Lors de pathologies pulmonaires inflammatoires chroniques comme la mucoviscidose ou la BPCO, le déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases aboutit à la dégradation du tissu pulmonaire et à l’inactivation des défenses antimicrobiennes. Les cathepsines à cystéine participent à l’inactivation protéolytique de peptides et protéines antimicrobiens (PAMs) pulmonaires comme le SLPI, la lactoferrine, et les β-défensines HBD-2 et -3 lors de l’emphysème ou de la mucoviscidose. Lors de cette thèse, nous avons étudié la capacité des cathepsines à cystéine B, K, L et S à hydrolyser le peptide LL-37, qui est un PAM important dans l’immunité innée pulmonaire. Seules les cathepsines K et S clivent le LL-37 et inactivent efficacement son activité antimicrobienne. A l’inverse, le LL-37 est un inhibiteur compétitif de la cathepsine L. D’autre part, l’expression pulmonaire de la cathepsine S est fortement augmentée chez les individus fumeurs atteints ou non de BPCO. La fumée de cigarette qui est une source importante de stress oxydatif induit une augmentation significative de l'expression et l'activité de la cathepsine S. Malgré un environnement oxydatif non favorable à l'activité des cathepsines, la cathepsine S parvient à hydrolyser le peptide LL-37 et pourrait ainsi augmenter le risque d’exacerbation lors de la BPCO. / During chronic inflammatory lung diseases like cystic fibrosis or COPD, proteases/antiproteases imbalance leads to pulmonary tissue degradation and compromise antimicrobial barrier. Cysteine cathepsins are involved in the proteolytic inactivation of several lung antimicrobial peptides (AMPs) such as SLPI, lactoferrin and β- defensins -2 and -3 during emphysema or cystic fibrosis. During this thesis, we studied the ability of cathepsins B, K, L and S to degrade LL-37, which is an important AMP in lung immunity. Only cathepsins K and S degrade readily LL-37 and inactivate its antimicrobial property. Conversely, LL-37 is a competitive inhibitor of cathepsin L. Beside, lung expression of human cathepsin S is significantly increased in smokers with or without COPD compared to non-smokers. Cigarette smoke that is a major source of oxidative stress significantly increases the expression and activity of cathepsin S. Despite an unfavorable oxidative environment, cathepsin S retains its proteolytic activity toward LL-37 and thus could participate to COPD exacerbation.

abstract: Here I document the breadth of the CAP (Cysteine-RIch Secretory Proteins (CRISP), Antigen 5 (Ag5), and the Pathogenesis-Related 1 (PR)) protein superfamily and trace some of the major events in the evolution of this family with particular focus on vertebrate CRISP proteins. Specifically, I sought to study the origin of these CAP subfamilies using both amino acid sequence data and gene structure data, more precisely the positions of exon/intron borders within their genes. Counter to current scientific understanding, I find that the wide variety of CAP subfamilies present in mammals, where they were originally discovered and characterized, have distinct homologues in the invertebrate phyla contrary to the common assumption that these are vertebrate protein subfamilies. In addition, I document the fact that primitive eukaryotic CAP genes contained only one exon, likely inherited from prokaryotic SCP-domain containing genes which were, by nature, free of introns. As evolution progressed, an increasing number of introns were inserted into CAP genes, reaching 2 to 5 in the invertebrate world, and 5 to 15 in the vertebrate world. Lastly, phylogenetic relationships between these proteins appear to be traceable not only by amino acid sequence homology but also by preservation of exon number and exon borders within their genes. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2016

abstract: Legionella pneumophila is a waterborne pathogen that causes Legionnaires' disease, an infection which can lead to potentially fatal pneumonia. In a culture-based technique, Legionella is detected using buffered charcoal-yeast extract (BCYE) agar supplemented with L-cysteine, Iron salt and antibiotics. These supplements provide essential and complex nutrient requirements and help in the suppression of non-target bacteria in Legionella analysis. Legionella occurs naturally in freshwater environments and for their detection; a sample is plated on solid agar media and then incubated for several days. There are many challenges in the detection of Legionella in environmental waters and the built environments. A common challenge is that a variety of environmental bacteria can be presumptively identified as Legionella using the culture-based method. In addition, proper identification of Legionella requires long incubation period (3-9 days) while antibiotics used in BCYE agar have relatively short half-life time. In order to overcome some of the challenges, Legionella has been genetically modified to express reporter genes such Green Fluorescent Protein (GFP) that can facilitate its detection in process validation studies under controlled laboratory conditions. However, such studies had limited success due to the instability of genetically modified Legionella strains. The development of a genetically modified Legionella with a much rapid growth rate (1-2 days) in simulated environmental systems (tightly-controlled water distribution system) is achieved. The mutant Legionella is engineered by transforming with a specific plasmid encoding CymR, LacZ and TetR genes. The newly engineered Legionella can grow on conventional BCYE agar media without L-Cysteine, Iron salt and only require one antibiotic (Tetracycline) to suppress the growth of other microorganisms in media. To the best of our knowledge, this is the first report of L. pneumophila strain capable of growing without L-Cysteine. We believe that this discovery would not only facilitate the study of the fate and transport of this pathogen in environmental systems, but also further our understanding of the genetics and metabolic pathways of Legionella. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Civil, Environmental and Sustainable Engineering 2018

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa que infecta o xilema das plantas causando muitas vezes a maturação precoce e a diminuição dos frutos. Ela é responsável por importantes perdas na economia, no Brasil é a causadora de doenças de Citrus Variegated Chlorosis (CVC) e a da doença de Pierce nos Estados Unidos. As proteases desempenham funções vitais no ciclo de vida de muitos parasitas, muitas estão envolvidas em processos infecciosos, a Xylellaína é uma cisteíno protease que é diferentemente expressa em cepas patogênicas a não patogênica. A compreensão de seu mecanismo catalítico, através do estudo da sua estrutura e função, pode ajudar no planejamento de inibidores seletivos, potenciais agentes contra as doenças fitopatológicas ocasionadas pela X. fastidiosa. Sua estrutura molecular foi elucidada no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos (USP), estudos estruturais mostraram que a proteína se apresenta na forma de uma pró-proteína, pois está inativa devido a uma pró-região que bloqueia o sítio catalítico. Também foi verificada a presença de um nucleotídeo na estrutura da Xylellaína próximo a pró-região, como hipótese foi considerada a relação entre o nucleotídeo e o mecanismo de ativação da proteína. A influência do nucleotídeo na atividade funcional da enzima foi constatada através da comparação de ensaios enzimáticos entre a enzima nativa e mutantes. As mutações foram planejadas com a intenção de ocasionar a desestabilização do nucleotídeo, por isso foram mutados os resíduos da pró-região que interagem diretamente com o ele. As mutações foram Fenilalanina 45 (F45), Arginina 43 (R43) e F45/R43, todos os resíduos foram mutados para Alaninas (A). Os resultados mostraram que os valores de Km obtidos para a proteína nativa e suas mutantes apresentaram consideráveis alterações quando comparado entre eles, esse efeito não foi percebido para a eficiência catalítica. Conclui-se que as mutações pouco alteraram a capacidade da enzima converter o subsrato em produto, mas houve significantes alterações no reconhecimento do substrato. Esse resultado corrobora com a hipótese de que a existência do nucleotídeo está relacionada com o mecanismo de ativação da proteína. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium which infects the plant xylem system causing in many cases precocious maturation and diminution of fruits. It is responsible for economically important plant diseases, such as the Citrus Variegated Chlorosis (CVC). Proteases might be involved in the infection process by disrupting plant tissue. Xylellain is a cysteine protease which is differently expressed in strain pathogen and non-pathogen of X. fastidiosa. The 3D structure of xylellain was solved by our group and structural studies show that this protein has a proenzyme form and a ribonucleotideo close to the amine terminal region. Our hypothesis is that protein-nucleotide interactions are related to xylellains activation mechanism. To evaluate the influence of the nucleotide in the functional activity of enzyme, point mutations in aminoacids which interact directly with this ribonucleotide were carried out. The point mutations are phenylalanine 45 (F45) and arginine 43 (R43), individually mutated for alanine (A) residues. One way to quantify the changes caused by the alteration of a nucleotide is the direct comparison between the kinetic enzyme assays of native and mutant proteins. Greater variations between the values of Km than in the values of catalytic efficiency were observed. This suggests that the speed of production varied by enzyme-substrate. However the mutations caused little change on the ability of the protease to catalyze the reaction. This result is in agreement with the hypothesis that the nucleotide provides the structural support for the hinge formation on the N-terminal domain, thus directing the inhibitory peptide inside the active site of the enzyme. Therefore, the nucleotide may be exerting regulatory functions in vivo, possibly in the folding or activation of the protein and performance of catalytic function.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T16:45:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DanieleMorgensternAimi.pdf: 5748053 bytes, checksum: d57b44570d4e19a760d7a8379dcc9315 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T16:45:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DanieleMorgensternAimi.pdf: 5748053 bytes, checksum: d57b44570d4e19a760d7a8379dcc9315 (MD5) Previous issue date: 2012-01-09 / The structural and electronic properties of biotin and cysteine molecules interacting with pure, carboxylated and vacancy-type defects carbon nanotubes was evaluated using ab initio simulations. Carbon nanotubes (NTC) have been used for a variety of applications. Among these, we highlight the use of NTC as sensors for biological molecules. Thus, the objective of this work is to use NTC pure carboxylated and defective molecules interacting with biotin and cysteine in the development of nanosensors for these molecules. Our results showed that the interaction between these molecules and the NTC occurs via a physical adsorption with binding energies ranging from 0.22 to 1.91 eV [0.12 to 1.14 eV] for NTC interacting with biotin [cysteine]. For the carboxylated nanostructure higher binding energies are observed. In this way, carboxylated NTC aren’t interesting for interaction with the molecules, because the eventual removal of these NTC had a high energy cost. The physical adsorption between the NTC and the molecules of biotin and cysteine is of great interest for a possible experimental application of NTC as a biological sensor for these molecules. / As propriedades eletrônicas e estruturais das moléculas de biotina e cisteína interagindo com nanotubos de carbono puros, carboxilados e com defeito do tipo vacância foram estudadas fazendo-se uso de simulações computacionais baseadas na Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Os nanotubos de carbono (NTC) vem sendo utilizados para uma série de aplicações. Dentre estas, podemos destacar sua utilização como sensores para moléculas biológicas. O objetivo deste trabalho foi utilizar NTC puros, carboxilados e com defeito interagindo com as moléculas de biotina e cisteína no desenvolvimento de nanosensores para estas moléculas. Os resultados mostraram que a interação entre essas moléculas e os NTC ocorre via uma adsorção física, pois não altera as propriedades dos nanotubos, tendo energias de ligação que variam de 0,22 a 1,91 eV para NTC interagindo com a biotina e 0,12 a 1,14 eV para NTC interagindo com a cisteína, sendo que as energias mais altas, são aquelas às quais as moléculas interagem com os NTC carboxilados. Logo, NTC carboxilados não são os mais indicados para a interação com as moléculas, pois a remoção posterior destas do NTC teria um alto custo energético. A adsorção física entre os NTC e as moléculas de biotina e cisteína é de grande interesse para uma possível aplicação experimental destes NTC como sensores biológicos para estas moléculas.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05228.pdf: 9855037 bytes, checksum: b5470fb3667dc62c4f1f2724b3c7e221 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Orientador: Lauro Tatsuo Kubota / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santhiago_Murilo_M.pdf: 3172484 bytes, checksum: bcff800b6ef070742f997f47ba296774 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de dois sensores amperométricos empregando mediadores redox derivados do grupo nitro imobilizados sobre plataformas nanoestruturadas para a detecção da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e L-cisteína. Para a construção da base das plataformas foram empregados nanotubos de carbono funcionalizados com grupos amino. Uma vez funcionalizada, a plataforma possibilitou o ancoramento dos dois mediadores redox. Para a detecção de NADH foi utilizado o ácido 3,5-dinitrobenzoico como mediador redox. Este mediador foi imobilizado na superfície da plataforma utilizando os catalisadores 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS). Já para o sensor destinado à detecção de L-cisteína, foi necessário a adsorção de nanopartículas de ouro para imobilizar o ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) como mediador redox. Para os estudos eletroquímicos, as espécies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do grupo nitro presente em ambos os mediadores. As plataformas nanoestruturadas foram caracterizadas através de voltametria cíclica, cronoamperometria, MEV e eletrodo de disco rotatório. Os valores das constantes heterogênea de transferência de elétrons (ks) e da velocidade da reação mediador-analito foram ~50 s e 10 - 10 L mols, respectivamente. As curvas analíticas para ambos os sensores foram obtidas aplicando baixos sobrepotenciais e resultaram em limites de detecção e quantificação na faixa de 1,2 - 9,1 mmol L. O sensor para L-cisteína foi aplicado em amostras reais e os resultados obtidos foram estatisticamente iguais quando confrontados com um método comparativo / Abstract: This work describes the development of two amperometric sensors using redox mediators derived from the nitro group immobilized on nanostructured platforms for the detection of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and L-cysteine. Carbon nanotubes functionalized with amino groups were used for the construction of the platforms. Once functionalized, the platform allowed the anchoring of two redox mediators. 3,5-dinitrobenzoic acid was used as redox mediator for NADH detection. This mediator was immobilized on the surface of the platform using the catalysts 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC) and N-hydroxy-succinimide (NHS). For the construction of the sensor for L-cysteine detection, it was necessary the adsorption of gold nanoparticles to receive 5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid as redox mediator. For the electrochemical studies, the hydroxylamine species were electrogenerated in situ from the nitro group present in both mediators. Nanostructured platforms were characterized by cyclic voltammetry, chronoamperometry, SEM and by rotating disk electrode experiments. Rate constant values for the heterogeneous electron transfer (ks) and the kinetic constants for the mediator-analyte reaction were ~50 s e 10 - 10 L mols, respectively. The analytical curves for both sensors were obtained applying low overpotentials and resulted in limits of detection and quantification around 1.2 up to 9.1 mmol L. The sensor for L-cysteine was used in pharmaceutical samples and the results were statistically the same to those obtained with a comparative method / Mestrado / Quimica / Mestre em Química

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao adriane g gamboa.pdf: 1009208 bytes, checksum: bb95e46e7798790f86bb339947708a21 (MD5) Previous issue date: 2010-03-25 / In this work papain inhibitor from A. pavonina was immobilized by covalent bond in polyaniline (PANI) modified with glutaraldehyde (PANIG) for be used as stationary phase for affinity chromatography and then applied in the purification of cysteine proteases bromelain and ficin. The extraction and purification of inhibitors protease from A. pavonina resulted in a yield of 3.9% in the last step of purification. Gel filtration chromatography performed in Sephadex G-75 resin as a purification step resulted in three protein peaks (F1, F2 and F3), but only F1 was used in the experiments of immobilization because of higher specific activity. Immobilization was performed using PANIG. To optimize the immobilization conditions the amount of PANIG in the reaction (5, 10 and 15mg), time (30, 60 and 90 min) and pH (5.0 to 8.0) were varied. The best conditions for immobilization of A. pavonina inhibitor, according to tests performed were 5mg PANIG, reaction time of 30min and pH 7.0. PANIG-I was used as bio-affinity stationary phase for separation of bromelain and ficin. Electrophoresis (SDS-PAGE) performed after the separation process revealed the presence of a single band for both bromelain and ficina, with 28 and 25 kDa, respectively. In this process, ficin was purified 2,60 fold and bromelain 0,89 fold, showing that the use of inhibitors of A. pavonina immobilized in PANIG were efficient in the purification of cysteine proteases. / No presente trabalho um inibidor de papaína extraído de sementes de A. pavonina foi imobilizado por ligação covalente em polianilina (PANI) modificada com glutaraldeído (PANIG), visando a aplicação desse material como fase estacionária para cromatografia de afinidade e sua aplicação na purificação das proteases cisteínicas bromelaína e ficina. A extração e purificação dos inibidores de A. pavonina resultou num rendimento de 3,9% no último passo de purificação. A cromatografia de gel filtração em resina Sephadex G-75 como passo para purificação dos inibidores resultou em três picos protéicos (F1, F2 e F3) dos quais F1 foi utilizado nos experimentos de imobilização por ter apresentado atividade específica mais alta. A imobilização foi feita utilizando-se PANIG. Para otimização das condições de imobilização foram variados na reação a quantidade de PANIG (5, 10 e 15mg), tempo (30, 60 e 90 min) e pH (5,0 a 8,0). As melhores condições para imobilização dos inibidores de A. pavonina, de acordo com os ensaios realizados, foram 5mg de PANIG, tempo de reação de 30min e pH 7,0. PANIG-I foi utilizada como fase estacionária de bioafinidade para separação de bromelaína e ficina. Eletroforese (SDS-PAGE) após o processo de separação revelou a presença de uma única banda, tanto para bromelaína como para ficina, de 28 e 25 kDa, respectivamente. Nesse processo, a ficina foi purificada 2,60 vezes e a bromelaína 0,89 vezes, mostrando que o uso dos inibidores de A. pavonina imobilizados em PANIG foram eficientes na purificação de proteases cisteínicas

Adesivos dentinários aplicados diretamente sobre dentina aumentam a atividade de enzimas endógenas deste tecido que degradam colágeno, colocando em risco a integridade da camada híbrida de restaurações estéticas. Estes adesivos podem também alcançar a polpa dentária indiretamente através do fluído dos túbulos dentinários por substâncias liberadas pelos mesmos. Desta forma, a polpa dentária poderia responder a estas substâncias por meio de síntese e/ou aumento da atividade de colagenases, o que poderia colaborar na degradação da camada híbrida. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito das substâncias liberadas por sistemas adesivos dos tipos autocondicionante e condicione e lave sobre a atividade e a expressão gênica de metaloproteinases (MMPs) e cisteíno-catepsinas (CTs) em células-tronco da polpa dentária humana. Foram aplicados meios de cultura condicionados por adesivos do tipo autocondicionante e condicione e lave polimerizados e não polimerizados sobre culturas celulares por 24 horas. O meio de cultivo fresco foi usado como controle. Depois de 24, 48, 72 e 96 horas, as atividades gelatinolíticas de MMP-2 e de MMP-9 foram avaliadas por meio da técnica de zimografia em gel de gelatina. Nos mesmos tempos experimentais, a modulação da expressão gênica das MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) e das CTs (B e K) foi analisada por meio de reação de transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os resultados obtidos dos dois experimentos foram avaliados por meio do teste estatístico ANOVA, complementado pelo teste de Tukey (p<0.05). Todos os grupos mostraram atividade gelatinolítica aumentada de MMP-2 e MMP-9. Até 72 horas, as atividades foram similares em todos os grupos experimentais. Diferenças significativas apareceram somente em 96 horas. De forma geral, as maiores atividades de MMPs foram observadas nas culturas celulares tratadas com o adesivo autocondicionante. Para a MMP-2, o grupo do adesivo autocondicionante polimerizado mostrou atividade intermediária, enquanto o grupo não polimerizado mostrou a maior atividade. Os dois grupos do adesivo condicione e lave polimerizado e não polimerizado mostraram atividade de MMP-9 intermediária, enquanto o grupo autocondicionante polimerizado mostrou maior atividade que o grupo controle. O qRT-PCR revelou que a maioria das MMPs e CTs analisadas tiveram a expressão gênica positivamente modulada em 24 e 48 horas. MMP-7 e MMP-9 não foram expressos em nenhum grupo experimental. Baseados nas limitações deste estudo in vitro, concluímos que substâncias liberadas por sistemas adesivos são capazes de influenciar células-tronco de polpa dentária humana levando ao aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9 e também à modulação positiva de genes das MMPs e CTS estudadas. / Adhesive systems directly applied to dentin increase the activity of endogenous collagen degrading proteinases of the dentin, which jeopardizes the integrity of the hybrid layer of aesthetic restorations. These adhesives can also reach the dental pulp through the dentinal fluid indirectly by substances leached from them. Then, the dental pulp tissue could respond by synthetizing and/or increasing the activity of collagen proteases, which in turn could collaborate to the hybrid layer degradation. Then, the aim of this study was to evaluate the effect of substances leached from self-etch and etch-and-rinse adhesive systems on the expression and activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine cathepsins (CT-B and CT-K) in human dental pulp stem cells. Culture media conditioned by polymerized or non-polymerized self-etch and etch-and-rinse adhesive systems were applied to the cultures for 24 hours. Fresh medium was used as control. After 24, 48, 72 and 96 hours, the gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9 were assessed by zymography technique. At the same experimental time gene expression of MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) and CTs (B e K) were analyzed with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Data was compared by ANOVA complemented by the Tukey´s test (p<0.05). All experimental groups showed increased gelatinolytic activity for MMP-2 and MMP-9. Until 72 hours, the activities were similar regardless the group. Significant differences appeared only after 96 hours. Overall, the highest activities of MMPs were observed in the cultures treated with the self-etch adhesive. For MMP-2, the group of polymerized self-etch adhesive showed intermediary activity, while the group of non-polymerized adhesive showed the highest activity. Both polymerized and non-polymerized etch-and-rinse adhesive groups showed intermediary MMP-9 activity, while the group of polymerized self-etch adhesive showed higher activity than control. The qRT-PCR revealed that most of MMPs and CTs analyzed presented the gene expression positively modulated at 24 and 48 hours. MMP-7 and MMP-9 were not expressed in any experimental group.Based on the limitations of this in vitro study, it was concluded that substances leached from adhesive systems are able to influence human dental pulp stem cells leading to the increase of the activity of MMP-2 and MMP-9 along with positive modulation of MMPs and CTS studied genes.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Um relevante nÃmero de espÃcies vegetais à descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de lÃtex. Nestas espÃcies, o lÃtex à sintetizado e armazenado sob pressÃo em um sistema de canais formados por cÃlulas altamente especializadas denominadas de laticÃferas, em cujos citoplasmas estÃo presentes todas as estruturas eucariontes em meio à Ãgua, borracha e inÃmeras molÃculas, muitas das quais especÃficas deste conteÃdo. Muitos estudos tÃm sugerido que molÃculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o lÃtex de 5 espÃcies foi coletado e processado em laboratÃrio para obtenÃÃo de suas fraÃÃes protÃicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogÃnicos atravÃs de ensaios de inibiÃÃo da germinaÃÃo de esporos e crescimento de hifas. ProteÃnas do lÃtex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifÃngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) nÃo apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitÃria das fraÃÃes protÃicas se correlacionou diretamente com a presenÃa de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifÃngica foi aumentada na presenÃa de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuÃda ou eliminada quanto Ãs amostras foram prÃ-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor especÃfico de proteases cisteÃnicas. AlÃm disso, a atividade antifÃngica foi observada quando papaÃna, uma protease cisteÃnica purificada do lÃtex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serÃnicas nÃo apresentaram atividade. AtravÃs de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteÃnica foi isolada de PLCg. A proteÃna purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolÃtica mÃxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseÃna e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinaÃÃo de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentraÃÃo de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteÃnicas de fluidos laticÃferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogÃnicos e que o provÃvel mecanismo de aÃÃo destas proteÃnas seja a alteraÃÃo da permeabilidade da membrana plasmÃtica destes microrganismos. A descriÃÃo de atividade antifÃngica de proteases cisteÃnicas oriundas de fluidos laticÃferos nÃo à ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com carÃter original. / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants.