As células-tronco mesenquimais (CTMs) tornaram-se um grande interesse para a ciência por serem capazes de estimular a regeneração tecidual, apresentarem habilidade de se expandir e diferenciar em cultura e, consequentemente, apresentarem diversas possibilidades terapêuticas, bem como para a engenharia de tecidos. Muitos dos tecidos dentários também apresentam nichos de CTMs. O fácil acesso à polpa dos dentes decíduos, em virtude da esfoliação dental, a torna uma fonte muito atraente para a terapêutica e a engenharia de tecidos. Todos os avanços advindos das terapias baseadas em células-tronco tornam a preservação das fontes celulares, por longos períodos de tempo, um assunto de suma importância. Para que isso possa ocorrer, métodos de armazenamento devem ser adotados, tanto para as culturas celulares já estabelecidas, quanto para os tecidos inteiros. Uma das formas mais comuns de manutenção de culturas e de tecidos é a criopreservação em nitrogênio líquido. Contudo, existem poucas evidências no sentido de estabelecer um protocolo eficaz para o congelamento do dente decíduo intacto. Dessa forma, esse trabalho objetivou isolar, cultivar e caracterizar, para parâmetros apresentados para CTMs, as células pulpares após a criopreservação de dentes decíduos intactos por 7 dias. Para isso, vinte e seis dentes decíduos foram alocados em 2 grupos experimentais, sendo: grupo 1, células pulpares de dentes decíduos criopreservados intactos (grupo Crio) e grupo 2, células pulpares de dentes decíduos isoladas imediatamente após a exodontia (grupo fresco - controle). As células pulpares de ambos os grupos foram isoladas, cultivadas, analisadas por citometria de fluxo (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 e HLA-DR), submetidas aos protocolos de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, e aos ensaios de proliferação celular (WST-8). A morfologia celular de ambos os grupos foi avaliada por microscopia confocal. Os resultados demonstraram uma taxa de cultivo de 30% para o grupo Crio e 61% para o grupo Fresco. Não houve diferença estatística entre os grupos para os marcadores de superfície analisados. As células de ambos os grupos foram capazes de se diferenciar em células das 3 linhagens testadas. Para o ensaio de proliferação, não houve diferença estatística entre os grupos ao longo dos tempos testados (p>0,05), embora a média de dias entre o isolamento e a quinta passagem foi menor para o grupo controle (p=0,035). As células do grupo Crio mostraram morfologia alterada. Assim, conclui-se ser possível obter células-tronco da polpa de dentes decíduos congelados pelo protocolo sugerido, sem alterações imunofenotípicas. No entanto, esse protocolo demonstrou baixas taxas de sucesso de isolamento, menor capacidade de diferenciação e de proliferação, além de alteração da morfologia celular. / Mesenchymal stem cells (MSC) became of great value for science for being capable of stimulating tissue regeneration and showing ability to proliferate and differentiate when cultured properly. Dental tissues also present MSC niches as well. Mesenchymal stem cells from the pulp of deciduous teeth are considered an easy access source during a specific period of time in the patients life, when teeth are undergoing exfoliation; therefore, very attractive for cell based therapeutics and tissue engineering. All advances seen in cell based therapies for the last years depend on cell or tissue preservation for long periods of time. Thus, storage methods must be adopted for cultures of cells and whole tissues. The most common technique to preserve cell cultures and tissues is cryopreservation with liquid nitrogen. However, fragile evidence concerns the cryopreservation of intact deciduous teeth. This research aimed to isolate, cultivate and characterize the dental pulp cells of intact cryopreserved deciduous teeth and compare to the dental pulp cells of non-cryopreserved deciduous teeth. Thirteen pairs of deciduous teeth were donated from patients in orthodontic treatment and were randomly allocated in two different groups. The first group was made of cryopreserved intact deciduous teeth (Cryo group), and in second group pulp cells were isolated from fresh teeth (Fresh group). The cells of both groups were isolated, cultivated and characterized for mesenchymal stem cell parameters, and then compared for isolation and proliferation rates, surface markers expression (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 and HLA-DR), differentiation ability and morphology. The culture rate was 30% for the cryopreserved group and 61% for the fresh. There were no statistical differences between the groups for the surface markers tested. Cells in both groups were capable of differentiating in the 3 mesenchymal lineages. For the proliferation assay, there was no statistical difference between groups throughout the time tested although the mean time between isolation and the fifth passage was lower for the control group (p=0,035). Cells from Cryo group showed altered morphology. The present study showed that Dental Pulp Stem Cells can be obtained from cryopreserved intact deciduous teeth without changes in the immunophenotypical profile, however low success rates for isolation, differentiation ability and morphological alterations were observed.

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos. / The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles.

A produção de peixes em cativeiro somente é possível com reprodução artificial, e sabe-se que a manipulação em peixes é um estímulo estressor. Devido ao crescente interesse no bem-estar animal, anestésicos estão sendo utilizados para a manipulação em peixes. O eugenol é um anestésico natural que possui ampla disponibilidade no mercado, apresenta baixo custo e é considerado seguro para o manipulador e para o meio ambiente. O objetivo desse estudo foi verificar se o uso de diferentes concentrações de eugenol (0, 30, 40, 50 e 60 mg/L), no manejo reprodutivo de Rhamdia quelen, causa alterações nos perfis do cortisol plasmático dos reprodutores e se influencia na qualidade do sêmen fresco e descongelado. Foram utilizados 75 machos de R. quelen sexualmente maturos, com peso de 500 g, selecionados aleatoriamente e distribuídos nos cinco tratamentos conforme as doses de eugenol utilizadas. Foram avaliadas as seguintes variáveis: taxa e tempo de motilidade, concentração espermática, taxa de fertilização, funcionalidade mitocondrial, integridade de membrana e de DNA, morfologia espermática e concentração de cortisol plasmático. Os animais anestesiados com as concentrações de 40 e 50 mg/L de eugenol apresentaram menores níveis de cortisol plasmático comparados ao controle, ou seja, se estressaram menos. A utilização de 30, 40 e 50 mg/L de eugenol manteve a qualidade seminal do sêmen fresco, já no sêmen descongelado, a qualidade foi mantida com o uso de 30 e 40 mg/L de eugenol. Esses resultados evidenciam que é possível conciliar a redução do estresse com a produção, pois cortisol plasmático foi reduzido e os parâmetros seminais se mantiveram após os tratamentos. / The production of fish in captivity is only possible with artificial reproduction, and it is known that the handling is a stressful stimulation to the fish. Currently, the interest in animal welfare has been increased. Therefore anesthetic have been used to make the handling of the fish. Eugenol is a natural anesthetic that has a broad market availability, is inexpensive and is considered safe for the handler and the environment. The aim of this study was to determine whether the use of different concentrations of eugenol (0, 30, 40, 50 and 60 mg/L) in the reproductive management of Rhamdia quelen cause changes in the profiles of plasmatic cortisol and quality of fresh and thawed semen. Seventy five males of R. quelen sexually mature and weighing 500 g, were randomly selected and distributed in five treatments according to the dose of eugenol used. The following variables were evaluated: motility and time of motility, sperm concentration, fertilization rate, mitochondrial function, membrane and DNA integrity, sperm morphology and concentration of plasmatic cortisol. The animals anesthetized with concentrations of 40 and 50 mg/L of eugenol showed lower plasmatic cortisol levels compared to the control, therefore they were less stressed. The use of 30, 40 and 50 mg / L of eugenol maintaining sperm quality of fresh semen, whereas the quality of thawed is maintained with the use of 30 and 40 mg / L of eugenol. These results show that it is possible conciliate animal welfare with the production, since the seminal parameters were not altered.

Cryopreservation and transplantation of germ cells in fish provides a suitable tool for preserving genetic information. By method of surrogate reproduction, the offspring with characters of the chosen donor can be obtained. In this case of our commercially important species common carp. However, for the successful cryopreservation of the germ cells, a suitable protocol for each species must be established. Several cryoprotectants were tested. The best of them, Me2SO, regarding the viability of spermatogonia, was tested for its different concentrations depending also on the rate of freezing. Further testing, related to the effect of tissue size, incubation time and added sugar, was performed. The result of the assay identified best cryomedium composed of 2.5M dimethylsulfoxide, added sugar of 0.3M glucose, 1.5% BSA and 25nM Hepes dissolved in PBS. The most suitable size of tissue was 100 mg, incubation time was 30 min and coolig rate was -1 ° C/min. This protocol ensures the highest viability rate of cryopreserved spermatogonia of common carp. The second part of the work was to verify the success of the transplantation of cryopreserved and fresh spermatogonia into a suitably chosen recipient, the goldfish, which shares similar reproductive characteristics with carp, but also offers reduction of space requirements or resistance to koi-herpes virus. The transplanted germ cells colonized the germ line and started gametogenesis in 42.5% (cryopreserved spermatogonia) and 52.5% (fresh spermatogonia) goldfish recipients, which demonstrated that the transplantation of cryopreserved spermatogonia of common carp can be successfully achieved.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-25Bitstream added on 2014-06-13T20:05:47Z : No. of bitstreams: 1 marques_ma_dr_jabo_prot.pdf: 467698 bytes, checksum: e31b751e758e7554b3d188b4c1760ea2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Este trabalho foi conduzido com duas espécies arbóreas do gênero Anadenanthera (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata (angico-do-cerrado) e A. colubrina var. cebil (angico-vermelho), com os objetivos de (a) confirmar a classificação das sementes quanto ao comportamento fisiológico no armazenamento e quanto à longevidade; (b) conservar a qualidade fisiológica das sementes a médio prazo; (c) testar métodos de secagem para reduzir, com segurança, o teor de água das sementes a baixos níveis; (d) armazenar as sementes desidratadas em temperatura inferior a zero, visando à conservação a longo prazo. As sementes foram desidratadas sobre soluções salinas saturadas, sobre sílica gel e por liofilização. As sementes desidratadas foram armazenadas por diferentes períodos nos ambientes de sala de laboratório, câmara seca, câmara fria, freezer, ultra-freezer e nitrogênio líquido fase vapor. Foram avaliados o teor de água, a capacidade germinativa e o vigor das sementes. As duas espécies são ortodoxas e de curta longevidade quando armazenadas na sala de laboratório. Os três métodos de secagem foram eficientes para reduzir o teor de água das sementes. As sementes conservaram sua qualidade fisiológica a médio prazo quando (a) acondicionadas em embalagem permeável e armazenadas em câmara seca; (b) acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em câmara fria; (c) liofilizadas, acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em sala de laboratório. As sementes desidratadas suportaram o armazenamento em temperaturas baixa e ultra-baixa, demonstrando possibilidades de serem conservadas a longo prazo. / This work was carried out with two brazilian tree species of the Anadenanthera genus (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata and A. colubrina var. cebil , with the objectives of (a) to confirm the seed classification concerning both to the physiological behaviour during storage and to the longevity; (b) to conserve the seed physiological quality in medium-term storage; (c) to test drying methods for reduce safely to low values the seed moisture content; (d) to store dried seeds at sub-zero temperatures for a long-term storage. The seeds were dried over saturated salt solutions, over silica gel and by freeze-drying methods. Dried seeds were stored during different periods at room temperature, dry chamber, cold chamber, freezer, ultra-freezer and liquid nitrogen vapour phase. During storage, seed moisture content, germinability and vigour were evaluated. Seeds of both species showed orthodox behaviour and short longevity when stored at room temperature. The three drying methods were effective to reduce safely the seed moisture content. In medium-term storage, seeds maintained their physiological quality when (a) packaged into permeable container and stored at dry chamber; (b) packaged into impermeable container and stored at cold chamber; (c) freeze-dried, packaged into impermeable container and stored at room temperature. Dried seeds tolerated both low and ultra-low storage temperatures, showing possibility for long-term storage.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-28Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000823842_20160728.pdf: 48543 bytes, checksum: 0a0e4c6e3217335eb5c3eedceb8b2a73 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-29T12:53:53Z: 000823842_20160728.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-29T12:54:47Z : No. of bitstreams: 1 000823842.pdf: 2103625 bytes, checksum: bf645c43dd091bc121630fa032a1e708 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / FAPESP: 11/08798-6

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:48:51Z : No. of bitstreams: 1 lopes_ts_me_jabo.pdf: 688516 bytes, checksum: 27e94cbe3ca54f1add6bd864e9eea47c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo – 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 543911 bytes, checksum: ca6b1ec9421af89b1154b235d7101304 (MD5) Previous issue date: 2008-10-03 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / This study was carried out to develop some protocols for cryopreservation of sugarcane germplasm in liquid nitrogen at -196°C. The exposure time of the shoot tips encapsulated in the laminar flow chamber for obtaining the moisture contents of 30, 20 and 10% was determined in an assay. The results were analyzed and interpreted, by using the free R software. The medium points of each time under evaluation were united by straight line segments, as drawing a tendency line for the moisture loss. Then, with the aid of horizontal lines referring to moisture contents of 30, 20 and 10%, the drying times were directly identified in the graph at 5.7; 7.45 and 10.1 hours, respectively. To induce the tolerance of the shoot tips to drying process, the preculture was accomplished in liquid culture medium enriched with 0.3; 0.5 and 0.75M sucrose for one and two days. The entirely randomized experimental design was used under a factorial scheme 3X2X4 (sucrose concentrations, preculture time and drying time) with three replicates. The survival index data were analyzed and interpreted, by using the free R software. The variance analysis was performed and the averages were compared by the Tukey test at 5% significance, when necessary. According to the results, the following conclusions were drawn: independently of the preculture time to be one or two days, the preculture in the culture medium enriched with 0.3M sucrose was ideal to induce the tolerance of the tissues to drying; the shoot tips were sensitive to the concentration of 0.75M sucrose in the preculture solution. The 12h culture of the shoot tips in the basic culture medium resulted into reactivation of their metabolism through accumulation of the starch grain, besides the recovery of the stress generated by its extraction. The intensity of the starch synthesis was increased, when the shoot tips were precultured in the liquid culture medium containing sucrose at concentrations 0.30; 0.50 and 0.75M. In the cryopreservation of the encapsulated shoot tips, the effect of the sucrose concentration, drying time and defrosting method were studied under a factorial 3X4X3 (three sucrose concentrations, four drying times and three defrosting methods). Independently of the combination adopted when the shoot tips were cryopreserved, a null survival index was obtained. The histological analyses revealed that both cells and cellular walls of the cryopreserved explants were severely damaged. / O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de protocolos para criopreservação, em nitrogênio líquido a -196°C, de germoplasma de cana-de-açúcar. O tempo de exposição dos ápices caulinares encapsulados a câmara de fluxo laminar para a obtenção dos teores de umidade de 30, 20 e 10% foi determinado através de um ensaio e os resultados obtidos foram analisados e interpretados utilizando o software livre R. Os pontos médios de cada tempo avaliado foram unidos por segmentos de reta traçando uma linha de tendência de perda de umidade. Posteriormente, com o auxílio de linhas horizontais referentes aos teores de umidade de 30, 20 e 10%, os tempos de secagem foram identificados diretamente no gráfico em 5,7; 7,45 e 10,1 horas, respectivamente. Para induzir a tolerância dos ápices caulinares à secagem foi realizado o pré-cultivo em meio de cultura líquido enriquecido com 0,3; 0,5 e 0,75 M de sacarose por um e dois dias. O experimento foi organizado em um esquema fatorial 3X2X4 (concentrações de sacarose, tempo de pré-cultivo e tempo de secagem) segundo o delineamento inteiramente casualizado com três repetições. Os dados do índice de sobrevivência obtidos foram analisados e interpretados utilizando o software livre R. Foi realizada a análise de variância e quando necessário as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Os resultados indicaram que o pré-cultivo em meio de cultura enriquecido com 0,3 M de sacarose, independentemente se por um ou dois dias, foi ideal para induzir a tolerância dos tecidos à secagem. Os ápices caulinares foram sensíveis à concentração de 0,75 M de sacarose na solução de pré- cultivo. O cultivo por 12 horas dos ápices caulinares em meio básico de cultura resultou além da recuperação do estresse gerado pela sua extração, a reativação do seu metabolismo através do acúmulo de grão de amido. A síntese de amido aumentou em intensidade quando os ápices foram pré- cultivados em meio de cultura líquido contendo sacarose nas concentrações de 0,30; 0,50 e 0,75 M. Na criopreservação dos ápices caulinares encapsulados, estudou-se o efeito de três fatores, concentração de sacarose, tempo de secagem e o método de descongelamento, em um fatorial 3X4X3. Independentemente da combinação adotada quando os ápices caulinares foram criopreservados o índice de sobrevivência obtido foi nulo. As análises histológicas revelaram que as células e a parede celular dos explantes criopreservados foram severamente danificadas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 263642 bytes, checksum: 195cdf514e6803579fcdd159348f0be0 (MD5) Previous issue date: 2008-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objectives of this study were to verify if the propolis and ascorbic acid contain effect on plasmatic membrane integrity of goats spermatozoa as well as investigate the potential of these antioxidants on the use of goats spermatozoa cryopreservation extenders. Semen from five adults goats were used, totalizing 5 semen samples for each one. After semen collection, the evaluation consisted of physical and morphological exam, live and dead cells (supravital test) and hyposmotic swelling test. Afterwards, the fresh semen was diluted, homogenized, divided on 5 equal parts and centrifuged. The spermatozoa pellet was raised with respective treatment: T1 (BIOXCELL® - CONTROL); T2 (BIOXCELL® + 0,25% of propolis extract); T3 (BIOXCELL® + 0,5% of propolis extract); T4 (BIOXCELL® + 0,05% of ascorbic acid); e T5 (BIOXCELL® + 0,25% of ascorbic acid). After final dilutions, it was evaluated the sperm motility and vigor on each treatment, and posterior seal. The straws were cooled at 4 - 5 °C during 35 minutes in a plastic container containing methyl alcohol and 25 minutes out of container. The pre-freezing was done in liquid nitrogen vapour, during 14 minutes. Then, the straws were immersed in nitrogen. The thawing of the samples was made by immersion of the straws in a 37 °C water-bath for 30 minutes to evaluate the sperm motility and vigor, supravital test, hyposmotic swelling test and thermoresistence test. In fresh semen, the physical and morphological aspects, supravital test and hyposmotic swelling test not differ (P>0,05) between animals and between races. There was no correlation of appearance and whirlpool with other variables. There was mean and negative correlation (r = -0,46) between the volume and hyposmotic swelling test. The sperm motility showed average and positive correlation with sperm vigor (r = 0,52) and supravital test (r = 0,55). There was high and positive correlation (r = 0,73 and 0, 69) between major and minor defects sperm with defects totals. There was mean and negative correlation (r = -0,40) between major defects sperm and hyposmotic swelling test, not being seen with the minor defects. The average sperm motility of the diluted semen (pre-cooling) of all treatments, showed no difference between them (P>0,05), however, the averages of sperm vigor of diluted semen showed difference (P<0,05) among treatments, where the T1 and T3 were different from T4 and equals to T2 and T5. The general average of motility and vigor sperm on treatments immediately after thawing and after three hours of thermoresistence test differed among themselves (P<0,05), where the T4, T5 and T1 were similar and higher than T2 and T3. The general average values observed in supravital test and hyposmotic swelling test post-thawing differed (P<0,05) among treatments, in which the T4, T5 and T1 were similar and higher than T2 and T3. The values observed on supravital test showed high and positive correlation with sperm motility in all treatments. In T1, T4 and T5 had high and positive correlation (r = 0,63; r = 0,64; r = 0,71; respectively) between the values in supravital test and hyposmotic test. The values observed in the hyposmotic test and sperm motility showed high and positive correlation in T1 (r = 0,78) and T5 (r = 0,65) and correlation mean and positive in T4 (r = 0,44). Both at the time of thawing (0 hour) as the end of the thermoresistence test (3 hours), the supravital test and sperm motility showed no correlation with the motility sperm of treatments this study. But at the time of thawing, the average values observed in hyposmotic test of fresh semen showed average and positive correlation with sperm motility of T1 and T2, and high and positive correlation with the T5 motility sperm. Similarly, at 3 hours of thermoresistence test, there was average and positive correlation with sperm motility of T1, T4 and T5. It was concluded that: the ascorbic acid maintained structure integrity of the spermatozoa membrane during cryopreservation process as well as its viability after thermoresistence test, and may be an alternative in the composition of extenders for cryopreservation of semen goats; the propolis was not effective in maintaining the integrity and viability sperm after thawing, showing to be toxic to spermatozoa at concentrations of 0,25 and 0,5%; and the hyposmotic test in fresh semen was effective in predicting the semen freeze, as well as, its viability in the end of the thermoresistence test of three hours. / Os objetivos deste estudo foram verificar se a própolis e o ácido ascórbico têm efeito sobre a integridade da membrana plasmática dos espermatozóides de caprinos, bem como, investigar o potencial destes antioxidantes no uso de meios diluidores de criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco bodes adultos das raças Alpina (n = 2) e Saanen (n = 3). Para as coletas de sêmen, utilizou-se a vagina artificial, onde se obteve cinco ejaculados por animal. Após a coleta, fez-se o exame físico do sêmen e morfológico dos espermatozóides, teste supravital e teste hiposmótico. Em seguida, o sêmen in natura foi diluído, homogeneizado, dividido em cinco alíquotas iguais e centrifugados. O sobrenadante foi desprezado e cada pellet de espermatozóides foi ressuspendido com diluente, de acordo com os tratamentos: T1 (BIOXCELL® - CONTROLE); T2 (BIOXCELL® + 0,25% de extrato liofilizado de própolis); T3 (BIOXCELL® + 0,5% de extrato liofilizado de própolis); T4 (BIOXCELL® + 0,05% de ácido ascórbico; e T5 (BIOXCELL® + 0,25% de ácido ascórbico). Após as diluições finais, foram avaliados a motilidade e o vigor espermático de cada tratamento, e posterior envase. As palhetas foram resfriadas a 4 - 5 ºC, durante 35 minutos em refil de plástico contendo álcool metílico, e posteriormente, 25 minutos fora do mesmo. O pré-congelamento foi realizado em vapor de nitrogênio líquido, durante 14 minutos. Após esse período, as palhetas foram imersas no nitrogênio para o congelamento final do sêmen. As doses foram descongeladas em banho-maria a 37 °C por 30 segundos, e acondicionadas em tubos plásticos de 1,5 mL e homogeneizados para análise imediata de motilidade e vigor espermático, teste supravital, teste hiposmótico e teste de termo-resistência. No sêmen in natura, os aspectos físicos e morfológicos, teste supravital e teste hiposmótico não diferiram (P>0,05) entre os animais e entre raças. Não houve correlação do aspecto e do turbilhonamento com as demais variáveis. Houve correlação média e negativa (r= -0,46) entre o volume e o teste hiposmótico. A motilidade espermática apresentou correlação média e positiva com vigor (r = 0,52) e o teste supravital (r = 0,55). Houve correlação alta e positiva (r = 0,73 e 0, 69) entre defeitos espermáticos maiores e menores com os defeitos totais. Houve relação média e negativa (r = -0,40) entre os defeitos espermáticos maiores e o teste hiposmótico, não sendo observado com os defeitos menores. Não houve diferença (P>0,05) entre as médias da motilidade espermática do sêmen diluído (pré- resfriamento), em todos os tratamentos, porém, as médias do vigor espermático do sêmen diluído apresentaram diferença (P<0,05) entre os tratamentos, onde o T1 e T3 foram diferentes do T4 e iguais aos T2 e T5. As médias gerais da motilidade e do vigor espermático nos tratamentos logo após o descongelamento e após três horas de TTR diferiram entre si (P<0,05), onde T4, T5 e T1 foram similares e superiores aos T2 e T3. Os valores médios gerais observados no teste supravital e no teste hiposmótico pós- descongelamento diferiram (P<0,05) entre os tratamentos, em que T4, T5 e T1 foram similares e superiores ao T2 e ao T3. Os valores obtidos no teste supravital apresentaram correlação alta e positiva com a motilidade espermática, em todos os tratamentos. Nos T1, T4 e T5 houve correlação alta e positiva (r = 0,63; r = 0,64; r = 0,71; respectivamente) entre os valores registrados nos testes supravital e hiposmótico. Os valores observados no teste hiposmótico e a motilidade espermática apresentaram correlação alta e positiva nos T1 (r = 0,78) e T5 (r = 0,65) e correlação média e positiva no T4 (r = 0,44). Tanto no momento do descongelamento (0 hora) quanto ao final do TTR (3 horas), o teste supravital e a motilidade espermática do sêmen in natura não apresentaram correlação com as motilidades espermáticas dos tratamentos deste estudo. Porém, no momento do descongelamento, os valores médios observados no teste hiposmótico do sêmen in natura apresentaram correlação média e positiva com a motilidade espermática do T1 e T2, e correlação alta e positiva com a motilidade espermática do T5. Da mesma forma, às 3 horas de TTR, verificou-se correlação média e positiva com a motilidade espermática do T1, T4 e T5. Concluiu-se que: o ácido ascórbico manteve a integridade estrutural da membrana dos espermatozóides durante o processo de criopreservação, bem como sua viabilidade após o teste de termo-resistência, podendo ser uma alternativa na composição de diluentes para criopreservação de sêmen caprino; a própolis não se mostrou eficaz na manutenção da integridade e viabilidade espermática pós-descongelamento, mostrando ser tóxica aos espermatozóides nas concentrações de 0,25 e 0,5 %; o teste hiposmótico realizado no sêmen in natura se mostrou eficaz em predizer a congelabilidade da amostra de sêmen, bem como, sua viabiliadade ao final do teste de termo-resistência de três horas.