Orientador: Maeli Dal-Pai-Silva / Resumo: Os peixes são um grupo de organismos de extrema importância ecológica, ambiental e principalmente econômica, devido à produção de carne destinada à alimentação dos seres humanos. A carne é composta basicamente por músculo esquelético, um tecido biológico altamente especializado que constitui cerca de 60% da massa corporal dos peixes, e está intimamente relacionado à fisiologia desses animais. A miogênese e o crescimento do músculo esquelético são dependentes da proliferação e migração de células denominadas mioblastos, que podem levar ao aumento do número de fibras musculares (hiperplasia) e/ou aumento do tamanho das fibras musculares (hipertrofia). Esse crescimento é regulado por diversos sinais extrínsecos, como temperatura e oxigenação, e intrínsecos, como fatores transcricionais, microRNAs, hormônios e nutrientes. Além da proliferação e diferenciação dos mioblastos, o tamanho das fibras musculares também é influenciado por esses fatores através de um delicado balanço entre as vias de sinalização de síntese e degradação proteica. Em peixes, essas redes moleculares que controlam a homeostase e o crescimento do músculo esquelético tiveram uma expansão em seu número de componentes devido a um evento de duplicação total do genoma, que culminou com o aumento da complexidade desses organismos e, possivelmente, para uma maior diversidade biológica. Uma das maneiras de estudar essas vias sinalizatórias e entender a complexidade da regulação do crescimento muscular é através das cu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fish are a group of organisms of extreme ecological, environmental and mainly economic importance, due to the meat production intended for humans. Meat is primarily composed of skeletal muscle, a highly specialized biological tissue that constitutes about 60% of fish body mass, and it is closely related to the physiology of these animals. Myogenesis and skeletal muscle growth are dependent on the proliferation and migration of cells called myoblasts, which can promote an increase in muscle fibre number (hyperplasia) and/or increase in muscle fibre size (hypertrophy). This growth is regulated by several extrinsic signals, such as temperature and oxygenation, and intrinsic signals, such as transcriptional factors, microRNAs, hormones and nutrients. In addition to myoblasts proliferation and differentiation, the muscle fibre sizes are also influenced by these factors through a delicate balance between protein synthesis and degradation signaling pathways. In fish, these molecular networks that control homeostasis and skeletal muscle growth had an expansion in their number of components due to an event of whole genome duplication, culminating with increased complexity and, possibly, a higher biological diversity of these animals. One way to study these signaling pathways and understand the complexity of muscle growth regulation is through primary cell cultures of fish myoblasts. During the myoblast cell culture development, the main stages of myogenesis are recapitulated, such as ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMKA.pdf: 1355556 bytes, checksum: 015ec3f0d664f509359ce4430140c3c1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / The development of the biotechnology has permitted to achieve, among other biotechnological products, many recombinant proteins which are largely used as vaccines, hormones, enzymes and other ways of human therapeutic activity. This is possible because the multidisciplinary: through the technology of the recombinant DNA the region that encode gene of interest is cloned in a system of adequate expression for super-expression of the correspondent protein and, through the technology of bioprocess is possible to increase the obtaining scale of the recombinant product assuring its reproducibility, integrity and functionality. Involving these two areas of knowledge, this works intends to express an heterolog protein, the Canacistatina, deriving from sugar cane, through an eucariotic expression system Sf9/baculovirus. This implies in the construction of a recombining baculovirus, containing the cDNA which codifies to the Canacistatina, and also the characterization of the cultivation of Sf9 cells, and of the process of infection by baculovirus, in kinetics and physiologic therms. In order to obtain these purposes it was done experiments of cultivation of Sf9 cells in Schott bottles of 100 mL, with work volume of 20 mL, in 27° C. In these experiments it was analyzed the optimum conditions of velocity agitation, inoculum s density, culture environment, and also the role of substrates. In relation to these parameters, it was observed that a better cell growth can be conduced in a 100 rpm of agitation, in an inoculum s density of 1x106 cell/ml, using a combination of 1:1 between the mediums SF900 II and TNM-FH (Medium 50%), without the necessity of addition of Bovine Fetal Sorum. This last aspect represents a great advantage in relation to the bioprocesses, in a way that it uses Sf9 cells already known. It was construed the recombining baculovírus containing the Canacistatina s gene through the modified genome of the baculovirus Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus and the infection experiments of Sf9 cells was made under three MOI values (1, 5 e 10 pfu/cell) in the two culture mediums. The betters results indicates to infection of Sf9 cells in 50% Medium using MOI= 5 pfu/cell, conditions that the Canacistatina s productivity reached 28 µg/106cel. / O desenvolvimento da biotecnologia tem permitido a obtenção, entre tantos produtos biotecnológicos, de muitas proteínas recombinantes utilizadas amplamente como vacinas, hormônios, enzimas e outras formas de atividade terapêutica humana. Isto é possível através da multidisciplinaridade, onde por tecnologia do DNA recombinante clona-se a região codificadora do gene de interesse em um sistema de expressão adequado para super-expressão da proteína correspondente e, pela tecnologia de bioprocessos torna-se possível o aumento de escala de obtenção do produto recombinante, garantindo sua reprodutibilidade, integridade e funcionalidade. Envolvendo estas duas áreas do conhecimento, o presente trabalho tem como objetivo a expressão de uma proteína heteróloga, a Canacistatina, natural da cana-de-açúcar, através do sistema de expressão eucariótico células Sf9/baculovírus. Isto abrange a construção de um baculovírus recombinante, contendo o cDNA que codifica para a Canacistatina, e a caracterização do cultivo de células Sf9 e do processo de infecção por baculovírus, em termos cinéticos e fisiológicos. Para estes fins, foram realizados experimentos de cultivo de células Sf9 em frascos Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL, a 27ºC, nos quais foram analisadas as condições ótimas de velocidade agitação, densidade de inóculo, meio de cultura e também o papel dos substratos, obtendo-se que um crescimento celular otimizado pode ser conduzido a 100 rpm de agitação, com densidade de inóculo de 1x106 cel/ml e utilizando uma combinação 1:1 entre os meios SF900 II e TNM-FH (Meio 50%), sem a necessidade de adição de Soro Fetal Bovino. Este último aspecto representa uma grande vantagem em relação aos bioprocessos utilizando células Sf9 já conhecidos. Foi construído o baculovírus recombinante contendo o gene da Canacistatina a partir do genoma modificado de Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus e os experimentos de infecção de células Sf9 foram realizados sob três valores de MOI (1, 5 e 10 pfu/cel) nos dois meios de cultura. Os melhores resultados obtidos apontam para a infecção de células Sf9 em Meio 50% com MOI de 5,0 pfu/cel, condições nas quais a produtividade de Canacistatina alcançou 28 µg/106cel.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002 / O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito da Vitamina C em culturas de queratinocitos humanos submetidos a hipoxia gasosa, quanto a agressao celular e ao estresse oxidativo. O metodo constitui-se no isolamento e cultivo de queratinocitos humanos em 40 garrafas, que foram divididas em quatro grupos: controle, controle com vitamina C, hipoxia e hipoxia com vitamina C. Os queratinocitos foram submetidos a hipoxia por substituicao gasosa no interior das garrafas por uma mistura contendo 95 por cento de nitrogenio e 5 por cento de C02,durante 30 minutos. Foram avaliados a agressao celular atraves de dosagem DHL e o estresse oxidativo pela dosagem de MDA. Os resultados demonstraram que a hipoxia aumentou em cerca de 8 vezes a liberacao de DHL pelos queratinocitos e que a vitamina C foi eficaz em inibir esta agressao. Quanto a producao de radicais livres, a hipoxia dobrou os valores de MDA dos grupos controle, sendo que a vitamina C levou a um aumento de peroxidacao lipidica. Assim, concluimos que a vitamina C foi capaz de diminuir de maneira significante a agressao celular pela hipoxia, havendo entretanto piorado o estresse oxidativo (nao significante) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-12-07T09:54:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7385579 bytes, checksum: 99cc30e3f19fe301d4efd94186b84527 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-07T09:54:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7385579 bytes, checksum: 99cc30e3f19fe301d4efd94186b84527 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos sobre migração celular, flutuações da membrana plasmática, extração de amarras em células, ou em geral, sobre o comportamento de células in vitro são de grande importância para a ciência. Através deles, podemos compreender vários processos biológicos tais como cicatrização de feridas, formação de tumores, divisão celular, tráfego de vesículas, mobilidade celular, comunicação celular entre outros. Neste contexto, é que surge a principal motivação deste trabalho. Para caracterizar o processo de migração de células individuais em cultura, analisamos o comportamento de células tumorais de melanoma B16F10 variando a densidade celular. Observamos que as trajetórias das células são aleatórias, algumas migram em caminhada persistente, enquanto outras giram em torno de si mesmas. Independente da densidade as células migram em um regime de difusão anômalo, indicando uma subdifusão para tempos curtos e uma superdifusão para tempos longos. As distribuições de magnitude das velocidades são do tipo q-Weibull e as autocorrelações das velocidades são de curto alcance. Com o objetivo de verificarmos a relação entre a migração celular e as flutuações da membrana plasmática das células, estudamos as flutuações da membrana das células B16F10 e verificamos que células com muita variação de forma apresentam uma dinâmica do tipo Browniano fracionária com correlações persistentes entre as protusões de lamelipódios e migração em regime superdifusivo, enquanto que células com pouca variação de forma apresentam uma migração subdifusiva. Estudamos também as flutuações da membrana de células normais de melanócito Melan-A e de fibroblasto NIH-3T3, o qual foi dividido em dois grupos: células com forma mais arredondada (grupo 1) e células com forma indefinida (grupo 2). Todas as linhagens demostram que a rugosidade da interface da membrana tem correlação persistente de longo alcance apresentando dinâmica do tipo Browniano fracionária. Observando a média das curvaturas locais e média da energia de curvatura ao longo do tempo de todas as linhagens aqui citadas, e fazendo uma comparação entre as linhagens tumoral B16F10 e normal Melan-A, verificamos que as curvaturas da B16F10, são em média, mais acentuadas e armazenam mais energia na sua forma que a Melan-A. Comparando as células NIH-3T3 grupo I e grupo 2 observamos que as células do grupo 2 armazenam em média mais energia em sua forma do que as células do grupo 1. Através do pinçamento ótico e da microscopia eletrônica de varredura (MEV), caracterizamos as propriedades mecânicas, tensão superficial e rigidez de flexão da membrana, de células das linhagens Melan-A e B16F10. Nossos resultados revelam que a rigidez de flexão e tensão da membrana não variam entre essas duas linhagens. / Studies on cell migration, plasma membrane fluctuations, teather extraction in cells, or in general, the behavior of cells in vitro are of great importance to science. Indeed they can help is to understand several biological processes such as: wound healing, tumor formation, cell division, vesicle trafficking, cellular mobility, cellular communication, etc . In this context, it lies the main motivation of this work. In order to characterize the cell migration process of individual cells in culture, we analyzed the behavior of B16F10 melanoma tumor cells varying cell density. We observed that the trajectories of the cells are random, some migrate on a persistent walk, while others revolve around themselves. Independent of the density, the cells migrate under an anomalous diffusion regime, subdiffusive for short times and a superdiffusive for long times. The speed distributions are q-Weibull and the velocity autocorrelations are short-ranged. In order to explore the relationship between cell migration and cell plasma membrane fluctu- ations, we studied the membrane fluctuations of B16F10 cells. We found that cells with great shape of variation have a fractional Brownian dynamics with persistent correlations between the lamellipodia protrusions, as well as a superdiffusive In contrast cells with little shape variation exhibit a sub-diffusive migration. We also studied the membrane fluctuations of normal Melan-A melanocytes and NIH-3T3 fibroblasts, which are divided into two groups: cells with a more rounded shape (group 1) and cells with indefinite shape (group 2). For all cell lines the membrane roughness has persistent long-range correlation, indicating fractional Brownian dynamics. From the averages of the local curvatures and curvature energies for cell lines tested, we find that the curvatures of B16F10 are on average more pronounced and store more energy in their shape than Melan-A. Comparing the NIH-3T3 cells group 1 and group 2 we observed that the cells of group 2 store on average more energy in their shape than the cells of group 1. Through optical tweezers and scanning electron microscopy (SEM), we characterized the mechanical properties, surface tension and bending rigidity of the cell membrane, of Melan-A and B16F10 cells. Our results show that the bending rigidity and tension of the membrane do not vary between these two cell lines.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O HIV-1 possui uma importante diversidade genética. Essa diversidade decorre das limitações de fidelidade da transcriptase reversa durante a replicação, acentuada pela alta capacidade de geração e pelo rápido turnover viral. A transcrição reversa é um evento crucial do ciclo de vida viral e pode sofrer a influência de diversos fatores, como, por exemplo, o estado de ativação celular e a concentração de deoxrribonucleotídeos. A redução da variabilidade e tamanho das populações quasispecies, como as que acontecem durante a transmissão do HIV-1, coloca em risco a sua sobrevivência. A proposta deste estudo foi analisar a geração da diversidade genética após um ciclo único de replicação usando partículas virais pseudotipadas com envelopes R5 e X4 do HIV-1 em cultivo celular. Para tanto, PBMCs de indivíduos saudáveis foram estimuladas com fitohemaglutinina antes e durante infecção. Células em repouso também foram infectadas. Quarenta e oito clones provirais foram obtidos por End Point-PCR para cada condição. Em seguida, um fragmento de 1050pb do gene pol foi seqüenciado para todos os clones. As mutações acumuladas em um evento único de transcrição viral foram analisadas e comparadas com a seqüência do HIV-1 presente no inóculo original (tempo zero). Os resultados mostraram uma alta taxa de substituições em todas as condições de cultura e a existência de contextos comuns entre as seqüências onde ocorrem as substituições, destacando-se as regiões 200 a 350pb, 400 a 650pb, 750 a 800pb e 950 a 1025pb no grupo R5 e as regiões 375 a 525pb, 600 a 650pb e 775 a 975pb no grupo X4. Nestas regiões, o processo mutacional é intenso, os eventos que mais ocorrem são as transições e as substituições mais freqüentes são as de G para A e de T para C. A taxa mutacional encontrada foi de 2,0 x 10-3 /nt/ciclo no grupo R5 e 1,07 x 10-3 /nt/ciclo no grupo X4, valores muito acima dos comumente encontrados. A distribuição dos sítios onde ocorrem as mutações é influenciada pelo estágio de ativação em que as células alvo se encontram no momento da infecção, com regiões mais sujeitas a variação em segmentos de sequência quando as células estão ativadas. A maior diversidade encontrada no grupo R5 indica um papel importante desta variante viral no estabelecimento da infecção. Esse aumento brusco na diversidade genética viral pode fazer parte de uma estratégia do vírus em recuperar parte diversidade genética perdida na população durante os eventos de transmissão. / HIV-1 has an important genetic diversity that results from the rapid viral turnover rate and from reverse transcritase errors during viral DNA synthesis. Reverse transcription is a crucial step during HIV-1 replication cycle and its accuracy depends on balanced cellular dNTP pools. HIV-1 populations correspond to an organized swarm of mutants named quasispecies. If a quasispecies population goes throught transmission genetic bottlenecks and looses its best adapted variants, the fitness of the entire population is reduced. In the present work we studied the HIV-1 genetic diversity generated after a single replication cycle using CCR5 and CXCR4 pseudotyped particles in cell culture. Resting PBMCs from healthy donors were stimulated with PHA before and during HIV-1 infection. Resting PBMCs were also infected. 48 proviral DNA clones were obtained by End Point-PCR from each infected culture. A 1050pb fragment from pol was sequenced from all clones. All sequences were compared to the original sequence at time 0 and mutations introduced after a single replicartion cycle were tabulated. Observed mutations were not uniformly distributed occurring more frequently between the nucleotide 200 and 350, 400 and 650pb, 750 and 800pb and 950 and 1025pb in R5 pseudotypes and between the nucleotide 375 and 525pb, 600 and 650pb and 775 and 975pb in X4 pseudotypes. G to A and T to C transitions were the most frequent substituition type. The calculated mutational tax was 2,0 x 10-3 /nt/cycle for R5 virus and 1,07 x 10-3 /nt/cycle for X4. Both mutational taxes were higher than the ones currently described for HIV-1. The distribution of sites where mutations occur is influenced by the cellular activation status with mutations clustering in sequence segments in activated cells. R5 pseudotypes accumulated more variation than X4 virus, suggesting that R5 virus host colonization soon after transmission may be a part of a HIV-1 strategy to recuperate the genetic diversity reduction during the transmission bottleneck / FAPESP: 06/51495-6 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-01Bitstream added on 2014-06-13T18:51:18Z : No. of bitstreams: 1 giocondo_mp_me_arafcf.pdf: 1362305 bytes, checksum: 5d252e88df73be4c96290a8a2c37f546 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Diversos estudos buscam identificar compostos com atividade seletiva para celulas tumorais e que possuam mecanismo de acao para desencadear a apoptose. Dentre as substancias isoladas de Cryptocarya sp, algumas estirilpironas, como a goniotalamina, apresentam atividade antiproliferativa e apoptogenica em diferentes linhagens celulares. No presente estudo, foram avaliadas as atividades citotoxica e pro-apoptotica da estirilpirona (criptomoscatona D2) isolada de Cryptocarya mandioccana, em linhagens celulares de carcinoma cervical humano infectada por HPV (HeLa e SiHa), nao infectada (C33A) e fibroblasto pulmonar humano transformado pelo SV-40 (MRC-5). A atividade citotoxica foi avaliada pelo ensaio do MTT e a apoptose foi avaliada, respectivamente, pelos ensaios de anexina V e a expressao de bak/bcl-2, por citometria de fluxo. Para o ensaio do MTT, as celulas foram tratadas com estirilpirona (criptomoscatona D2) nas concentracoes de 15, 30, 60 e 90-ÊM por 6, 24 e 48 horas e por 6 horas com periodo de recuperacao de 24, 48 e 72 horas pos tratamento. Para os ensaios de apoptose, as celulas foram tratadas por 6 horas e periodo de recuperacao de 24, 48 e 72 horas. O tratamento com a estirilpirona (criptomoscatona D2) ocasionou elevada citotoxicidade dose-resposta e tempo-resposta em HeLa, SiHa, C33A e MRC-5. Embora nao haja diferenca estatisticamente significativa de citotoxicidade entre as linhagens, aparentemente a citotoxicidade foi maior em HeLa e C33A (tratamento de 24 e 48 horas) que em MRC-5 e SiHa. Ainda, no periodo de recuperacao, HeLa e SiHa aparentemente restabelecem sua capacidade proliferativa, que e diretamente proporcional ao tempo de recuperacao, enquanto o mesmo comportamento nao e observado em C33A. Ao avaliar a expressao de duas proteinas da via intrinseca de apoptose (bcl-2 e bak), nao foi observada modulacao dessa expressao entre as linhagens celulares, nas diferentes tempos de recuperação pos-tratamento. / Several attempts have been made to identify chemical compounds with selective cytotoxicity against cancer cells and apoptosis trigger activity. Among the substances isolated from Cryptocarya sp, some styrylpyrones, such as goniothalamine, demonstrate antiproliferative and apoptotic activity in abroad human cell lines. In the present study, we evaluated the antiproliferative and apoptotic activities of the styrylpyrone (cryptomoschatone D2) isolated from Cryptocarya mandioccana in HPV-infected (HeLa and SiHa) and non-infected (C33A) human cervical carcinoma cell lines, and in human lung's fibroblast immortalized with SV-40 (MRC-5). The antiproliferative activity was evaluated by the MTT assay and the apoptotic activity was investigated by measuring the expression levels of annexin V and bak/bcl-2 by flow cytometry. In the MTT assay, cells were treated with styrylpyrone (cryptomoschatone D2) at a 15, 30, 60 or 90ìM concentration for 6, 24 or 48 hours as well as for 6 hours followed by a recovery posttreatment period of 24, 48 or 72 hours. In the apoptotic assays, cells were treated for 6 hours followed by a recovery posttreatment period of 24, 48 or 72 hours. High cytotoxicity (dose-response and time-response) was observed in HeLa, SiHa, C33A and MRC-5 cell lines. Although the styrylpyrone cytotoxicity was not significantly different among the cell lines tested, the citotoxicity was apparently higher in HeLa and C33A than MRC-5 and SiHa in the case of treatments for 24 or 48 hours. Moreover, HeLa and SiHa were able to recover their prolifetative status, which were directly proportional to the posttreatment recovery time. On the other hand, C33A did not demonstrate a similar posttreatment recovery. Despite the posttreatment recovery time, the expression of the apoptotic proteins bcl-2 and bak seems not to be modulated by the treatment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-15Bitstream added on 2014-06-13T20:31:52Z : No. of bitstreams: 1 nakao_mp_me_sjc.pdf: 575104 bytes, checksum: 3e65e53ea5787201a2552f5be4884109 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proposta deste estudo foi avaliar a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio (PH) liberado por dois géis clareadores, utilizados para a técnica de consultório, sobre cultura de fibroblastos de polpa humana (FP5). As células foram cultivadas em DMEM. Foram utilizadas células entre a quinta e décima passagens. Colocou-se sobre as células meios de cultura condicionados de acordo com os grupos de estudo (n=4): G1- PH 35% sem fotoativação; G2- PH 35% ativado por luz alógena; G3- PH 35% ativado por diodo emissor de luz (LED); G4- PH 38% sem fotoativação; G5- PH 38% ativado por luz alógena; G6- PH 38% ativado por LED. Uma curva padrão de viabilidade e crescimento celular foi obtida a partir de células que não receberam tratamento (controle). O ensaio com MTT ocorreu após 0, 24 e 48 horas, para avaliar a viabilidade e crescimento celular. Paralelamente, mediu-se colorimetricamente a quantidade de PH liberado nas condições experimentais, utilizando-se solução tampão de acetato no lugar do meio de cultura. Os dados foram analisados através do teste de Dunnet, ANOVA e teste de Tukey. Todos os grupos apresentaram diferença significativa em relação ao controle. O PH 38% apresentou maior citotoxicidade e quantidade de peróxido de hidrogênio liberada que o PH 35% nas condições experimentais. A ativação por luz alógena ocasinou maior citotoxicidade e maior quantidade de PH liberado, e a ativação com LED foi estatisticamente semelhante à ausência de ativação. A avaliação após 48 horas apresentou diferença estatística das avaliações de 0 e 24 horas. Concluiu-se que: a citotoxicidade foi proporcional à concentração do agente clareador; a fotoativação com luz alógena aumentou a liberação de peróxido de hidrogênio, e o metabolismo celular foi menor imediatamente após o contato com o meio condicionado, aumentando após 24 e/ ou48 horas. / The propose of this study was to evaluate hydrogen peroxide (HP) cytotoxicity, from two in office bleaching agents, on human pulp fibroblasts (FP5) culture. The cells were cultured in DMEM. Only cells between fifith and tenth passages were used. Each well of culture plate, corresponding to experimental groups, received conditioned middle according to the experimental groups: G1- HP 35% without light activation; G2- HP 35% activated by halogen light; G3- HP 35% activated by LED; G4- HP 38% without light activation; G5- HP 38% activated by halogen light; G6- HP 38% activated by LED. Viability and growth standard curve was obtained from an untreated group and was used as control. MTT assay was performed in four wells for each group, in periods of 0, 24 or 48 hours, to measure cells viability and growth. Hydrogen peroxide leased in experimental conditions was also measured, using acetate buffer instead culture middle. Results were analyzed by Dunnet test, variance analysis and Tukey test. All experimental groups showed difference from control. The cytotoxicity and quantity of hydrogen peroxide was higher with 38% hydrogen peroxide (Opalescence Xtra Boost) than with 35% hydrogen peroxide (Whiteness HP). Activation by halogen light caused smaller cell growth and viability but higher hydrogen peroxide amount, and LED was statically similar to the group without activation. 48 hours evaluation was different then 0 and 24 hour evaluations. Conclusions: cytotoxicity was proportional to quantity of hydrogen peroxide leased; halogen light activation increased the leased hydrogen peroxide, and cell viability was lower immediately after contact with conditioned middle, increasing after 24 and/or 48 hours.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000388585-0.pdf: 2402252 bytes, checksum: 61c5f710d7d456a08638eac157bdc111 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / The bone marrow besides having a high number of heterogenic cells, like connective, hematopoietics, and neuronal cells, also presents a great number of stem cells. These cells are pluripotent, so can differentiate in any connective cell when a stimulus is given. The aim of this study was to evaluate bone marrow stem cells adhesion, proliferation, and differentiation to osteoblast in vitro, over a collagen membrane and a poli-lactic (glycolic) acid scaffold (PLGA), using either recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP-4) and platelet rich plasma (PRP). Bone marrow cells were aspirated from iliac crest and purify using specifics techniques. These cells were separated in main big groups cultured over collagen membrane and PLGA scaffold. Each culture had 4 distinct treatments: (1) with rhBMP-4; (2) with rhBMP-4 and PRP; (3) with PRP; and (4) control (only standard medium). The groups were evaluated after 6, 9 14 and 21 days. Microscopic analysis of collagen membrane and PLGA scaffold were performed using either Propidium Iodide, and Eosin and Hematoxilin. Real time PCR was performed to identify the expression level of osteopontin and osteocalcin, and standard PCR to osteopontin. The results showed cellular adhesion in both biomaterials, and suggest a higher cell proliferation and differentiation in rhBMP-4 and PRP, and PRP groups. The groups with rhBMP-4 had more differentiate cells that control group. The data obtained here indicate that PRP and/ or rhBMP-4 induce adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow stem cells into osteogenic lineage. / O estroma da medula óssea, além de conter uma população heterogênea de células conjuntivas, nervosas e hematopoiéticas, mantém uma quantidade de células com características de células tronco (células mesenquimais indiferenciadas). Estas possuem capacidade de se diferenciarem em qualquer célula de natureza conjuntiva quando estimuladas pelo organismo. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a adesão, a proliferação e a diferenciação de células mesenquimais da medula óssea cultivadas sobre membrana de colágeno bovino e sobre arcabouço de ácido poliglicólico polilático (PLGA) com a adição do gel de plasma rico em plaquetas (PRP) e/ ou da proteína morfogenética óssea recombinante humana (rhBMP-4). As células foram coletadas da medula óssea da crista do osso ilíaco humana e separadas por técnica específica. As células foram cultivadas em dois suportes: membrana de colágeno e arcabouço de PLGA, e receberam 4 tratamentos distintos: (1) com rhBMP-4, (2) com rhBMP-4 e PRP, (3) com PRP e (4) controle (somente meio de cultura). Os subgrupos foram avaliados em 6, 9, 14 e 21 dias. Foram realizadas análises microscópicas das membranas e arcabouços com as colorações de Iodeto de Propídio e de Hematoxilina e Eosina. Foi feito PCR em tempo real a fim de se avaliar a expressão de osteopontina e osteocalcina e PCR convencional para osteopontina. Os resultados mostraram adesão celular tanto na membrana de colágeno como no arcabouço de PLGA. Sugere-se haver uma maior proliferação e diferenciação celular nos grupos que foram adicionados PRP, e rhBMP-4 e PRP juntos. Nos grupos com rhBMP-4 parece haver uma maior diferenciação celular que o grupo controle. Os dados obtidos indicam que o PRP e/ ou a presença de rhBMP-4 induzem adesão, proliferação e diferenciação de células da medula óssea em células de linhagem osteogênica.

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.