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L’organisation de l’ADN sous forme de chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de l’identité cellulaire. De par son rôle clé dans l’assemblage de la chromatine couplé à la synthèse d’ADN, le chaperon d’histone CAF-1 apparaît comme un acteur potentiel dans la transmission de l’information portée par la chromatine au cours des générations cellulaires. Bien que CAF-1 soit essentiel pour la survie au stade larvaire chez la Drosophile, les outils génétiques disponibles chez cet organisme permettent d’analyser sa fonction dans des types cellulaires ciblés. Mon travail montre que la grande sous-unité de CAF-1 (P180) est essentielle pour le maintien de la lignée germinale femelle. L’arrêt précoce de l’ovogénèse induit par la perte de P180 dans les cellules germinales a pu être attribué à l’activation de checkpoints, vraisemblablement en réponse à une accumulation d’ADN simple-brin liée à des défauts de réplication. De façon remarquable, les cellules souches germinales (GSCs) traversent une « crise identitaire » en absence de P180 : elles présentent des caractéristiques de cellules en cours de différenciation, dont une abscission incomplète, tout en conservant des propriétés spécifiques aux GSCs. En revanche, mon analyse n’a pas révélé de défaut d’identité des neuroblastes, une autre population de cellules souches, qui continuent de se diviser de façon asymétrique sans P180. De même, les cellules des disques imaginaux se divisant de façon symétrique prolifèrent en absence de P180, bien que plus lentement. Des analyses complémentaires permettront de déterminer si des mécanismes alternatifs d’assemblage de la chromatine compensent la perte de CAF-1 dans ces cellules. / The organization of DNA into chromatin is dynamic and plays important roles in the establishment and the maintenance of cellular identity. By virtue of its central role in replication-coupled chromatin assembly, the histone chaperone CAF-1 constitutes an interesting candidate in a search for molecular players involved in the inheritance of chromatin states in mitotic cells. In Drosophila, dCAF-1 is essential for viability at the larval stage. Yet, the genetic tools available in the fruit fly allow to analyze the function of dCAF-1 in specific tissues. Mainly, my thesis work shows that the large subunit of dCAF-1 (P180) is essential for oogenesis. I have shown that the early arrest of oogenesis observed upon depletion of P180 in germ cells results from the activation of checkpoints pathways and cell death, possibly in response to the accumulation of single-strand DNA as a consequence of replication defects. Strikingly, P180 plays an essential role in the female germline stem cells (GSCs), which upon depletion of P180 enter an “identity crisis” and harbor features of differentiating cyst cells, including incomplete abscission, while maintaining at the same time some GSCs features. In contrast, the loss of P180 does not seem to alter the identity of larval neuroblasts, another population of stem cells, which continue to divide in an asymmetric fashion in its absence. Finally, the cells of the imaginal discs, which divide symmetrically, are able to proliferate upon loss of P180, albeit at a slower rate. Further analyses are required to determine whether alternative chromatin assembly pathways compensate for the loss of dCAF-1 activity in these cells.

Au cours de la méiose, des centaines de cassures doubles brins (CDB) sont générées et réparées par recombinaison homologue. Ces CDB peuvent être réparés par deux voies différentes donnant lieu à des crossing-overs (CO) ou des non crossing-overs (NCO). Le choix entre les deux voies est finement régulé pour assurer un nombre suffisant de CO; les facteurs influençant ce choix n’ont pas encore été bien caractérisés. L’environnement chromatinien pourrait jouer un rôle important dans ce processus.Peu d’études ont été réalisées sur l’influence de la chromatine sur la recombinaison méiotique. Le but de ma thèse a été de caractériser les facteurs chromatiniens nécessaires au remaniement de la chromatine pendant la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae.J’ai pu montrer que CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et Hir (Histone Regulator), deux protéines chaperons capables de réassembler les histones, s’associent aux sites de cassures doubles brins méiotiques lors de la recombinaison. L’absence de CAF-1 et Hir n’a pas d’effet sur la progression et la formation de CO. Cependant, par des études de recombinaison sur l’ensemble du génome, j’ai pu observer que l’absence de CAF-1 tend à réduire l’interférence des CO. Ce résultat suggère que CAF-1 pourrait être un des facteurs régulant la réparation au cours de la recombinaison méiotique. Pour finir, je me suis aussi intéressée à un troisième chaperon d’histone H3/H4, Asf1. J’ai aussi pu montrer que la délétion d’un autre chaperon Asf1 (Anti-silencing Function 1) entraîne des défauts de progression méiotique et de formation des spores.Ce travail aide à mieux comprendre l'impact de la chromatine sur la réparation de la méiose et le rôle des facteurs d'assemblage de la chromatine. / During meiosis, hundreds of programmed double strand breaks (DSB) are generated and repaired by homologous recombination. Meiotic DSB can be repaired by two major alternative pathways, which generate either crossing-over (CO) or non-crossing-over (NCO) products. The choice between the two repair pathways is tightly controlled to ensure sufficient and accurate CO formation. The chromatin environment could play a crucial role in this process that has not been elucidated yet. Little information is available about the importance of chromatin factors for meiotic recombination. The aim of my PhD was to study chromatin factors necessary for chromatin dynamic during meiotic recombination. I have shown that CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) and Hir (Histone Regulator), two chaperone proteins that are able to incorporate histones into chromatin, associate with DSB sites during meiotic recombination. CAF-1 and Hir deletion have no effect on the outcome of meiosis and CO formation. However, by genome-wide recombination studies, I have observed that the absence of CAF-1 histone chaperone results in a slight decrease in CO interference. The result suggests that CAF-1 could be one of the factors regulating DNA repair during meiotic recombination. Finally, I have also studied another H3/H4 chaperone, Asf1 (Anti-silencing Function1). Asf1 deletion gives rise to a defect in meiotic progression and spore formation. This work helps to better understand the impact of chromatin on meiotic repair and the role of chromatin assembly factors.

La réplication des chromosomes est altérée par les facteurs endogènes et/ou exogènes qui perturbent la progression des fourches de réplication. Les cellules doivent donc coordonner la synthèse d’ADN avec des mécanismes assurant la stabilité et le rétablissement des fourches bloquées. La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme universel qui permet la réparation de l’ADN et participe au maintien de la réplication des chromosomes. Néanmoins, les mécanismes qui régulent la RH, notamment la RH ectopique versus la RH allélique, restent mal compris. Un autre mécanisme essentiel assurant la stabilité des génomes est l’assemblage de l’ADN néo-synthétisé autour de nucléosomes, conduisant à la constitution de fibres chromatiniennes nécessaires à l’organisation structurale du matériel génétique. Chez Saccharomyces cerevisiae, des défauts d’assemblage de la chromatine conduisent à une instabilité des fourches de réplication et augmentent le taux de RH. Sachant que les chaperonnes d’histones jouent un rôle crucial durant l’assemblage de la chromatine, j'ai décidé de me concentrer sur le rôle de la chaperonne d’histones H3-H4 appelé Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) dans les mécanismes de RH, chez Schizosaccharomyces pombe. En effet, la RH est associée à une étape de synthèse de l’ADN, et peu de choses sont connues sur l’assemblage de la chromatine au cours de cette synthèse. Mes résultats ont exclu un rôle de CAF-1 dans la recombinaison allelique et le maintien de la stabilité des fourches de réplication. Par contre, CAF-1 joue un rôle important dans les mécanismes de recombinaisons ectopique et dans la formation de réarrangements chromosomiques induits par des blocages de fourches. Mes données suggèrent un modèle selon lequel CAF-1 permet la stabilisation d’intermédiaires de recombinaison précoces (D-loop), via le dépôt de nucleosomes au cours de l’extension par polymérisation de ces intermédiaires. Ainsi CAF-1 neutralise la dissociation des intermédiaires de recombinaison précoces par l’ADN helicase Rqh1. CAF-1 ferait partie d'un équilibre qui règle la stabilité/dissociation des intermédiaires de recombinaison précoces. J'ai montré que le rôle de CAF-1 dans cet équilibre a une importance toute particulière pendant la recombinaison non-allelique, révélant ainsi un nouveau niveau de régulation des mécanismes de RH par l'assemblage de la chromatine. / The replication of chromosomes can be challenged by endogenous and environmental factors, interfering with the progression of replication forks. Therefore, cells have to coordinate DNA synthesis with mechanisms ensuring the stability and the recovery of halted forks. Homologous recombination (HR) is a universal mechanism that supports DNA repair and the robustness of DNA replication. Nonetheless, mechanisms regulating HR pathways, such as ectopic versus allelic recombination, remain poorly understood. Another essential pathway for genome stability is the wrapping of newly replicated DNA around nucleosomes, leading to the constitution of a chromatin fibre, which allows the structural organization of the genetic material. In Saccharomyces cerevisiae, deficiencies in chromatin assembly pathways lead to replication forks instability and consequent increase in the rate of HR. Histone chaperones play a crucial role during chromatin assembly, thus I decided to focus on the H3-H4 histone chaperone Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), to study its role in HR processes in Schizosaccharomyces pombe. Indeed, HR includes a DNA synthesis step and little is known about the associated chromatin assembly. My data excluded a role for CAF-1 in allelic recombination and in the maintenance of forks stability. However, CAF-1 was found to play an important role during ectopic recombination, in promoting chromosomal rearrangements induced by halted replication forks. My data support a model according to which CAF-1 allows the stabilization of early recombination intermediates (D-loop), via nucleosome deposition during the elongation of these intermediates. Doing so, CAF-1 counteracts the dissociation of early recombination intermediates by the helicase Rqh1. Therefore, CAF-1 appears to be part of an equilibrium that regulates stability/dissociation of early steps of recombination events. Importantly, I found that the role of CAF-1 in this equilibrium is of particular importance during non-allelic recombination, revealing a novel regulation level of HR mechanisms and outcomes by chromatin assembly.

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique. / The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin.

The replication of chromosomes can be challenged by endogenous and environmental factors, interfering with the progression of replication forks. Therefore, cells have to coordinate DNA synthesis with mechanisms ensuring the stability and the recovery of halted forks. Homologous recombination (HR) is a universal mechanism that supports DNA repair and the robustness of DNA replication. Nonetheless, mechanisms regulating HR pathways, such as ectopic versus allelic recombination, remain poorly understood. Another essential pathway for genome stability is the wrapping of newly replicated DNA around nucleosomes, leading to the constitution of a chromatin fibre, which allows the structural organization of the genetic material. In Saccharomyces cerevisiae, deficiencies in chromatin assembly pathways lead to replication forks instability and consequent increase in the rate of HR. Histone chaperones play a crucial role during chromatin assembly, thus I decided to focus on the H3-H4 histone chaperone Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), to study its role in HR processes in Schizosaccharomyces pombe. Indeed, HR includes a DNA synthesis step and little is known about the associated chromatin assembly. My data excluded a role for CAF-1 in allelic recombination and in the maintenance of forks stability. However, CAF-1 was found to play an important role during ectopic recombination, in promoting chromosomal rearrangements induced by halted replication forks. My data support a model according to which CAF-1 allows the stabilization of early recombination intermediates (D-loop), via nucleosome deposition during the elongation of these intermediates. Doing so, CAF-1 counteracts the dissociation of early recombination intermediates by the helicase Rqh1. Therefore, CAF-1 appears to be part of an equilibrium that regulates stability/dissociation of early steps of recombination events. Importantly, I found that the role of CAF-1 in this equilibrium is of particular importance during non-allelic recombination, revealing a novel regulation level of HR mechanisms and outcomes by chromatin assembly.

The three-dimensional organization of the human genome is non-random in interphase cells. Heterochromatin is highly clustered at the nuclear periphery, adjacent to nucleoli, and near centromeres. These localizations are reshuffled during mitosis when the chromosomes are condensed, nucleoli disassembled, and the nuclear envelope broken down. After cytokinesis, heterochromatin is re-localized to the domains described above. However, the mechanisms by which this localization is coordinated are not well understood. This dissertation will present evidence showing that both CAF-1 p150 and Ki-67 regulate nuclear structure throughout the human cell cycle. Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) is a highly conserved three-subunit protein complex which deposits histones (H3/H4)2 heterotetramers onto replicating DNA during S-phase of the cell cycle. The N-terminal domain of the largest subunit of CAF-1 (p150N) is dispensable for histone deposition, and instead regulates the localization of specific loci (Nucleolar-Associated Domains, or “NADs”) and several proteins to the nucleolus during interphase. One of the proteins regulated by p150N is Ki-67, a protein widely used as a clinical marker of cellular proliferation. Depletion of Ki-67 decreases the association of NADs to the nucleolus in a manner similar to that of p150. Ki-67 is also a fundamental component of the perichromosomal layer (PCL), a sheath of proteins that surrounds all condensed chromosomes during mitosis. A subset of p150 localizes to the PCL during mitosis, and depletion of p150 disrupts Ki-67 localization to the PCL. This activity was mapped to the Sumoylation Interacting Motif (SIM) within p150N, which is also required for the localization of NADs and Ki-67 to the nucleolus during interphase. Together, these studies indicate that p150N coordinates the three-dimensional arrangement of both interphase and mitotic chromosomes via Ki-67.

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones. / Nucleosome assembly entails a controlled mechanism that is tightly coupled to DNA and histone synthesis during DNA replication and repair in S-phase. Importantly, this contributes to the prompt and carefully orchestrated assembly of newly replicated DNA into chromatin, which is essential for the maintenance of genomic integrity. This thesis describes the mass spectrometric characterization of proteins critical in the regulation of nucleosome assembly behind the replication fork and chromatin structure. More specifically, the phosphorylation of Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), a nucleosome assembly factor that uniquely functions during replication-coupled de novo nucleosome assembly in S-phase and the Hir protein complex, a second nucleosome assembly factor that also contributes to the transcriptional regulation of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage, was examined. We first demonstrated that characterization of protein phosphorylation by mass spectrometry (MS), which often relies on the separation of proteins by gel electrophoresis followed by silver staining for visualization, should be given careful considerations. In chapter 2, we report a potential pitfall in the interpretation of phosphorylation modifications due to the artifactual sulfation of serine, threonine and tyrosine residues caused by a specific reagent used during silver staining. Sulfation and phosphorylation both impart an 80 Da addition of these residues making them distinguishable only with MS systems offering high resolution and high mass accuracy capabilities. Chapter 3 and 4 present the MS characterization of in vivo phosphorylation occurring on CAF-1 and Hir proteins, respectively. We first demonstrated that Cac1, the largest subunit of CAF-1, is phosphorylated on several novel residues containing the consensus sequences recognized by either Cdc7-Dbf4 (DDK) or cyclin-dependent kinases(CDKs). These results have provided the first evidence that CAF-1 is regulated by these two kinases in vivo. The function of all identified Cac1 phosphorylation sites was then assessed. In vivo phenotypic studies showed that the specific phosphorylation of Ser-503, a Cac1 DDK-like site identified in our study, is essential for heterochromatin-mediated telomeric silencing. Cac1-Ser-503 did not appear to be required for other known functions of CAF-1, including DNA damage resistance and mitotic chromosom segregation, indicating that blocking Cac1 phosphorylation on Ser-503 sepcifically cripples CAF-1 function at telomeres. Next, biochemical purifications identified a physical interaction between CAF-1 and Cdc7-Dbf4. Consistent with this physical interaction data, in vitro kinase assay studies showed that Cdc7-Dbf4 specifically phosphorylates Cac1 Ser-503 thereby uncovering a novel role for Cdc7-Dbf4 in heterochromatin assembly and/or stability that is potentially mediated through CAF-1. Finally, MS analysis also showed that the Hpc2 subunit of the Hir protein complex is phosphorylated on several CDK- and DDK-like consensus sites. Furthermore, MS quantification of a specific phosphorylation site,Hpc2 Ser-330, was shown to be highly induced following the activation of the DNA damage checkpoint in response to DNA damage. We show that Hpc2 Ser-330 is phopshorylated by checkpoint kinases in a Mec1/Tel1- and Rad53-dependent manner. Our preliminary data suggest that the ability of the Hir protein complex to regulate the transcriptional repression of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage is mediated through the regulated phosphorylation of Hpc2 by these kinases. Finally, these two studies highlight the importance of mass spectrometry in characterizing protein phosphorylation events, which has yielded novel insights into the regulation of chromatin assembly by CAF-1 and histone synthesis mediated by Hir proteins.

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones. / Nucleosome assembly entails a controlled mechanism that is tightly coupled to DNA and histone synthesis during DNA replication and repair in S-phase. Importantly, this contributes to the prompt and carefully orchestrated assembly of newly replicated DNA into chromatin, which is essential for the maintenance of genomic integrity. This thesis describes the mass spectrometric characterization of proteins critical in the regulation of nucleosome assembly behind the replication fork and chromatin structure. More specifically, the phosphorylation of Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), a nucleosome assembly factor that uniquely functions during replication-coupled de novo nucleosome assembly in S-phase and the Hir protein complex, a second nucleosome assembly factor that also contributes to the transcriptional regulation of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage, was examined. We first demonstrated that characterization of protein phosphorylation by mass spectrometry (MS), which often relies on the separation of proteins by gel electrophoresis followed by silver staining for visualization, should be given careful considerations. In chapter 2, we report a potential pitfall in the interpretation of phosphorylation modifications due to the artifactual sulfation of serine, threonine and tyrosine residues caused by a specific reagent used during silver staining. Sulfation and phosphorylation both impart an 80 Da addition of these residues making them distinguishable only with MS systems offering high resolution and high mass accuracy capabilities. Chapter 3 and 4 present the MS characterization of in vivo phosphorylation occurring on CAF-1 and Hir proteins, respectively. We first demonstrated that Cac1, the largest subunit of CAF-1, is phosphorylated on several novel residues containing the consensus sequences recognized by either Cdc7-Dbf4 (DDK) or cyclin-dependent kinases(CDKs). These results have provided the first evidence that CAF-1 is regulated by these two kinases in vivo. The function of all identified Cac1 phosphorylation sites was then assessed. In vivo phenotypic studies showed that the specific phosphorylation of Ser-503, a Cac1 DDK-like site identified in our study, is essential for heterochromatin-mediated telomeric silencing. Cac1-Ser-503 did not appear to be required for other known functions of CAF-1, including DNA damage resistance and mitotic chromosom segregation, indicating that blocking Cac1 phosphorylation on Ser-503 sepcifically cripples CAF-1 function at telomeres. Next, biochemical purifications identified a physical interaction between CAF-1 and Cdc7-Dbf4. Consistent with this physical interaction data, in vitro kinase assay studies showed that Cdc7-Dbf4 specifically phosphorylates Cac1 Ser-503 thereby uncovering a novel role for Cdc7-Dbf4 in heterochromatin assembly and/or stability that is potentially mediated through CAF-1. Finally, MS analysis also showed that the Hpc2 subunit of the Hir protein complex is phosphorylated on several CDK- and DDK-like consensus sites. Furthermore, MS quantification of a specific phosphorylation site,Hpc2 Ser-330, was shown to be highly induced following the activation of the DNA damage checkpoint in response to DNA damage. We show that Hpc2 Ser-330 is phopshorylated by checkpoint kinases in a Mec1/Tel1- and Rad53-dependent manner. Our preliminary data suggest that the ability of the Hir protein complex to regulate the transcriptional repression of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage is mediated through the regulated phosphorylation of Hpc2 by these kinases. Finally, these two studies highlight the importance of mass spectrometry in characterizing protein phosphorylation events, which has yielded novel insights into the regulation of chromatin assembly by CAF-1 and histone synthesis mediated by Hir proteins.

Chez les cellules humaines, environ 2 mètres d'ADN est compacté dans le noyau cellulaire par la formation d'une structure nucléoprotéique appelée chromatine. La chromatine est composée d'ADN enroulé à la surface d'un octamère de core histones pour former une structure appelée nucléosome. La structure de la chromatine doit être altérée afin d'accéder à l'information génétique pour sa réplication, sa réparation et sa transcription. La duplication de la chromatine lors de la phase S est cruciale pour la prolifération et la survie des cellules. Cette duplication de la chromatine requière une ségrégation des histones parentales, mais aussi une déposition d'histones néo-synthétisées sur l'ADN. Ces deux réactions résultent en formation de chromatine dès qu'une quantité suffisante d'ADNest générée par la machinerie de réplication. De plus, en raison de conditions intrinsèques et extrinsèques, la machinerie de réplication est souvent confrontée à de nombreux obstacles, sous la forme de lésions à l'ADN qui interfèrent avec la réplication de l'ADN. Sous ces conditions, l'assemblage de nucléosomes et la synthèse d'histones sont étroitement régulées afin d'éviter la production d'un excès d'histones et leurs nombreuses conséquences nuisibles à la cellule. "Chromatin Assembly Factor 1" (CAF-1) est responsable de la déposition initiale des molécules d'H3 et H4 derrière les fourches de réplication. Pour permettre sa fonction d'assemblage de chromatine, CAF-1 est localisée aux fourches de réplication en vertue de sa liaison à une protéine appelée Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Cependant, le mécanisme moléculaire par lequel CAF-1 exerce sa function demeure mal compris. Dans le deuxième chapitre de ma thèse, j'ai exploré comment CAF-1 se lie à PCNA d'une manière distincte des nombreux autres partenaires de PCNA. Grâce à nos collaborateurs, des études de crystallographie ont démontré que CAF-1 se lie à PCNA grâce à une interaction non-canonique entre le "PCNA Interaction Peptide" (PIP) de CAF-1 et une interaction de type cation-pi (π). Nous avons aussi montré qu'une substitution d'un seul acide aminé, unique au PIP de CAF-1, abolit son interaction avec PCNA et sa capacité d'assemblage de nuclésomes. Nous avons aussi montré que le PIP de CAF-1 est situé à l'extrémité C-terminale d'une très longue hélice alpha qui est conservée à travers l'évolution parmi de nombreux homologues de CAF-1. Nos études biophysiques ontmontré que cette longue hélice alpha forme des structures oligomériques de type "coiled-coil", ce qui suggère certains mécanismes pour dédier un anneau de PCNA à l'assemblage de chromatine et ce, en dépit des nombreux intéracteurs de PCNA présents aux fourches de réplication. Dans le troisième chapitre de ma thèse, nos collaborateurs et moi-même avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules parviennent à maintenir un équilibre délicat entre la synthèse d'ADN et la synthèse d'histones et ce, même en présence de lésions à l'ADN qui interfèrent avec la réplication. Chez Saccharomyces cerevisiae, nous avons montré que les kinases de réponse au dommage à l'ADN, Mec1/Tel1 et Rad53, inhibent la transcription des gènes d'histones en réponse aux liaisons à l'ADN qui interfèrent avec la réplication. Nous avons montré que la répression des gènes d'histones induite par le dommage à l'ADN est médiée par une phosphorylation extensive de Hpc2, l'une des sous-unités du complexe "Histone Gene Repressor" (HIR). Hpc2 contient un domaine qui se lie à l'histone H3. À partir de la structure d'Hpc2, nous avons généré des mutants qui, d'après la structure, sont incapables de se lier à l'histone H3. Nos résultats montrent que l'accumulation d'histones en excès provoquée par le dommage à l'ADN entraîne la phosphorylation d'Hpc2 and la liaison de l'excès d'histone H3 à Hpc2. Ces résultats suggèrent que la répression transcriptionnelle des gènes d'histones induite par le dommage à l'ADN est médiée, du moins en partie, par une simple rétroaction négative impliquant la liaison des histones en excès à la sous-unité Hpc2 du complexe HIR. / In human cells, roughly 2 meters of DNA is compacted into the cell nucleus by the formation of a nucleoprotein complex called chromatin. Chromatin is composed of DNA wrapped around an octamer of core histones to form so-called nucleosomes. Chromatin structure needs to be altered to access genetic information for processes like replication, repair and transcription. Duplication of chromatin during S phase is vital for cell proliferation and viability. Chromatin duplication requires segregation of parental histones, but also deposition of newly synthesized histones onto DNA. This process results in packaging all of the synthesized DNA with histones to form nucleosomes as soon as enough nascent DNA has emerged from the replication machinery. Moreover, as a result of intrinsic and extrinsic conditions, the replication machinery often encounters DNA lesions that impede the continuous synthesis of DNA. Under these conditions, nucleosome assembly and histone synthesis are tightly regulated to prevent the production of an excess of histone proteins and their deleterious consequences. Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) performs the initial step in chromatin assembly by depositing newly synthesized histone H3-H4 molecules behind replication forks. In order to perform its chromatin assembly function, CAF-1 localizes to DNA replication forks by binding directly to a protein known as the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). However, the exact molecular mechanism by which this is achieved remains poorly understood. Through the second chapter of my thesis, I have explored how CAF-1 binds PCNA in a manner that is distinct from the numerous other binding partners of PCNA. With the help of our collaborators, crystallographic studies demonstrated that CAF-1 binds to PCNA by virtue of a non-canonical PCNA interaction peptide (PIP) and a cation-pi (π) interaction. We have also shown that a single amino acid substitution, unique to the PIP of CAF-1, disrupts its binding to PCNA and chromatin assembly activity. We found that the CAF-1 p150 PIP resides at the extreme C-terminus of a long alpha helix that is evolutionarily conserved among numerous homologues of CAF-1. Our biophysical studies showed that this long alpha-helix is capable of forming higher-order coiled coils, which suggests mechanisms to dedicate one PCNA ring for chromatin assembly despite the presence of multiple PCNA interactors at replication forks. In the third chapter of this thesis, our collaborators and I have addressed the crucial molecular mechanisms by which cells maintain a delicate balance between DNA and histone synthesis despite the presence of DNA lesions that interfere with replication. In Saccharomyces cerevisiae, we showed that the DNA damage response kinases Mec1/Tel1 and Rad53 inhibit histone gene transcription when DNA lesions block DNA replication. We also showed that this repression is mediated by phosphorylation of the Hpc2 subunit of the Histone Gene Repressor complex (HIR). Hpc2 contains a domain that directly binds to histone H3. Interestingly, structure-based mutants of Hpc2 predicted to be incapable of binding H3 are defective in DNA damage-induced transcriptional repression of histone genes in response to DNA damage during replication. Our results indicate that the accumulation of excess histones caused by DNA damage during S phase triggers extensive phosphorylation of Hpc2 and binding of excess H3 to Hpc2. This suggests that DNA damage-induced repression of histone genes is mediated, at least in part, by a simple negative feedback triggered by binding of excess histones to the Hpc2 subunit of the HIR complex.