Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-27T16:44:19Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese Semen congelado e inseminação artificial em cães.pdf: 1290427 bytes, checksum: 577b12487088c3d576b6d6746216a3bf (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-28T16:11:22Z (GMT) / Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-28T16:23:19Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese final completa.pdf: 1312682 bytes, checksum: dd7bc1c4c462c9d0da09cfa142d48ea4 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A data (mês) que consta na capa e folha de rosto do trabalho deve ser a mesma que consta na folha de aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-28T16:27:18Z (GMT) / Submitted by CARMEN CECÍLIA SICHERLE null (carmensicherle@terra.com.br) on 2016-09-28T16:38:54Z No. of bitstreams: 1 Carmen C Sicherle Tese completa.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-28T17:14:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sicherle_cc_dr_bot.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:14:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sicherle_cc_dr_bot.pdf: 1312570 bytes, checksum: 9e105448cb368db57c02753ea8a7cf32 (MD5) Previous issue date: 2016-08-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos da criopreservação sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de cão. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram colhidos 4 ejaculados de 5 cães (n=20), os quais foram avaliados no sêmen fresco, resfriado e descongelado. A motilidade total (MT), progressiva (MP) e porcentagem de rápidos (RAP) por sistema computadorizado e por citometria de fluxo, a fluidez da membrana plasmática [Yo-Pro 1 (YP) e merocianina 540 (M540)], a translocação da fosfatilidil serina (FS) (anexina V e FITC-PSA), integridade da membrana plasmática e acrossomal (iodeto de propídeo (IP) combinado ao FITC-PSA), potencial da membrana mitocondrial (JC1), lipoperoxidação dos lipídeos de membrana (LPO, C11-BODIPY) e apoptose (CellEvent®). O sêmen do cão que apresentou melhores resultados numéricos em todas as análises foi escolhido para ser utilizado separadamente para as inseminações (cão 1) e o sêmen dos demais 4 cães foram utilizados em pool. Foram inseminadas 20 cadelas (2 IAs/cadela), por via transcervical (TCIA) sendo 10 delas com o cão 1 e 10 com o pool. Foram utilizadas 2 concentrações espermáticas (160 e 450 x 106 espermatozoides/TCIA). Houve diferença para os índices de motilidade (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado para todos os índices avaliados, (MT = 87,00 ± 1,24; 88,15 ± 1,38; 72,55 ± 6,26); (MP = 69,95 ± 1,28 ; 71,75 ± 1,91; 56,30 ± 6,00) e (RAP = 83,15 ± 1,94; 81,55 ± 1,53; 64,30 ± 7,68). Em relação a fluidez da membrana espermática houve diferença na porcentagem da população de células íntegras (CI) e de células com aumento de fluidez de membrana (CIMF) (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado, (CI = 78,29 ± 6,22; 75,76 ± 6,60; 23,02 ± 9,12); (CIMF = 18,33 ± 5,54; 22,55 ± 6,49; 71,78 ± 9,85). Sobre a identificação da translocação da FS houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células íntegras nos 3 momentos avaliados (CI = 79,90 ± 7,95; 63,50 ± 4,66; 27,19 ± 9,22). A porcentagem de células apresentado a membrana plasmática e acrossomal íntegras foi diferente (p < 0,01) também entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado (MPAI = 85,71 ± 6,22; 70,37 ± 6,43; 30,87 ± 9,90). Quanto ao potencial da membrana mitocondrial houve diferença (p < 0,01) na porcentagem de células com alto potencial mitocondrial nos 3 momentos avaliados (APM = 85,15 ± 2,76; 60,52 ± 3,31; 38,06 ± 6,40). A LPO da membrana plasmática foi diferente (p < 0,05) no sêmen congelado quando comprado ao resfriado mas não teve diferença entre o sêmen fresco e resfriado e do fresco ao congelado. Não foi observada qualquer diferença, nos momentos estudados, na atividade da caspase. O cão 1 foi significamente melhor para os índices de integridade de membrana plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial. Pelo calculo da resposta média do animal e limites mínimos e máximos, apesar de não haver diferença, observamos que o animal 1 apresentou melhores valores pós descongelação para todas os testes realizados. O aumento na concentração espermática foi positivo e observamos 50% de prenhez no grupo inseminado com o pool de sêmen utilizando a concentração de 450 x 106. Nenhuma gestação foi observada nas TCIA com o sêmen do cão 1. Em conclusão a criopreservação leva a alterações estruturais e funcionais da célula espermática, o que explica a sua sobrevivência curta após a descongelação. As mudanças semelhantes a crio-capacitação podem estar relacionadas a outros fatores, como as proteínas do plasma seminal que ainda não são totalmente conhecidas nesta espécie. O processo de apoptose pode ser iniciado com a abertura dos poros mitocondriais durante o processo de congelação/descongelação, o que libera fatores pro-apoptóticos no citoplasma celular. O potencial mitocondrial não está relacionado com a motilidade dos espermatozoides, mas sim com a sobrevivência do espermatozoide. Melhores resultados de gestação puderam ser obtidos quando mais de 100 x 106 de espermatozoides móveis e morfologicamente íntegros for utilizados por TCIA. Não houve relação entre a qualidade seminal, avaliada pelas técnicas aqui descritas, e a fertilidade. / The aims of the study were to assess individual characteristics and sperm concentration of cryopreserved semen characteristics using different structural and functional analysis and dog fertility. Twenty ejaculates were collected from 5 dogs and sperm were cryopreserved by one-step protocol. To better understand dog semen quality after thawing five healthy mature dogs were used to the one-step sperm cryopreservation protocol. Sperm analysis was performed at three time points: after collection, refrigeration, and after thawing, by computer sperm motility analysis (total [TM] and progressive motility [PM], and rapid sperm), membrane damage (membrane fluidity and viability - Yo-Pro 1 and merocianina 540, phosphatidyl serine translocation – annexin – V – propidium iodide - PI, acrosomal and membrane integrity FITC-PSA – PI), mitochondrial potential (JC-1), membrane lipid peroxidation, LPO (BODIPY 581/591 C11) and apoptosis (kit CellEventTM Caspase-3/7- FITC Green Flow Cytometry), evaluated by flow cytometry. Twenty bitches were inseminated by transcervical intrauterine (TCAI), twice using 2 sperm concentration (160 and 450 x 106 spermatozoa/TCAI). A decrease on frozen/thawed semen comparing to fresh and cooled semen occurred for the parameters of total and progressive motility (TM 87.00 ± 1.24, 88.15 ± 1.38, 72.55 ± 6.26; PM 69.95 ± 1.28, 71.75 ± 1.91, 56.30 ± 6.00, fresh cooled and frozen/thawed respectively P < 0.01), percentage of rapids (83.15 ± 1.94, 81.55 ± 1.53, 64.30 ± 7.68 P < 0.01), membrane fluidity and cell viability (78.29 ± 6.22, 75.76 ± 6.60, 23.02 ± 9.12 P < 0.01) and acrosomal and membrane integrity (85.71 ± 6.22, 70.37 ± 6.43, 30.87 ± 9.90 P < 0.01). Sperm cells were affect for cooling and freezing process when analyzed for the translocation of phosphatidyl serine (79.90 ± 7.95, 63.50 ± 4.66, 27.19 ± 9.22 P < 0.01) and high mitochondrial potential (85.15 ± 2.76, 60.52 ± 3.31, 38.06 ± 6.40 P < 0.01). For LPO significant difference was observed in semen after thawing only comparing to cooled semen (16.57 ± 5.44, 16.22 ± 2.43, 23.00 ± 4.13 P < 0.05). No difference on caspase activity was observed. Dog 1 was significantly better for the parameters of plasma membrane and acrosome integrity and mitochondrial potential. By calculating the average of the animal response and minimum and maximum limits, although there is no difference, we observed that the semen from Dog 1 displayed better post thaw values for all analyzes. The pregnancy rate was 0% for dog 1 and 50% for pool at concentration 450 x 106 spermatozoa. In conclusion, cryopreservation leads to structural and functional changes in sperm cell, which explains their short survival after thawing. The cryo-capacitation like changes can be related to others factors, as the seminal plasma proteins that are not know yet on this species. Apoptosis process can be initiated with the opening of mitochondrial pores during the freezing/thaw process, which releases pro-apoptotic factor on the cytoplasm. The mitochondrial potential is not related to sperm motility but sperm survival. Although the dog 1 displayed better sperm quality, no pregnancy was observed, which makes us to rethink the prediction of fertility of semen samples by commonly used parameters. The concentration dose used for AI procedures must consider motility and sperm viability to satisfactory pregnancy rates. / FAPESP: 2013/02050-5

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA088.pdf: 670172 bytes, checksum: 978ec4d11d867f3e2959dae1534f76a9 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The viability evaluation of animal cells subjected to different cryopreservation strategies is important for studies in cell culture, application in animal cloning and the establishment and maintenance of gene banks. The aim of this study is optimize a method for cryopreservation of bovine somatic cells in different containers using different cryoprotectants. For this purpose, three experiments were conducted using bovine skin fibroblast cells obtained by ear biopsy explantation by ear biopsy of a female Flemish breed. In the first experiment the cells were cryopreserved in cryotubes at fixed concentration of 1x106 cells/mL and in three freezing culture medium (1) culture medium +10% DMSO, (2) culture medium + 10% propylene glycol, (3) culture medium + 10% ethylene glycol. In the second experiment the freezing was performed with the same solutions used in experiment 1, however, the cells were cryopreserved in 0.25 mL and 0.5 mL straws. In the third experiment cells in different concentrations, (0.33x106 cells/mL, 1x106 cells/mL, 3x106 cells/mL and 5x106 cells/mL) were cryopreserved in 0.5 mL straws with culture medium + 10% propylene glycol. In all experiments, the cells were thawed in waterbath at 37 oC for evaluation of cell survival by trypan blue method and by the cell growth curve after 72 h in culture, moreover, in the first experiment was carried out the population doubling time test (PDT). The data were analyzed by analysis of variance with pairwise comparisons between groups by the Tukey test, with significance level of 5%. In first experiment there was no significant difference between groups using different cryoprotectants and the time of cell division, estimated by PDT, ranged from 15.9 to 16.5 hours.In the second experiment no significant difference in the survival rate between groups was observed, regardless of the cryoprotectant used, and considering the 0.25 and 0.5 mL straws. In the growth curve, the survival performance of cells cryopreserved in 0.25 ml straws was statistically inferior to that frozen in 0.5 mL straws and cryovials. In this experiment all groups had significantly lower survival results campared to the control group. In the third experiment, the cell concentrations that presented a better survival rate after thawing were 0.33x106cells/ mL and 1x106 cells /mL. Based on the results obtained it follows that straws can be used for freezing cells and the straws of 0.5 mL showed results consistent with those obtained by cryotubes. Likewise the use of PG can be a viable alternative for the freezing somatic cells / A avaliação da viabilidade de células animais submetidas à criopreservação é importante para estudos em cultivo celular, aplicação em clonagem animal e para o estabelecimento e manutenção de bancos genéticos. O objetivo do trabalho é otimizar uma metodologia de criopreservação de células somáticas bovinas utilizando diferentes recipientes e crioprotetores. Para tanto, três experimentos foram conduzidos utilizando células fibroblásticas de origem cutânea foram obtidas por meio de biópsia auricular de uma fêmea da raça Flamenga. No primeiro experimento, as células foram criopreservadas em criotubos na concentração fixa de 1x106 células/mL em três soluções de congelamento (1) meio de cultivo +10% de DMSO; (2) meio de cultivo + 10% de Propileno glicol; (3) meio de cultivo + 10% de Etileno glicol. No segundo experimento, o congelamento foi realizado com as mesmas soluções crioprotetoras utilizadas no experimento um, porém as células foram criopreservadas em palhetas de 0,25 mL e 0,5 mL. No terceiro experimento, foram testadas diferentes concentrações celulares, (0,33x106 cel/mL, 1x106 cel/mL, 3x106 cel/mL e 5x106 cel/mL) que foram criopreservadas em palheta de 0,5 mL utilizando-se meio de cultivo + 10% propileno glicol. Em todos os experimentos, as células foram descongeladas em banho maria a 37 oC para avaliação da sobrevivência celular pelo método de azul de Tripan e avaliação da curva de crescimento celular após 72 h de cultivo, além disso, no primeiro experimento foi realizado o teste de population doubling time (PDT) e no segundo e terceiro experimento o grupo controle foi realizado com células criopreservadas em criotubo utilizando a solução de congelamento composta meio de cultivo +10% de DMSO. Os dados foram analisados através da análise de variância com comparações pareadas entre grupos pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5%. No primeiro experimento, não houve diferença significativa entre os grupos utilizando diferentes crioprotetores e o tempo de divisão celular estimado pelo PDT variou de 15,9 a 16,5 horas. No segundo experimento, a taxa de sobrevivência pós descongelamento, considerando as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, não apresentou diferença significativa entre os grupos, independente do crioprotetor utilizado. Já na curva de crescimento, a sobrevivência das células criopreservadas em palhetas de 0,25 mL apresentou um desempenho estatisticamente inferior às congeladas em palhetas de 0,5 mL e criotubos. Neste experimento todos os grupos apresentaram resultados de sobrevivência significativamente inferiores ao grupo controle. No terceiro experimento as concentrações celulares que apresentaram melhores resultados de sobrevivência após o descongelamento foram de 0,33x106 cel/mL e 1x106 cel/mL. Com base nos resultados obtidos conclui-se que é possível utilizar palhetas para o congelamento de células e que as palhetas de 0,5 mL apresentaram resultados compatíveis aos obtidos com criotubos. Da mesma forma o uso de PG pode ser uma alternativa viável para o congelamento de células somáticas

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA184.pdf: 964703 bytes, checksum: 9b63fdeda6cbc9b89c700c8427b99a28 (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / The cryopreservation of somatic cells has been highlighted not only in the preservation of germplasm, but also in the maintenance of genotypes used for the induction of pluripotency, development of strains and cloning by nuclear transfer. The study of the effects of controlled stress in somatic cells or gametes have shown that, in addition to providing increased survival under experimental conditions, it may influence other parameters like the growth pattern in culture. Bovine fibroblasts obtained by standard procedure from a cartilage explant were evenly distributed in four experimental groups as described below: fibroblasts in culture were subjected for 4 minutes to negative pressure 200, 500 and 800 mbar, immediately (PN0h) or 3 hours before (PN3h) freezing, performed in a standard solution (10% DMSO in D-MEM). After trypsinization, the cells were loaded in 0.25 mL straws in a concentration of 1 x 106 cells / mL, and total volume of 200 &#956;L. The straws were sealed and stabilized in a refrigerator (5-7 °C) for 30 minutes, and then exposed to nitrogen vapor (4 cm above the surface) for 5 minutes when were dipped therein. Thawing was performed in a water bath at 36 °C for 20 seconds. Fibroblasts not subjected to pressure were used as frozen (CC) and fresh (FC) controls. There was evaluated the post-thaw viability and subsequently the cell replication index, based on the population doubling time (PDT) performed each 24 h intervals, during 8 days. At each evaluation, the cells of one well of each group were trypsinized and the number of viable cells determined by hemocytometric chamber after staining with Trypan Blue. PDT was determined using the algorithm available online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Data were submitted to ANOVA and T student test, with 5% significance level. The average cell survival of control group (89.8%) and PN500 0h (88.1%) were higher than all other groups. The PDT average time of all frozen cells was 33.2 h. The PDT time was similar in fresh (27.5 ± 0.35 h), frozen control (30.1 ± 2.3 h) and PN500 0h (32.4 ± 1.6 h) groups. The lowest PDT time was observed in the PN800 0h (21,9h) group. The freezing in plastic straws with 10% DMSO was adequate to cryopreserve bovine fibroblasts allowing high survival rates. It was not observed negative effects of submission to the negative pressure just before freezing, and the level of 200 and 500 mbar resulted in growth rates similar to the obtained with fresh fibroblasts. Although the negative pressure has not increased cryotolerance in bovine fibroblasts, it determined changes in the behavior of these cells during the post-thaw culture. New evaluations should be performed to assess cells subjected to negative pressure in the development of animal clones / A criopreservação de células somáticas vem se destacando não apenas como aliada na preservação de germoplasma, mas também na manutenção de genótipos utilizados para a indução de pluripotencia, formação de linhagens e clonagem por transferência nuclear. O estudo dos efeitos do estresse controlado em gametas ou células somáticas tem demonstrado que, além de proporcionar maior sobrevivência em condições experimentais, outros parâmetros podem ser influenciados, como por exemplo, o padrão de crescimento em cultivo. Para isto, fibroblastos bovinos de primeira passagem, obtidos por procedimento padrão de explantação de cartilagem, foram distribuídos uniformemente em quatro grupos experimentais conforme descrito a seguir: Fibroblastos em cultivo foram submetidos por 4 minutos à pressão negativa de 200, 500 e 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou 3horas antes (PN3h) do congelamento, realizado em solução padrão (10% DMSO em D-MEM). Após a tripsinização, as células eram envasadas em uma concentração de 1 x 106 células/mL, em palhetas de 0,25 mL, num volume total de 200 &#956;L. As palhetas eram seladas e estabilizadas em geladeira (5-7 &#730;C) por 30 minutos, expostas ao vapor de nitrogênio (4 cm acima da superfície) por 5 minutos, e então mergulhadas no mesmo. O descongelamento era realizado em banho-maria a 36 °C por 20 segundos. Fibroblastos não submetidos à pressão foram utilizados como controles congelado (CC) e fresco (FC). Foram avaliados a viabilidade pós-congelamento, e posteriormente o índice de replicação, baseado no tempo de duplicação da população (PDT) celular, com intervalos de 24h e duração de 8 dias. A cada avaliação, um poço de cada grupo era tripsinizado sendo o número de células viáveis determinado em câmara hemocitométrica, após a coloração com Azul de Trypan. O PDT foi 10 12 determinado utilizando-se o algoritmo disponível online (http://www.doubling-time.com): TD = t x lg2/(lgNt lgN0). Os dados foram submetidos à ANOVA e teste T Student, com 5% de significância. A sobrevivência celular média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foram superiores aos outros grupos. O tempo médio de PDT de todas as células congeladas foi 33,2h; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h), o menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). As palhetas plásticas se mostraram adequadas para o congelamento de fibroblastos bovinos, não sendo observados efeitos negativos da submissão à pressão negativa imediatamente antes do congelamento, sendo os valores de 200 e 500 mbar os que possibilitaram as melhores taxas de crescimento. Muito embora o emprego de pressão negativa não tenha aumentado a criotolerância de fibroblastos bovinos, determinou mudanças no comportamento destas células durante o cultivo pós-descongelamento. Novas avaliações devem ser realizadas para avaliar a qualidade das células submetidas à pressão negativa, no desenvolvimento de clones animais

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-19Bitstream added on 2014-06-13T19:59:04Z : No. of bitstreams: 1 rocha_as_me_botfmvz.pdf: 334752 bytes, checksum: 8483e7af4f994ca7fc71b7f2189b4764 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição da asolctina de soja ou da fosfatidilcolina de soja em diluente à base de gema de ovo sobre os parâmetros espermáticos e índices de fertilidade de sêmen congelado de garanhões. No Experimento I, dezenove ejaculados de três garanhões foram submetidos ao processo de criopreservação utilizando três diluentes de congelação: Botu-Crio® (BC), Botu-Crio® adicionado de asolctina de soja (BC+Ac) e Botu-Crio® adicionado de fosfatidilcolina de soja (BC+Fc), para posterior avaliação dos parâmetros de cinética espermática e integridade de membrana plasmática. No Experimento II, comparou-se a taxa de fertilidade referente aos três meios de congelação por meio de inseminação artificial das éguas com “pool” de espermatozoides dos três garanhões. Não houve diferença significativa no que se refere aos parâmetros espermáticos (P<0,05) de motilidade total (69,16±9,28; 64,63±11,05; 68,47±7,92), motilidade progressiva (25,00±5,43; 23,26±5,63; 26,16±5,50), integridade de membrana plasmática (39,37±8,82; 39,95±9,52; 41,63±9,24) e índice de concepção (46,7%, 13,3%, 37,5%) entre os meios BC, BC+Ac e BC+Fc, respectivamente. Entretanto, existiu uma tendência a maior (P>0,05) taxa de fertilidade do diluente Botu-Crio® quando comparado ao meio adicionado de asolctina de soja. Diante dos resultados encontrados, conclui-se que tanto a adição da asolctina de soja quanto da fosfatidilcolina de soja ao diluente Botu-Crio® apresenta a mesma eficácia que o diluente Botu-Crio® convencional na criopreservação de sêmen equino / The aim of this study was to evaluate the effect of addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine in an egg yolk-based extender on sperm parameters and fertility rates of frozen stallion semen. In Experiment I, nineteen ejaculates from three stallions were submitted to cryopreservation process using three freezing extenders: Botu-Crio™ (BC), Botu-Crio™ with soybean asolectin (BC+Ac) and Botu-Crio™ with soybean phosphatidylcholine (BC+Fc), for further evaluation of kinetic parameters and sperm plasma membrane integrity. In Experiment II, the fertility rates from the three freezing extenders were compared through artificial insemination in mares using a sperm “pool” of three stallions. No significant differences were found on sperm parameters (P<0.05) of total motility (69.16±9.28; 64.63±11.05; 68.47±7.92); progressive motility (25.00±5.43; 23.26±5.63; 26.16±5.50); plasma membrane integrity (39.37±8.82; 39.95±9.52; 41.63±9.24) and fertility rates (46.7%, 13.3%, 37.5%), for the BC, BC+Ac and BC+Fc groups, respectively. However, the tendency toward higher (P>0.05) fertility rates in Botu-Crio™ (BC) freezing extender than the freezing extender containing soybean asolectin (BC + Ac). Based in these results, it is concluded that the both addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine to Botu-Crio™ freezing extender has the same effectiveness as the conventional Botu-Crio™ used in the cryopreservation of equine semen

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:59:06Z : No. of bitstreams: 1 lima__mr_me_jabo.pdf: 1535432 bytes, checksum: 7fba3e3ae5e6792c02b0d8168157e36d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Dentre as biotecnologias aplicadas à reprodução animal, atualmente um dos maiores desafios é a criopreservação de embriões PIV. Esses embriões apresentam alta criosensibilidade, devido principalmente a excessiva deposição lipídica no citoplasma, e que por sua vez está relacionada com a utilização de SFB nos meios. Neste trabalho foram avaliados os efeitos da suplementação protéica com BSA, SFB e FE e suas associações na PIV de embriões bovinos durante as etapas de MIV e CIV, visando melhorar sua criotolerância. Na MIV foram utilizadas sete diferentes combinações (SFB, BSA, FE, BSA+SFB, BSA+FE, SFB+FE e BSA+SFB+FE), e no CIV quatro tratamentos (BSA, BSA+SFB, BSA+FE e BSA+SFB+FE). Os embriões em estádios de Bl e Bx foram vitrificados e após seu reaquecimento foram avaliadas as taxas de eclosão embrionária em 24 e 48 horas. Dos oócitos colocados em maturação, obteve-se um total de 85,4% de clivagem e 35,52% de produção embrionária. Ao analisar os efeitos da fonte protéica na MIV notou-se que o grupo tratado com BSA apresentou as piores taxas de clivagem (80,96%) (p<0,05) em relação aos demais grupos, o melhor resultado de produção embrionária foi obtido com BSA+SFB (46,69%) e os melhores índices de eclosão embrionária pós reaquecimento foram nos tratamentos BSA+FE (44,35%), SFB+FE (44,90%) e BSA+SFB+FE (42,48%). Quando se avaliou os efeitos de fonte protéica na CIV, não houve diferença significativa entre os tratamentos quanto a clivagem, o BSA apresentou o pior desempenho na produção de embriões (31,88%) (p<0,05) em relação aos demais grupos que não diferiram entre si, e os melhores índices de eclosão embrionária 24 e 48h pós reaquecimento foram obtidos com o tratamento BSA+FE (37,64% e 51,34%, respectivamente) / Among the biotechnology applied to animal reproduction, nowadays one of the biggest challenges is the cryopreservation of embryos produced in vitro. These embryos have a high cryosensitivity, mainly due to excessive fat deposition in the cytoplasm, which in turn is related with the FCS used in the mediums for embryo production in vitro. The aim of this study was to evaluate the effects of protein supplementation with BSA, FBS and FE, and their associations in IVP bovine embryos during the stages of IVM and IVC, to improve their cryotolerance. For IVM were used seven different combinations (FCS, BSA, FE, BSA + FCS, BSA + FE, FE and FBS + BSA + FCS + FS), and four treatments during IVC (BSA, BSA + FCS, BSA + FE, BSA+ FE+ FCS). Embryos in stage of Bl and Bx were vitrified and after their reheating the rates of hatched blastocysts at 24 and 48 hours were evaluated. Of the oocytes placed into maturation, we obtained 85.4% of cleavage and 35.52% of embryo produced. When were evaluated the effects of protein source in IVM was noted that the BSA-treated group showed the worst rates of cleavage (80.96%) (p <0.05) compared to other groups, the best result of embryo production was obtained with FCS + BSA (46.69%) and the highest rates of hatched blastocysts after rewarming were obtained with FE + BSA (44.90%), FE + FCS (44.35%) and FS + FCS + BSA ( 42.48%). When we assessed the effects of protein source in the IVC, there was no significant difference between treatments for the cleavage, the BSA group had the worst performance in the production of embryos (31.88%) (p <0.05) compared to other groups that not differ, and the highest hatched blastocysts in 24 and 48 hours after rewarming were obtained by treating BSA + FE (37.64% and 51.34%, respectively)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-17Bitstream added on 2014-06-13T20:59:38Z : No. of bitstreams: 1 gonzalescadavid_v_me_jabo.pdf: 429592 bytes, checksum: 2cf62512218e0651d7acdf97deb6dd74 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O experimento foi realizado em uma suinocultura de produção comercial da linhagem Topigs, utilizando dez machos reprodutores, com o objetivo de avaliar o efeito das suplementações intramusculares com vitaminas e minerais (Selen- Fos® e Zimag®) na qualidade espermática do sêmen in natura e após a congelação. Foram realizadas duas análises estatísticas: Multivariada para descrição das alterações observadas; ANOVA utilizando o modelo inteiramente casualizado. As variáveis seminais analisadas foram: volume, concentração, turbilhonamento, motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides vivos, mortos, e vivos sem acrossomo, morfologia e integridade da membrana (Teste hiposmótico). O experimento foi dividido em duas fases. Na primeira fase o sêmen in natura dos 10 cachaços foi avaliado e posteriormente congelado. Uma vez terminada esta fase iniciou-se a segunda fase onde sete animais receberam as suplementações com vitaminas e minerais via intravenosa e três permaneceram sem recebê-las. Após um período de 60 dias contados a partir do dia da administração das vitaminas e dos minerais se iniciaram novamente as coletas de sêmen e as avaliações tanto in natura como o descongelado. O sêmen in natura apresentou melhor qualidade espermática quando comparado com o sêmen descongelado e o sêmen dos cachaços que receberam as suplementações tiveram melhora (p 0,05) significativa na qualidade do sêmen e na criotolerância / The experiment was conducted in a commercial swine production using ten boars of Topigs® line. The aim was to evaluate the effect of intramuscular supplementation of vitamins and minerals (Selen-Fos® and Zimag®) on fresh semen quality and after freezing. Two statistical analysis were used: multivariate description of the observed changes and ANOVA with randomized design. Analyzed seminal variables were: concentration, turbilhamento, motility, vigor, percentage of live sperm, dead and alive without acrosome, morphology and membrane integrity (HO). The experiment was divided into two phases. In the first phase, the fresh semen of 10 boars was evaluated and subsequently frozen. About three days after the freezing process, the semen was thawed and the quality was assessed. After this in the second phase, seven boars received intramuscular supplementation of minerals and vitamins and three boars received without the supplementation for control. About 60 days later, all these boars were submitted to semen collection and the semen was again evaluated both, fresh and thawed. The fresh semen showed better quality than the frozenthawed in the two phases of the experiment (p< 0,05). The semen of boars that received the supplementation had a significant improvement on semen quality and freezing resistant (p< 0,05)

Resumo: Este trabalho foi conduzido com duas espécies arbóreas do gênero Anadenanthera (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata (angico-do-cerrado) e A. colubrina var. cebil (angico-vermelho), com os objetivos de (a) confirmar a classificação das sementes quanto ao comportamento fisiológico no armazenamento e quanto à longevidade; (b) conservar a qualidade fisiológica das sementes a médio prazo; (c) testar métodos de secagem para reduzir, com segurança, o teor de água das sementes a baixos níveis; (d) armazenar as sementes desidratadas em temperatura inferior a zero, visando à conservação a longo prazo. As sementes foram desidratadas sobre soluções salinas saturadas, sobre sílica gel e por liofilização. As sementes desidratadas foram armazenadas por diferentes períodos nos ambientes de sala de laboratório, câmara seca, câmara fria, freezer, ultra-freezer e nitrogênio líquido fase vapor. Foram avaliados o teor de água, a capacidade germinativa e o vigor das sementes. As duas espécies são ortodoxas e de curta longevidade quando armazenadas na sala de laboratório. Os três métodos de secagem foram eficientes para reduzir o teor de água das sementes. As sementes conservaram sua qualidade fisiológica a médio prazo quando (a) acondicionadas em embalagem permeável e armazenadas em câmara seca; (b) acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em câmara fria; (c) liofilizadas, acondicionadas em embalagem impermeável e armazenadas em sala de laboratório. As sementes desidratadas suportaram o armazenamento em temperaturas baixa e ultra-baixa, demonstrando possibilidades de serem conservadas a longo prazo. / Abstract: This work was carried out with two brazilian tree species of the Anadenanthera genus (Mimosaceae): A. peregrina var. falcata and A. colubrina var. cebil , with the objectives of (a) to confirm the seed classification concerning both to the physiological behaviour during storage and to the longevity; (b) to conserve the seed physiological quality in medium-term storage; (c) to test drying methods for reduce safely to low values the seed moisture content; (d) to store dried seeds at sub-zero temperatures for a long-term storage. The seeds were dried over saturated salt solutions, over silica gel and by freeze-drying methods. Dried seeds were stored during different periods at room temperature, dry chamber, cold chamber, freezer, ultra-freezer and liquid nitrogen vapour phase. During storage, seed moisture content, germinability and vigour were evaluated. Seeds of both species showed orthodox behaviour and short longevity when stored at room temperature. The three drying methods were effective to reduce safely the seed moisture content. In medium-term storage, seeds maintained their physiological quality when (a) packaged into permeable container and stored at dry chamber; (b) packaged into impermeable container and stored at cold chamber; (c) freeze-dried, packaged into impermeable container and stored at room temperature. Dried seeds tolerated both low and ultra-low storage temperatures, showing possibility for long-term storage. / Orientador: Ivor Bergemann de Aguiar / Coorientador: Antonio Carlos de Souza Medeiros / Banca: Márcia Balistiero Figliolia / Banca: Claudio Jose Barbedo / Banca: Rinaldo Cesar de Paula / Banca: Teresinha de Jesus Deléo Rodrigues / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Coorientador: Marini Melo / Coorientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Marco Antonio Alvarenga / Banca: Ian Martin / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição da asolctina de soja ou da fosfatidilcolina de soja em diluente à base de gema de ovo sobre os parâmetros espermáticos e índices de fertilidade de sêmen congelado de garanhões. No Experimento I, dezenove ejaculados de três garanhões foram submetidos ao processo de criopreservação utilizando três diluentes de congelação: Botu-Crio® (BC), Botu-Crio® adicionado de asolctina de soja (BC+Ac) e Botu-Crio® adicionado de fosfatidilcolina de soja (BC+Fc), para posterior avaliação dos parâmetros de cinética espermática e integridade de membrana plasmática. No Experimento II, comparou-se a taxa de fertilidade referente aos três meios de congelação por meio de inseminação artificial das éguas com "pool" de espermatozoides dos três garanhões. Não houve diferença significativa no que se refere aos parâmetros espermáticos (P<0,05) de motilidade total (69,16±9,28; 64,63±11,05; 68,47±7,92), motilidade progressiva (25,00±5,43; 23,26±5,63; 26,16±5,50), integridade de membrana plasmática (39,37±8,82; 39,95±9,52; 41,63±9,24) e índice de concepção (46,7%, 13,3%, 37,5%) entre os meios BC, BC+Ac e BC+Fc, respectivamente. Entretanto, existiu uma tendência a maior (P>0,05) taxa de fertilidade do diluente Botu-Crio® quando comparado ao meio adicionado de asolctina de soja. Diante dos resultados encontrados, conclui-se que tanto a adição da asolctina de soja quanto da fosfatidilcolina de soja ao diluente Botu-Crio® apresenta a mesma eficácia que o diluente Botu-Crio® convencional na criopreservação de sêmen equino / Abstract:The aim of this study was to evaluate the effect of addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine in an egg yolk-based extender on sperm parameters and fertility rates of frozen stallion semen. In Experiment I, nineteen ejaculates from three stallions were submitted to cryopreservation process using three freezing extenders: Botu-Crio™ (BC), Botu-Crio™ with soybean asolectin (BC+Ac) and Botu-Crio™ with soybean phosphatidylcholine (BC+Fc), for further evaluation of kinetic parameters and sperm plasma membrane integrity. In Experiment II, the fertility rates from the three freezing extenders were compared through artificial insemination in mares using a sperm "pool" of three stallions. No significant differences were found on sperm parameters (P<0.05) of total motility (69.16±9.28; 64.63±11.05; 68.47±7.92); progressive motility (25.00±5.43; 23.26±5.63; 26.16±5.50); plasma membrane integrity (39.37±8.82; 39.95±9.52; 41.63±9.24) and fertility rates (46.7%, 13.3%, 37.5%), for the BC, BC+Ac and BC+Fc groups, respectively. However, the tendency toward higher (P>0.05) fertility rates in Botu-Crio™ (BC) freezing extender than the freezing extender containing soybean asolectin (BC + Ac). Based in these results, it is concluded that the both addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine to Botu-Crio™ freezing extender has the same effectiveness as the conventional Botu-Crio™ used in the cryopreservation of equine semen / Mestre

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Marcelo Rezende Luz / Banca: Maricy Apparício Ferreira / Resumo: Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / Abstract: The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PedroHASL_Dissret.pdf: 4618668 bytes, checksum: 5bca73a0220258bdbd17a75573adb995 (MD5) Previous issue date: 2009-08-31 / Oral and facial bone defects can undertake appearance, psychosocial well-being and stomathognatic function of its patients. Over the yerars several strategies for bone defect regeneration have arised to treat these pathologies, among them the use of frozen and irradiated bone allograft. Manipulation of bone grafts it s not determined yet, and several osteotomy alternatives can be observed. The present work evaluated with a microscope the bone fragments obtained from different osteotomy methods and irrigation on rings and blocks allografts irradiated and frozen at 80? negative in a rabbit model. The study is experimental in vitro and it sample was an adult male New Zealand rabbit. The animal was sacrificed to obtain long bones, that were submitted to freezing at 80? negative and irradiated with Cobalt- 60. Then the long bones were sectioned into 24 bone pieces, divided into 4 groups: G1 (n=06) osteotomy was performed with bur No. 6 forming rings with 5 mm thickness with high-speed handpiece with manual irrigation; G2 (n=06) osteotomy was performed with bur No. 6 forming rings with 5 mm thick with surgical motor with a manual irrigation rotation 1500 rpm; GA (n=06), osteotomy with trephine using manual irrigation with saline; and GB (n=06), osteotomy with trephine using saline from peristaltic pumps of surgical motor. Five bone pieces of each group were prepared for analysis on light microscopy (LM) and one on electronic scan electronic microscopy (SEM). On the SEM analysis edges surface, presence of microcracks and Smear Layer were evaluated. Analyzing osteotomy technics on SEM was observed: increased presence of microcracks cutting with high speed; increased presence of areas covered by Smear Layer when cutting with motor implant. The irrigation analysis with SEM was observed: that the presence of microcracks does not depend on the type of irrigation; on manual irrigation, there was greater discrepancy between the cutting lines. The descriptive analysis of the osteotomy and irrigation process on LM showed: histological analysis showing the bony margins with clear tissue changed layer, composed of blackened tissue of charred appearance near to the cortical bone; on the edges of the bony part, bone fragments that were displaced during the bone cut and bone irregularities were observed. After analysis of results we can conclude: that there was greater regularity of the bone cut using high-speed handpiece than using motor implant; the cut with trephine using saline irrigated from peristaltic pumps of surgical motor showed greater homogeneity when compared with manual irrigation; charred tissue was found in all obtained bone samples, whit no significant statistically difference on the proportion of carbonization of the two analysed technics / Os defeitos ?sseos bucais e faciais comprometem a apar?ncia, o bem estar psicossocial e a fun??o estomatogn?tica dos seus portadores. Diante da necessidade de tratamento dessas patologias, surgiram, com o decorrer do tempo, diversas estrat?gias para a regenera??o de defeitos ?sseos, dentre elas o uso de aloenxerto ?sseo congelado e irradiado. A manipula??o dos enxertos ?sseos ainda n?o est? determinada, podendo-se observar v?rias alternativas de osteotomia. Este trabalho avaliou microscopicamente os fragmentos ?sseos obtidos por diferentes m?todos de osteotomia e de irriga??o sobre an?is e blocos de aloenxertos irradiados e congelados a 80?C negativos de coelho. O estudo ? do tipo Experimental in vitro e teve como amostra 01 coelho, adulto, da ra?a New Zealand. O animal foi sacrificado para obten??o de ossos longos, os quais foram congelados a 80? negativos e irradiados com Cobalto-60. Em seguida, os ossos foram seccionados em 24 pe?as ?sseas, divididos em quatros grupos: G1 (n=06) foi realizado a osteotomia com broca esf?rica n? 6 formando an?is com 5 mm de espessura com caneta de alta rota??o com irriga??o manual; G2 (n=06) foi realizado a osteotomia com broca esf?rica n? 6 formando an?is com 5 mm de espessura com motor cir?rgico com irriga??o manual a uma rota??o de 1500 rpm; GA (n=06), osteotomia com trefina usando irriga??o manual com soro fisiol?gico; e GB (n=06), osteotomia com trefina usando soro fisiol?gico proveniente de bombas perist?lticas do motor cir?rgico. De cada grupo, cinco pe?as ?sseas foram destinadas ? an?lise em Microscopia de Luz (ML) e uma analisada por Microscopia Eletr?nica de Varredura (MEV). A an?lise por ML levou em considera??o a presen?a de tecido carbonizado. Na an?lise por MEV levou em considera??o: superf?cie das bordas; presen?a de microfissuras e Smear Layer. Ao analisar a t?cnica de osteotomia utilizando MEV observa-se: maior presen?a de microfissuras ao corte com alta rota??o; maior presen?a de ?reas cobertas por uma camada de smear layer em cortes com motor de implante. Na analise da irriga??o com MEV observou-se que: a presen?a de microfissuras n?o depende do tipo de irriga??o; na irriga??o manual, verificou-se uma discrep?ncia maior entre as linhas de corte. Ao avaliar descritivamente o processo de osteotomia e irriga??o na ML, verificou-se que: na an?lise histol?gica as margens ?sseas apresentavam uma evidente camada alterada de tecido, composta por um tecido enegrecido de aspecto carbonizado, pr?ximo ao osso cortical; nas margens da pe?a ?ssea foram observados fragmentos ?sseos deslocados durante o corte ?sseo e irregularidades ?sseas. Ap?s an?lise dos resultados, pode-se concluir que: houve maior regularidade do corte ?sseo utilizando caneta de alta rota??o do que motor de implante; o corte com trefina usando irriga??o com bombas perist?lticas do motor de implante se mostrou mais homog?nea quando comparada ? t?cnica com irriga??o manual; tecido carbonizado foi encontrado em todos os esp?cimes ?sseos obtidos, sem diferen?a estatisticamente significativa na propor??o de carboniza??o nas duas t?cnicas de irriga??o estudadas