Brasil) em relação a motilidade progressiva (PR) e índice de fragmentação do DNA (IFD) em amostras de sêmen obtidas de homens com parâmetros seminais alterados. DESENHO: Ensaio clínico de nãoinferioridade. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram incluídas amostras de sêmen com parâmetros seminais alterados (astenozoospermia) de 58 voluntários no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. As amostras de sêmen foram submetidas à análise antes e após a criopreservação. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada pelo espermograma e a fragmentação do DNA espermático foi analisada pela técnica transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL). Antes da criopreservação, todas as amostras de sêmen foram divididas e randomizadas para receber os crioprotetores TYB ou ANTIOX-PC, congelados no período mínimo de 30 dias e descongelados. Uma análise exploratória dos dados foi realizada através de medidas de posição central e dispersão. O teste t pareado foi usado para comparar os grupos. Comparações entre os dois meios, ANTIOX-PC e TYB, e sêmen fresco foram realizadas através de contrastes ortogonais, utilizando o modelo de regressão linear de efeitos mistos. Este modelo foi implementado no programa SAS 9.3 considerando o PROC MIXED. RESULTADOS: A motilidade PR (P = 0,78) e o IFD (P = 0,06) não foram diferentes quando comparados os meios ANTIOX-PC (12,40 ± 11,49 e 13,33 ± 10,54) e o TYB (12,09 ± 11,11 e15,83 ± 11,04), respectivamente. Esses dados mostraram que o crioprotetor sintético delineado não foi inferior na proteção dos espermatozoides comparado com o meio TYB. Além disso, o ANTIOX-PC reteve taxas mais altas de motilidade total43,36 ± 26,77) do que o TYB (34,79 ± 22,86; P <0,0001) e reduziu significativamente as taxas de espermatozoides imóveis (56,64 ± 26,77; P <0,0001) em relação ao TYB (65.00 ± 23.00).CONCLUSÃO: O meio ANTIOX-PC não pode ser considerado menos efetivo que o TYB em relação à motilidade PR e ao IFD. Parâmetros cinéticos observados em espermatozoides pósdescongelamento do diluente ANTIOX-PC demonstraram o impacto positivo do tratamento com fosfolipídios/antioxidantes na criotolerância espermática humana na ausência de aditivos animais. / OBJECTIVE: To compare two sperm freezing media: commercially available Freezing Medium TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) and a synthetic cryoprotectant supplemented with phosphatidylcholine (PC) and antioxidante L-acetyl-carnitine (ANTIOXPC - designed by Invitra Assisted Reproduction Technology - Brazil) in relation to progressive motility and sperm DNA fragmentation index (DFI) in sêmen samples obtained from men with altered seminal parameters. DESIGN: Non-inferiority clinical trial. MATERIALS AND METHODS: Were included semen samples with altered seminal parameters (asthenospermia) from 58 volunteers at the Clinical Hospital of Ribeirao Preto Medical School, University of São Paulo. Semen samples were subjected to analysis both before and after cryopreservation. The sperm motility was evaluated by the spermogram and the sperm DNA fragmentation was analyzed by the transferase-mediated dUTP nick-end labeling technique (TUNEL). Before cryopreservation, all semen samples were divided and randomized to receive the cryoprotectants TYB or ANTIOX-PC, frozen and thawed after 30 days. An exploratory data analysis was carried out through measures of central position and dispersion. The paired t-test was used to compare the groups. Comparisons between the two media ANTIOX-PC and TYB, and fresh semen were performed through orthogonal contrasts using the mixed effects linear regression model. This model was implemented in the SAS 9.3 program considering PROC MIXED. RESULTS: Progressive motility (P = 0.78) and DFI (P = 0.06) were not different when comparing ANTIOX-PC (12.40 ± 11.49; and 13,33 ± 10.54) and TYB (12.09 ± 11.11 and 15.83 ± 11.04), respectively. These data showed that the synthetic cryoprotectant designed was not inferior in sperm protection compared to the TYB medium. In addition, ANTIOX-PC retained higher rates of overall motility (43.36 ± 26.77)than TYB (34.79 ± 22.86; P<0,0001) and significantly reduced the immotile sperm rates (56.64 ± 26.77; P<0,0001) when compared with TYB (65.00 ± 23.00). CONCLUSION: ANTIOX-PC medium can not be considered less effective than TYB relative to progressive motility and IFD. Kinetic parameters observed in post-thaw sperm from ANTIOX-PC extender demonstrated the positive impact of the phospholipid/antioxidant treatment on human sperm cryotolerance in the absence of animal aditives.

O Banco de Tecidos do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo está desenvolvendo uma linha de estudos experimentais com o intuito de apresentar novos métodos de armazenamento de aloenxertos. Este estudo tem como objetivo comparar o método da criopreservação (- 80° C) com o da conservação em glicerol a 98% em temperatura ambiente. Foram analisadas tanto a capacidade de inibição de crescimento bacteriano e fúngico quanto às eventuais alterações histológicas. Para isso, foram estudadas 30 amostras de tecido ósseo trabecular coletadas de 10 pacientes submetidos à artroplastia total do quadril. Estas amostras foram divididas em três grupos de 10 espécimes, a saber: grupo controle, grupo criopreservado e grupo conservado em glicerol a 98% à temperatura ambiente. O período de armazenamento das amostras foi de um ano. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo método de McNemar, com índice de significância de 0,10. No que diz respeito à preservação da matriz óssea, não houve variações significativas nos dois grupos estudados em relação ao grupo controle. Não ocorreu crescimento bacteriano ou de fungos nas amostras armazenadas durante um ano em glicerol a 98%. Por ser extremamente reduzido em relação à criopreservação, o custo do método da conservação em glicerol a 98% o indica para uso em Bancos de Tecidos de pequena monta. Contudo, são ainda necessários posteriores estudos sobre as propriedades biomecânicas, remoção do glicerol do tecido ósseo e o processo de integração biológica dos mesmos com o receptor. / The Tissue Bank of Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo is developing a line of experimental studies with the intention to present new methods of allografts storage. This study has the objective to compare the method of cryopreservation (-80 ºC) with glycerol 98% preservation at room temperature. It even analyses, in such way, the inhibition capacity of bacterial and fungal growth and any eventual histological changes. For this, 30 samples of trabecular bone tissue have been collected from 10 patients submitted to total hip arthroplasty. These samples were separated in three groups of 10 specimens, as following: a control group, a cryopreserved group and a glycerol 98% preserved group at room temperature. They were stored during a period of one year. The results were analysed by the McNemar statistic method, with a significance of 0,10. Concerning to bone matrix, no significant changes occurred to the two studied groups compared to the control group. Bacterial and fungal growth do not occurred in the stored samples for one year in glycerol 98%. For being extremely reduced when compared with cryopreservation method, the preservation cost in glycerol 98% indicates its use on small sum tissue banks. However, posterior studies about biomechanical properties, glycerol removal of bone tissue and their biological process of integration with the receiver are necessary.

Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas. / In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.

O presente estudo teve como objetivos comparar o sêmen de cães jovens e senis, por avaliação morfo-funcional, estresse oxidativo e quantificação de produtos avançados de glicação (AGEs); comparar a congelabilidade seminal de cães jovens e senis e verificar a ação dos produtos avançados de glicação, oxidação proteica e estresse oxidativo na criopreservação seminal de cães senis. Foram selecionados 22 cães, alocados em dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=11) e Grupo Senil (n=11). Os grupos foram adicionalmente subdivididos em Grupo Sêmen Fresco e Grupo Sêmen Criopreservado. A divisão etária foi realizada de acordo com o porte dos animais, sendo porte pequeno considerado senil a partir de 8 anos de idade, porte médio a partir de 7 anos de idade e porte grande acima de 6 anos de idade. Independentemente do porte, os cães jovens em idade reprodutiva foram considerados entre 1 e 5 anos de idade. O Grupo Fresco foi submetido a avaliações seminais imediatas, incluindo volume, cor, aspecto do ejaculado, concentração espermática e análise computadorizada da motilidade (CASA). Logo após, foram realizadas avaliações morfo-funcionais, incluindo atividade mitocondrial dos espermatozoides, estresse oxidativo lipídico, estresse oxidativo proteico, dosagem de produtos avançados de glicação e dosagem de concentração proteica, citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes para a avaliação espermática da integridade de membrana plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondrial e análise de fragmentação de DNA. O Grupo Congelado foi submetido ao protocolo de congelação em uma etapa e após, no mínimo uma semana, as amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e, então, avaliadas quanto à concentração espermática, análise computadorizada da motilidade (CASA) e as mesmas avaliações morfo-funcionais realizadas para o Grupo Jovem. Como resultados, os machos do Grupo Jovem apresentaram maior escore de libido, parâmetros da motilidade espermática, alta atividade mitocondrial dos espermatozoides e menores valores de atividade mitocondrial média, defeitos espermáticos totais, defeitos espermáticos maiores e gota citoplasmática proximal. No sêmen fresco, o Grupo Jovem obteve maiores valores de integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides e baixo potencial de membrana mitocondrial, assim como menores valores de integridade da membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. No sêmen descongelado, o Grupo Jovem apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides. No sêmen de cães jovens, o Sub-grupo Fresco obteve maiores valores de integridade de membrana acrossomal e integridade de membrana acrossomal com lesão de membrana plasmática. No sêmen de cães senis, o Sub-grupo Fresco apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal, integridade de membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial, assim como menor porcentagem de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial. Na comparação entre os sub-grupos, houve maiores valores para parâmetros da motilidade espermática, integridade de membrana plasmática com lesão de acrossomo, médio potencial de membrana mitocondrial, integridade de membrana plasmática, alta atividade mitocondrial e estresse oxidativo no Sub-grupo Descongelado, além de maiores valores de amplitude de deslocamento lateral da cabeça, espermatozoides estáticos, lesão de membrana acrossomal e plasmática, média atividade mitocondrial e concentração de proteínas no pellet de espermatozoides. A partir de tais resultados, é possível concluir que o sêmen de cães senis apresenta qualidade inferior ao de cães jovens, bem como reduzida congelabilidade. Nos cães senis, possivelmente, a falha na eliminação da gota citoplasmática dos espermatozoides promova disfunções mitocondriais, culminando na alteração da motilidade espermática. Por fim, as avaliações de parâmetros oxidativos não se mostram acuradas para a avaliação do impacto da senescência reprodutiva. / This study aimed to compare the semen of young and senile dogs, through the evaluation of morphological and functional attributes, oxidative stress and quantification of advanced glycation ending products (AGEs); compare the seminal freezability of young and senile dogs and evaluate the effects of advanced glycation ending products, oxidation protein and oxidative stress on seminal cryopreservation of senile dogs. Twenty two dogs were selected and allocated into two experimental groups according to their age: Young Group (n=11) and Senile Group (n=11). These groups were additionally divided into Fresh Semen Group and Frozen Semen Group. Age distribution was performed according to the size of the animals, being small animals considered senile from 8 years of age onwards, medium size from 7 years old and large size over 6 years old. Regardless of the body size, dogs were considered young if they were at reproductive maturity from 1 to 5 years old. The Fresh Group was subjected to immediate seminal assessments, including volume, color, aspect of the ejaculate, sperm concentration and computer analysis of sperm motility (CASA). Then morpho-functional assessments were carried out, including sperm mitochondrial activity, lipid oxidative stress, protein oxidative stress, dosage of advanced glycation ending products and of protein concentration, flow cytometry using fluorescent probes to evaluate plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation analysis. The semen from the Frozen Group was submitted to one step freezing protocol and samples were thawed after not less than 1 week at 37°C for 30 seconds and evaluated for sperm concentration, motility computerized analysis (CASA) and same the morpho-functional analysis performed for the Young Group. Male dogs from the Young Group presented higher libido score, parameters of sperm motility, percentage of sperm with high mitochondrial activity and lower percentage of sperm of medium mitochondrial activity, total spermatic defects, major spermatic defects and proximal cytoplasmic droplet. For the fresh semen of the Young Group, higher values of acrosomal membrane integrity and low mitochondrial membrane potential, as well as lower values of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential were noticed. In the post-thaw semen, the Young Group showed higher values of spermatic acrosomal membrane integrity. For the semen of young dogs, the Fresh Group had higher values of acrosomal membrane integrity and acrosomal membrane integrity with plasma membrane damage. In the semen of senile dogs, the Fresh Group presented higher values of acrosomal membrane integrity, plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential, as well as lower percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential. Comparing sub-groups, higher values for sperm motility parameters, plasma membrane integrity with acrosome injury, medium mitochondrial membrane potential, plasmatic membrane integrity, high mitochondrial activity and oxidative stress was noticed for the Thawed group, as well as greater values of lateral displacement amplitude of the sperm head, static spermatozoa, acrosomal and plasmatic membrane lesions, medium mitochondrial activity and protein concentration in the spermatozoa pellet. Based on the present results, it is possible to conclude that the semen of senile dogs presents inferior quality compared to young dogs, as well as less freezability. The possible failure to eliminate the sperm cytoplasmic droplet in senile dogs sperm promotes mitochondrial dysfunctions, culminating to alterations on sperm motility. Finally, the evaluation of oxidative parameters is not feasible for the impact evaluation of reproductive senescence.

Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22oC) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da maturação in vitro a porcentagem de oócitos em MII foi menor no grupo B e semelhante nos grupos A e C. Assim como para a detecção do fuso meiótico que foi menor no grupo B e similar nos grupos A e C. Conclusões: Houve diferença na porcentagem de despolimerização do fuso meiótico em resposta à baixa temperatura entre os oócitos de camundongas nos diferentes estágios da divisão meiótica, sendo menor nos oócitos em TI. A porcentagem de despolimerização do fuso meiótico foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo, à exceção dos oócitos em TI à temperatura ambiente. Os oócitos hmanos em GV vitrificados apresentaram melhores taxas de sobrevivência quando comparados com oócitos humanos em GV criopreservados pelo congelamento lento. Os oócitos humanos em GV vitrificados apresentaram taxas semelhantes de maturação in vitro e detecção do fuso meiótico polimerizado quando comparados a oócitos a fresco / Introduction: The meiotic spindle of most mammals is sensitive to cooling and depolymerizes even after a slight reduction in temperature. This is well described and studied on matured oocytes at metaphase II (MII). However, little is known about the influence of low temperatures under meiotic spindle of imature oocytes. In this way, we sougth to evaluate: 1) the influence of low temperatures on mice oocyte meiotic spindle matured in vitro e 2) the oocyte meiotic spindle from human oocytes matured in vitro and cryopreserved by slow-rate freezing or vitrification at GV stage. Methods: Two experiments were done: the first one on mice and the second one on women.At experiment 1, immature mice oocytes at metaphase I (MI), telophase I (TI) and MII were cultured at 37º C (control), room temperature (22oC) and 4º C for 0, 10, 30 and 60 minutes and then spindle analysis was made with polarized light microscopy (PLM) (LC-Polscope-Oosight image software) or immunocytochemistry (ICC). At experiment 2, GV oocytes retrieved from women submitted to ovulation induction and in vitro fertilization were randomly divided in three groups: fresh oocytes (A), cryopreserved by slow-freezing (B) and cryopreserved by vitrification (C). Fresh, thawed and warmed oocytes were matured in vitro to metaphase II oocytes (MII). A meiotic spindle analysis was done by polarized light microscopy (ICSI Guard Octax). Results: Experiment 1: At time 0 min and 37º C, all oocytes had polymerized spindles both at PLM or ICC. At 4º C, the number of MI oocytes with detectable spindles at PLM was smaller than those analysed by ICC, and it decreased with time, which had also occured with TI oocytes at a smaller proportion. However, at 4º C, TI meiotic spindle recognition with polarized light microscopy and ICC was comparable. When MII oocytes were cultured at 4º C, the spindle visualization decreased proportionally in correlation with culture time at PLM, and the same happened with ICC in a less pronounced manner. At room temperature there was a little descrease regarding visualization of meiotic spindle, both at PLM and ICC, altought it was not significant for TI oocytes. Experiment 2: Oocyte survival immediately after thawing/warming were 44.6% for group B and 79% for group C. After 24 hours of culture, oocyte survival was 29.2% and 69%, respectively. The median time for maturation was 26 hours for groups A and C, and 27 hours for group B. The percentage of MII after maturation in vitro were smaller in group B and similar between groups A and C. The same oocured for spindle visualization which were lower in group B and similar between groups A and C. Conclusions: There was a difference on the percentages of meiotic spindle depolymerization in response to cooling in mice oocytes at different stages of meiotic division. Spindle depolymerization was lower in TI. Also, meiotic spindle depolimerization was proportional to culture time, except for TI oocytes at room temperature.Vitrified GV oocytes had a better survival when warmed, compared to slow-rate frozen oocytes. Vitrified GV oocytes had similar maturation in vitro rates and polymerized spindles detection when compared to fresh oocytes

A criopreservação, como já conhecido, causa danos da função celular podendo, com isso, apresentar redução da fertilidade. O desenvolvimento de técnicas para avaliar a viabilidade espermática, que visam aperfeiçoar o processo de avaliação seminal tem sido meta de muitas pesquisas. Este trabalho foi dividido em dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para o desenvolvimento e validação de técnicas práticas e de alta repetibilidade para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial de espermatozóides bovinos pela associação de sondas fluorescentes. O experimento 2 foi realizado para avaliar os efeitos que a criopreservação pode causar sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial (pela técnica desenvolvida no experimento 1) e estrutura da cromatina de espermatozóides bovinos frente a dois diluidores diferentes, bem como verificar a existência de correlações entre alterações nas membranas e características de motilidade em espermatozóides bovinos criopreservados. No experimento 1 as associações das sondas iodeto de propídio (PI, para avaliar integridade da membrana plasmática) e aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA, para avaliar a integridade acrossomal), foram divididas em quatro protocolos, nos quais foram testadas diferentes sondas para avaliar a função mitocondrial. Rodamina 123 (R123, protocolo 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocolo 2), CMXRos ou MitoTracker red (protocolo 3) e no: iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1, protocolo 4). Estes protocolos foram testados e validados. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância, teste de Fisher e à análise de regressão linear pelo programa Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998). O protocolo 1 não apresentou resultados satisfatórios, não sendo possível validar, enquanto, os protocolos 2, 3 e 4 foram validados e apresentaram resultados bastante consistentes. O protocolo 4 foi escolhido para a utilização no experimento 2. Para o experimento 2 foram realizadas sete colheitas de sêmen de oito touros puros da raça Simental. Após a colheita, o sêmen foi avaliado quanto ao volume, concentração, motilidade e vigor visualmente, motilidade por sistema computadorizado (CASA), características morfológicas por microscopia de interferência diferencial, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, pela associação de FITC-PSA, PI e JC-1, e integridade da estrutura da cromatina, pela técnica da acridina laranja. Após as análises, o sêmen foi dividido em duas alíquotas, sendo uma das alíquotas diluída com o diluidor Bioxcell&reg; e a outra com o diluidor Botu-Bov&reg;, envasado em palhetas e submetido a congelação com um sistema automatizado. Duas palhetas cada tratamento foram descongeladas e o sêmen foi avaliado quanto a motilidade e vigor visualmente, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial e estrutura da cromatina. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 1985), os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey. Foram calculadas correlações lineares de Pearson. O nível de significância foi fixado em 5%. Foram observados efeitos da criopreservação e do diluidor sobre motilidade e vigor visual, motilidade pelo CASA, características morfológicas, integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial. De forma que, após a criopreservação houve aumento dos danos nas estruturas espermática e o diluidor Botu-Bov&reg; apresentou a maioria das características melhores quando comparado ao diluidor Bioxcell&reg; / The process of cryopreservation causes damages in the sperm cellular function which may lead to a reduction in fertility. New techniques to evaluate sperm viability may improve the process of semen evaluation. The present work was divided in two experiments. Experiment 1 aimed the development and validation of practical techniques with high repetibility for simultaneous evaluation of integrity of plasmatic and acrosomal membrane and mitochondrial function of bovine spermatozoa by the strategic association of fluorescent probes. Objective of experiment 2 was to validate the effects of cryopreservation using two differents diluents on sperm motility, plasmatic, acrosomal, mitochondrial membranes integrity and chromatin structure of bovine spermatozoa. A second objective was to verify the correlations between alterations in membranes and motility characteristics in cryopreserved bovine spermatozoa. In experiment 1 propidium iodide (PI, to evaluate plasmatic membrane integrity) and the Pisum sativum agglutinin conjugated with fluorescein isothicyonate- (FITC-PSA, to evaluate acrosomal integrity). Probes were associated to evaluate mitochondrial function in four protocols: Rhodamine 123 (R123, Protocol 1), MitoTracker Green FM (MITO, protocol 2), CMXRos or MitoTracker red (protocol 3), and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1, protocol 4). Results were submitted to analysis of variance, Fisher’s test and linear regression analysis by the program Stat-View&reg; ( SAS Institute, Inc.1998). It was not possible to validate protocol 1, while the protocols 2, 3 and 4 were validated and showed consistent results. Protocol 4 was used in experiment 2. For experiment 2 seven ejaculates were collected from eight Simental bulls. Volume, concentration, motility and vigour of semen were evaluated subjectively, motility by computer system (CASA), morphological characteristics by differential interference microscopy, plasmatic and acrosomal membranes integrity and, mitochondrial function with FITC-PSA, PI and JC-1 association, and chromatin integrity by acridine orange technique. Then, semen was divided in two aliquots. One was diluted with Bioxcell&reg; and the other with Botu-Bov&reg; diluent, packaged in 0.5 mL straws and frozen using na automated system. Two straws of sêmen from each treatment were thawed and the semen parameter evaluated, as described above. The statistical analysis was performed using the Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 1985). Data were submitted to analysis of variance and Tukey’s test. Pearson’s linear correlations were calculated. Cryopreservation increased damages in spermatic structures. Botu-Bov&reg; diluent was better in preserve the motility and membrane integrity (P&it;0,05) when compared to Bioxcell&reg; diluent

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are being explored for treatment of inflammatory, ischemic, autoimmune, and degenerative diseases. More and more of these diseases require MSCs to be delivered locally to the diseased site rather than systemically injected into patients. However, little is understood about whether cell cryopreservation or prelicensing will affect the efficacy of the locally injected product or how the local injection environment affects MSC expression of trophic factors and interactions with patient immune cells. Several groups have disagreed on whether cryopreservation hinders MSC potency and therefore it is important to understand the effects of cryopreservation on MSC function and in what contexts cryopreservation can be used. Therefore, a better understanding of MSC phenotype after local injection is needed so that cryopreservation and prelicensing can be optimized to modulate cell potency for more efficacious MSC products. Currently, it has been shown that in vivo there are rapid drastic shifts in gene expression by MSCs which have been locally injected. One of the most prominent gene changes is in the enzyme COX-2 which leads to the production of bioactive lipids called prostaglandins, namely PGE2. PGE2 has several functions depending on the context in which other cells encounter it. In order to model the gene changes that occur in vivo, in vitro cell aggregates termed spheroids have been utilized to study the effects of local injection of MSCs. MSC spheroids have shown more potency than their 2D counterparts in shifting macrophage polarization and rescue of cells from ischemic damage. This thesis examines how process variables like cryopreservation and prelicensing affect the efficacy of the MSC product in the context of local injection. Additionally, it shows how spheroid formation alters therapeutic factor expression and activity and how drug treatment and biomaterials can be utilized to modify potency of these cells. In Chapter 2, we demonstrate that cryopreservation in the context of an ischemia/reperfusion injury in the eye does not significantly decrease MSCs effectiveness in salvaging neuronal cells. However, IFN-γ, a commonly used prelicensing cytokine to increase MSC potency, led to a decrease in the effectiveness of MSCs in this model. Chapters 3 and 4 define the changes that occur to several of MSCs’ trophic factors including immunomodulatory and growth factors and how these alterations affect MSC interactions with macrophages and T cells. Because validation and tracking of locally injected products can be cost-prohibitive for many research groups, Chapter 5 lays out a low-cost method to track fluorescently labeled cells in local injections to skin to aid in minimization of variability in results obtained from animal wound healing models. These findings demonstrate that initial preparation of MSC therapeutics is critical to their efficacy in local injection. Therefore, careful testing of potency for large-scale MSC production pipelines should be evaluated to ensure the efficacy of the resulting product. Additionally, spheroids exhibit differences in the mechanisms of action due to alterations in their secretome which can be partly overcome with co-administration of steroids such as budesonide. Therefore, steroid co-administration with MSCs being considered for local application should be further explored for use in local delivery of MSCs for the treatment of inflammatory conditions. Finally, this research demonstrates the need to further understand the mechanisms by which spheroids alter their gene and trophic factor production to better tailor MSC therapies for disease specific localized injection.