Pesquisadores têm demonstrado que o estresse por contenção produz danos hipocampais e corticais, levando a consequências adversas no cérebro, como o aumento da sua vulnerabilidade a insultos. As alterações nos neurônios de córtex e hipocampo induzidas pelo estresse incluem, por exemplo, alterações nos espinhos dendríticos e na conectividade sináptica. Grande parte dos estudos que envolvem os efeitos do estresse foram conduzidos em machos, mas a resposta e adaptação ao estresse parece ser diferentes nas fêmeas. A cafeína é o estimulante mais amplamente consumido no mundo e está presente em várias fontes alimentares consumidas mundialmente, como bebidas à base de cola, barras de chocolate e refrigerantes. Estudos indicam que os efeitos agudos da cafeína e do estresse podem aumentar a expressão da citocromo oxidase, uma enzima da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial. Por outro lado, anormalidades na cadeia respiratória têm sido identificadas em diversas doenças neurodegenerativas, e o local destes defeitos varia de acordo com os mecanismos patogênicos envolvidos em cada doença. Visto que alterações mitocondriais podem estar associadas com doenças neurodegenerativas, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito da cafeína (1g/L) e da exposição ao estresse crônico (contenção, 5 dias por semana/ 40 dias) em parâmetros mitocondriais em hipocampo, córtex cerebral e estriado de ratos Wistar machos e fêmeas. Além disso, nós avaliamos os efeitos destes tratamentos crônicos no conteúdo de sinaptofisina e MAP2 em hipocampo. No presente estudo foi encontrado que o conteúdo de sinaptofisina e MAP2 não foi afetado pelo estresse crônico e/ou cafeína, talvez devido à adaptação. Por outro lado, o estresse e a cafeína causaram alterações sexo e estrutura-específicos nos parâmetros mitocondriais analisados neste estudo. Visto que a cafeína apresentou pequenas alterações nos parâmetros mitocondriais analisados, acreditamos que o mecanismo da neuroproteção provocado pelo consumo crônico de cafeína não está relacionado com alterações na atividade das enzimas da cadeia respiratória. / Researchers have reported that restraint stress produces hippocampal and cortical damage leading to adverse consequences on brain function which can increase the brain vulnerability to insults. The stress alterations in neurons from cortex and hippocampus include, for example, changes in dendritic spines and synaptic connectivity. Most studies on stress effects were conducted in males but the response and adaptation to stress appear to be different in females. Caffeine is the most widely consumed stimulant in the world and is present in a number of dietary sources consumed worldwide, i.e., tea, cocoa beverages, chocolate bars and soft drinks. Studies indicate that acute caffeine and stress can increase the expression of cytochrome oxidase, a mitochondrial protein. On the other hand, abnormalities of mitochondrial respiratory chain have been identified in several neurodegenerative disorders and the locus of these defects probably varies according to the pathogenic mechanisms involved in each disorder. Since mitochondrial alteration can be associated with neurodegenerative disorders, the aim of the present study was to verify the effect of caffeine (1g/L) and stress (restraint stress 5 days week/ 40 days) chronic exposition in mitochondrial parameters in hippocampus, cortex and striatum of male and female Wistar rats. Also, we evaluated the effects of these chronic treatments on synaptophysin and MAP2 content in hippocampus. We found that synaptophysin and MAP2 content was not affected by chronic stress and/or caffeine, perhaps due to adaptation. On the other hand, stress and caffeine caused a sex and structure-specific alterations in mitochondrial parameters analyzed in this study. Since caffeine presented small changes in the analyzed mitochondrial parameters, we believe that the mechanism of neuroprotection provoked by caffeine chronic consumption is not related to alterations in respiratory chain enzymes activity.

A cafeína é uma substância amplamente consumida na forma de café, chás e refrigerantes. Estudos demonstram sua influência no comportamento alimentar aparentemente promovendo uma pequena redução na ingestão de calorias e no comportamento do tipo ansioso, onde altas doses podem induzir um estado de ansiedade. Além disso, ela parece ser neuroprotetora, e é possível que parte desse efeito seja devido a sua atividade antioxidante a qual está bem descrita in vitro. O consumo de cafeína muitas vezes está associado a situações de estresse. A exposição ao estresse crônico leva a alterações bioquímicas e comportamentais, tendo sido sugerido que aumenta a produção de radicais livres. O objetivo deste trabalho é verificar o efeito do consumo de cafeína e do estresse crônico sobre os parâmetros comportamentais, comportamento do tipo ansioso e alimentar e sobre parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em hipocampo, estriado e córtex cerebral de ratos. Além disso, diferenças sexo-específicas foram verificadas com relação ao comportamento do tipo ansioso e ao dano ao ADN. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse por contenção por 40 dias. A dieta consistiu de ração padrão e cafeína 0,3 ou 1g/L na água de beber, a vontade, como única fonte de líquido disponível. Controles receberam água da torneira. A ansiedade e o comportamento alimentar foram avaliados, bem como o dano ao ADN (em hipocampo), a lipoperoxidação, o Potencial antioxidante reativo total (TRAP) e a atividade das enzimas antioxidantes Superóxido dismutase (SOD), Glutationa peroxidase (GPx) e Catalase (CAT), no hipocampo, estriado e córtex cerebral. O consumo de cafeína e o estresse crônico aumentaram o comportamento do tipo ansioso, efeito que foi observado apenas nos machos. No comportamento alimentar, a cafeína (0,3g/L e 1g/L) aumentou a latência e diminuiu o consumo de alimento doce (Froot Loops® ) no estado alimentado. Além disso, a cafeína 1g/L levou a um consumo menos intenso de alimento salgado (Cheetos®) pelos ratos no estado de jejum. Tanto a cafeína quanto o estresse aumentaram o dano ao ADN no hipocampo de ratos machos sem haver alteração nas fêmeas. Com relação ao estresse oxidativo, houve interações entre estresse e cafeína, especialmente no córtex, na atividade da SOD e da CAT, uma vez que a cafeína aumentou a atividade destas enzimas nos animais controles e não teve efeito nos estressados. Além disso, o estresse diminuiu a atividade da GPx no córtex e aumentou a atividade da SOD no estriado. Conclui-se que o estresse crônico e o consumo de cafeína levaram a um aumento no comportamento do tipo ansioso em ratos machos. Além disso, a cafeína aumentou a latência e diminuiu o consumo de Froot Loops® em ratos previamente alimentados. Por outro lado, o estresse repetido por contenção induziu um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em algumas estruturas cerebrais devido a atividade alterada das enzimas antioxidantes, enquanto que, a administração crônica de cafeína levou em alguns casos (depende da estrutura) a um aumento na atividade de enzimas antioxidantes, sugerindo um papel neuroprotetor, que depende do estado do sujeito (estressado ou não). / Caffeine is widely consumed in coffee, tea and soft-drinks. Studies show its influence on feeding behavior apparently through slight reduction on calorie ingestion and on anxiety-like behavior, where high doses can induce anxiety states. Besides, it seems to be neuroprotective, and it is possible that part of this effect is due to its antioxidant activity, which is well described in vitro. Caffeine consumption is many times associated to stressfull situations. The exposure to chronic stress leads to biochemical and behavioral changes and it has been suggested that increases free radicals production. The aim of this work is to verify the effect of caffeine consumption and chronic stress on behavioral parameters, anxiety-like-behavior and feeding behavior and on biochemical parameters related to oxidative stress in hippocampus, striatum and brain cortex of rats. Besides, sex specifics differences were verified on anxiety-like behavior and on DNA damage. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and caffeine 0.3g/L or 1g/L in the drinking water, ad libitum, as the only source of drinking. Controls received tap water. Anxiety-like-behavior and feeding behavior were evaluated as well as DNA damage (in the hippocampus), lipoperoxidation, Total reactive antioxidant potential (TRAP), and antioxidant enzymes ativities, Superoxide Dismutase (SOD), Glutathione Peroxidase (GPx) and Catalase (CAT) in the hippocampus, striatum and brain cortex. The caffeine consumption and chronic stress increased anxiety-like behavior, effect which was observed only in males. On feeding behavioral, caffeine 0.3g/L and 1g/L increased the latency and decreased the consumption of sweet food (Froot Loops®) on feeding state. Besides, caffeine 1g/L led to a less intense consumption of salty food (Cheetos®), on fasting state. Both caffeine and stress increased the DNA damage in the hippocampus of male rats, without any alteration on females. About oxidative stress, there were interactions between caffeine and stress, specially on cortex, on SOD and CAT activities, once caffeine increased the activity of these enzymes in control animals and had no effect in stressed animals. Furthermore, stress decreased GPx activity in the cortex and increased SOD activity in the estriatum. In conclusion, chronic stress and caffeine consumption led to an increase on anxiety-like behavior in male rats. Besides, caffeine increased the latency and decreased the consumption of Froot Loops® in prefeeding rats. On the other hand, repeated restraint stress induced a state of higher susceptibility to oxidative stress in some structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, while the chronic administration of caffeine, led, in some cases (depending on the structure), to increased activity of antioxidant enzymes, suggesting a possible neuroprotective role, which depends on the subject state (stressed or not).

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

GUEDES, Ricardo Abadie, também é conhecido em citações bibliográficas por: ABADIE-GUEDES, Ricardo / Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-06T20:48:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Camila Lima Chagas.pdf: 1369835 bytes, checksum: 93a284303e8c1254f5ede27c4b71a255 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-08T18:26:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Camila Lima Chagas.pdf: 1369835 bytes, checksum: 93a284303e8c1254f5ede27c4b71a255 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T18:26:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Camila Lima Chagas.pdf: 1369835 bytes, checksum: 93a284303e8c1254f5ede27c4b71a255 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / A cafeína (1,3,7-trimetilxantina) é um psico-estimulante que parece agir através dos receptores da adenosina A1 e A2 e dos receptores de dopamina D2 e supõe-se que a sua administração possa influenciar na excitabilidade cerebral. Neste estudo avaliou-se a ação da cafeína sobre o comportamento semelhante ao de ansiedade e sobre a depressão alastrante cortical (DAC) em três grupos de ratos que receberam cafeína por gavagem nas doses de 15mg/Kg/dia, 30mg/Kg/dia e 45mg/Kg/dia, do 7º ao 27º dia de vida pós-natal (grupos Caf15, Caf30 e Caf45). Dois grupos controle receberam gavagem com o veículo (V) ou não receberam qualquer tratamento (ingênuo). Os seus pesos corporais foram registrados nos dias 7, 14, 21, 28 e no dia do registro da DAC. Aos 28 dias de vida, os animais foram submetidos ao teste comportamental do labirinto em cruz elevado e aos 30 dias ao teste do campo aberto. Aos 35 dias foram submetidos ao registro da DAC. Outro grupo de animais jovens (31-40 dias de vida) foi submetido à aplicação tópica cortical de uma solução de cafeína (15mg/ml) durante a sessão de registro da DAC. Os testes comportamentais sugeriram um efeito ansiolítico da cafeína: o tempo por cada entrada aumentou de forma dose-dependente nos animais tratados com cafeína no labirinto em cruz elevado e campo aberto, com valores significativamente maiores no grupo Caf45 em comparação ao grupo ingênuo. Aos 28 dias de vida os grupos Caf30 e Caf45 apresentaram pesos corporais menores (respectivamente 64,6±4,0g e 58,9±3,8g) em comparação aos grupos ingênuo (73,6±5,5g), veículo (72±3,7g) e Caf15 (70,5±4,5g). No LCE o número do comportamento de levantar-se foi significativamente menor no grupo Caf45 em relação aos grupos controles, o número desse comportamento nos grupos ingênuo, veículo, CAF15, CAF30 e CAF45 foram respectivamente, 10,6±1,4; 10,8±1,2; 9,5±1,3; 8,8±0,9; 6,9±1,4 (p<0,05). No campo aberto o número de comportamento de levantar-se foi significativamente menor no grupo Caf45 em relação aos grupos controles e Caf15. O número do comportamento de levantar-se dos grupos ingênuo, veículo, CAF15, CAF30 e CAF45 foram respectivamente, 9,5± 1,4; 9,8±1,4; 7,5±1,2; 6,6±1,4; 4,8±0,9 (p<0,05). Aos 35 dias de vida os grupos Caf30 e Caf45 apresentaram pesos corporais menores (respectivamente 103,3 ± 7,8 g e 99,4 ±6,4 g), quando comparados aos grupos V (124,2±7,1 g), ingênuo (120,9±9,5 g) e Caf15 (122,4 ± 12,9 g) (p < 0,05). Na DAC, os grupos tratados com cafeína tiveram velocidades (em mm/min) maiores (Caf15 = 4,06±0,10; Caf30 = 4,18 ± 0,18 e Caf45 = 4,74±0,18) do que os controles (ingênuo = 3,93±0,10; V = 3,92±0,16; p<0,05). A aplicação tópica de cafeína aumentou a velocidade e a amplitude da DAC e reduziu a sua duração. Os resultados indicam que a administração de cafeína durante o período crítico de desenvolvimento tem impacto sobre o comportamento de ansiedade, reduzindo-o, mas aumenta a velocidade de propagação da DAC, sugerindo, portanto, importante papel da cafeína na excitabilidade cerebral. / Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a psycho-stimulant that acts through adenosine A1 and A2 receptors and dopamine D2 receptors. Evidence supports the assumption that it may influence brain excitability. This study evaluated in Wistar rats the action of caffeine on anxiety-like behavior and on the electrophysiological features of the excitability-related phenomenon known as cortical spreading depression (CSD). From postnatal day (PND) 7 to 27, animals received, via gavage, either caffeine (15, 30, or 45 mg/kg/day; groups Caf15, Caf30 and Caf45, respectively), or vehicle (group V) or no gavage (group naïve). Body weights were recorded at PND 7, 14, 21, 28 and P35. At PND28 the animals were behaviorally tested in the elevated plus-maze. At PND30 they were tested in the open field. At PND35, they were submitted to CSD recording. Another group of young animals (PND31-40) were subjected to topical cortical application of caffeine solution (15mg/ml) during the CSD recording session. Behavioral tests suggested an anxiolytic effect of caffeine: the time per entry increased in a dose-dependent manner in caffeine-treated animals in elevated plus-maze and open field, with significantly higher values in the Caf45 group compared to the naive group. At 28 days of age, the Caf30 and Caf45 groups had smaller body weights (64.6 ± 4.0g and 58.9 ± 3.8g, respectively) than the naive groups (73.6 ± 5.5g), vehicle (72 ± 3.7g) and Caf15 (70.5 ± 4.5g). In the elevated plus-maze the number of the rearing behavior was significantly lower in the Caf45 group than in the control groups, the number of this behavior in the naive, vehicle, CAF15, CAF30 and CAF45 groups were respectively 10.6 ± 1.4; 10.8 ± 1.2; 9.5 ± 1.3; 8.8 ± 0.9; 6.9 ± 1.4 (p<0.05). In the open field the number of rearing behavior was significantly lower in the Caf45 group than in the control and Caf15 groups. The number of the behavior of rearing from the naive, vehicle, Caf15, Caf30 and CAF45 groups were, respectively, 9.5 ± 1.4; 9.8 ± 1.4; 7.5 ± 1.2; 6.6 ± 1.4; 4.8 ± 0.9 (p <0.05). At 35 days of life the groups Caf30 and Caf45 had lower body weights (103.3 ± 7.8 g and 99.4 ± 6.4 g, respectively), compared to vehicle group (124.2 ± 7.1 g), naive group (120.9 ± 9.5 g) and Caf15 group (122.4 ± 12.9 g) (p <0.05). Caffeine-treated groups had higher CSD rates (in mm / min) (Caf15 = 4.06 ± 0.10; Caf30 = 4.18 ± 0.18 (p <0.05) and Caf45 = 4.74 ± 0.18) than controls (naive = 3.93 ± 0.10; V = 3.92 ± 0.16, p <0.05). Topical application of caffeine reversibly increased CSD velocity and amplitude, and reduced CSD duration. The results indicate that the administration of caffeine during the critical period of development reduced anxiety-like behavior, but increased the CSD propagation velocity, which suggests, therefore, an important role for caffeine on cerebral excitability.

Orientador: Raquel Fernandes Pupo Nogueira / Resumo: Para remover produtos farmacêuticos em água residual, estudou-se o compósito óxido de grafeno/magnetita (OG/Fe3O4) como catalisador no processo Fenton heterogêneo. A caracterização do material sintetizado a partir da co-precipitação de magnetita na presença de óxido de grafeno revelou que as folhas de óxido de grafeno foram cobertas com nanopartículas cubicas de magnetita, com um tamanho médio de 7 nm. Verificou-se pelo espectro FTIR que o compósito é formado pela ligação Fe-O-C do grupo carboxílico do óxido de grafeno. O nanocompósito mostrou superparamagnetismo à temperatura ambiente que diminui com o aumento da quantidade de óxido de grafeno, o que facilitou sua coleta para testes de reutilização. Verificou-se pelos espectros de Raman que o grafite precursor foi oxidado, enquanto o difratograma de raios X mostrou um aumento na distância interplanar devido à esfoliação do precursor. Devido à associação de efeitos entre adsorção e degradação, foi possível remover pelo menos 98% da cafeína em água (< limite de detecção) após uma hora. O nanocompósito mostrou uma atividade catalítica superior em comparação à magnetita isolada, com um efeito sinérgico de até 17,4 no escuro devido a um melhor transporte para a superfície do catalisador, que resultou em maior geração de radicais HO.. A constante de velocidade superficial aumentou em até 3 ordens de grandeza com a presença de óxido de grafeno. O catalisador mostrou dependência do pH do meio, com melhor eficiência de degradação em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To remove pharmaceutical products in wastewater, graphene oxide/magnetite (GO/Fe3O4) composite was studied as a catalyst in the heterogeneous Fenton process. The characterization of the synthesized material from magnetite co-precipitation in the presence of graphene oxide revealed that the graphene oxide sheets were covered with cubic-like nanoparticles of magnetite, with an average size of 7 nm. It was also found, from the FTIR spectrum, that the Fe-O-C bond of the graphene oxide carboxylic group links the composite. The nanocomposite showed superparamagnetism at room temperature which decreases with increasing amount of graphene oxide, which facilitated its collection for reuse tests. Raman spectra showed that the precursor graphite was oxidized, while the X-ray diffractogram showed an increase in interplanar distance due to precursor exfoliation. Due to the association of effects between adsorption and degradation, it was possible to remove at least 98% of caffeine in water (<detection limit) after one hour. Nanocomposite showed a higher catalytic activity compared to isolated magnetite, with a synergistic effect of up to 17,4 in the dark due to better transport to the catalyst surface, which resulted in higher generation of HO. radicals. The rate constant increased up to three orders of magnitude with the presence of graphene oxide. The catalyst showed medium pH dependence, with better degradation efficiency at pH 3. / Mestre

Introdução: pesquisas sobre consumo de café têm sido feitas para determinar os componentes da bebida e suas respectivas funções, além de características sensoriais e efeitos associados à saúde humana. A cafeína é uma das substâncias psicoativas mais consumidas no mundo. Durante as últimas cinco décadas, seu consumo mundial per capita dobrou através do consumo de água cafeinada, de bebidas energéticas e, principalmente, do café. Por este motivo, muitos trabalhos têm sido realizados sobre os efeitos fisiológicos desta substância, resultando na impossibilidade de se chegar a um consenso sobre seus efeitos positivos e negativos. Tal dicotomia acarreta um aumento do consumo de café descafeinado, muitas vezes por aconselhamento médico. A descafeinação é realizada nos grãos crus inteiros, antes do processo de torrefação. A maioria dos métodos de descafeinação existentes utiliza solventes para extração da cafeína, como diclorometano, clorofórmio, álcool, acetona, água e outros, sendo o diclorometano mais utilizado no Brasil. Embora existam vários estudos sobre a composição química do café integral, pouco se sabe sobre a composição do café descafeinado. Tais modificações químicas podem acarretar não somente alterações nas características sensoriais da bebida, como também em termos fisiológicos. Objetivo: identificar o grau de aceitação e de preferência da bebida de café preparada com grãos submetidos a diferentes condições de extração da cafeína em consumidores habituais da bebida. Métodos: três amostras de café foram submetidas aos métodos: tradicional (não descafeinado), descafeinado pelo método químico (diclorometano) e descafeinado pelo método natural (água), depois torrados e moídos. Cento e dez consumidores receberam as amostras do café, de forma monádica e aleatória, e o açúcar ou adoçante porcionados. Os testes foram executados pelo teste afetivo de aceitação com escala hedônica (1: desgostei muito a 7: gostei muito) para 4 atributos (cor, aroma, corpo e sabor). O café foi preparado e filtrado na concentração 7%. Os resultados foram coletados e analisados prelo programa Fizz (Byosysteme) - ANOVA e Tukey, p = 0,05). As amostras foram submetidas à análise física para determinar umidade, cinzas, proteínas, lipídios totais, carboidratos e cafeína. Resultados: o café descafeinado tratado pelo método químico apresentou média abaixo dos outros dois cafés nos quatro atributos, mas com diferenças estatisticamente significativa para o sabor e corpo. Entretanto, em relação ao sabor, houve diferença estatística entre os cafés tradicionais e descafeinado com água e o descafeinado com o diclorometano. Foram encontradas diferenças significativas nas análises físico-químicas para proteína e lipídios nos cafés descafeinados em comparação ao tradicional Discussão: a extração de compostos do café pelos métodos físico e químico resultou em diferentes bebidas no que se refere ao sabor. O método químico pôde mudar as características sensoriais da bebida. / Introduction: researches have been made to determine the coffee components and its functions, sensory characteristics and effects related to human health. Caffeine is one of the most consumed psychoactive substances in the world. During the last five decades, the worldwide caffeine consumption almost doubled, mainly trough coffee. For this reason, many studies have been conducted on the effects of this substance, resulting in the inability to reach a consensus on its positive and negative effects. This dichotomy ultimately causes increased consumption of decaffeinated coffee, often for medical advice. The decaffeination and raw whole grains in place before the process of roasting. Several methods of decaffeination use solvents for extraction of caffeine, dichloromethane is the most used in Brazil. During the extraction of caffeine, the loss of other components is expected. Objective: identify the degree of acceptance and preference of coffee prepared with different conditions of extraction of caffeine for habitual consumers of the drink. Methods: three samples of coffee were obtained: traditional (not decaf), decaffeinated by chemical method (dichloromethane) and decaffeinated by the natural method (water) and after roasted and grounded. 110 consumers received the coffee samples, monadic and random, with portionated sugar or sweetener. Tests were performed with affective form of quantitative assessment of (1: I hate very much to 7: I like very much) for 4 attributes (color, aroma, body and flavor). The coffee was filtrated (concentration 7%). The results were collected and analyzed through the Fizz (ANOVA and Tukey, p = 0,05) The samples were submited by a physicochemical analysis to determine moisture, ash, protein, total lipids, carbohydrates and caffeine. Results: the decaffeinated coffee treated by chemical methods presented lower acceptance when compared with the other two coffees on 4 attributes, but with differences to the flavor and body. However, related to flavor, there was statistical difference between the traditional and decaffeinated coffees with water with decaffeinated with the dichloromethane. Significant differences were found in physical-chemical analysis for protein and lipids in decaffeinated coffee compared to the traditional one. Discussion: the extraction of different compounds of coffee by the method of decaffeination showed particular physical and chemical differences of coffee flavor on the extraction with chemical method. This chemical method might change the sensory characteristics of the drink. No differences were perceived through the physicochemical analysis.

Introdução: pesquisas sobre consumo de café têm sido feitas para determinar os componentes da bebida e suas respectivas funções, além de características sensoriais e efeitos associados à saúde humana. A cafeína é uma das substâncias psicoativas mais consumidas no mundo. Durante as últimas cinco décadas, seu consumo mundial per capita dobrou através do consumo de água cafeinada, de bebidas energéticas e, principalmente, do café. Por este motivo, muitos trabalhos têm sido realizados sobre os efeitos fisiológicos desta substância, resultando na impossibilidade de se chegar a um consenso sobre seus efeitos positivos e negativos. Tal dicotomia acarreta um aumento do consumo de café descafeinado, muitas vezes por aconselhamento médico. A descafeinação é realizada nos grãos crus inteiros, antes do processo de torrefação. A maioria dos métodos de descafeinação existentes utiliza solventes para extração da cafeína, como diclorometano, clorofórmio, álcool, acetona, água e outros, sendo o diclorometano mais utilizado no Brasil. Embora existam vários estudos sobre a composição química do café integral, pouco se sabe sobre a composição do café descafeinado. Tais modificações químicas podem acarretar não somente alterações nas características sensoriais da bebida, como também em termos fisiológicos. Objetivo: identificar o grau de aceitação e de preferência da bebida de café preparada com grãos submetidos a diferentes condições de extração da cafeína em consumidores habituais da bebida. Métodos: três amostras de café foram submetidas aos métodos: tradicional (não descafeinado), descafeinado pelo método químico (diclorometano) e descafeinado pelo método natural (água), depois torrados e moídos. Cento e dez consumidores receberam as amostras do café, de forma monádica e aleatória, e o açúcar ou adoçante porcionados. Os testes foram executados pelo teste afetivo de aceitação com escala hedônica (1: desgostei muito a 7: gostei muito) para 4 atributos (cor, aroma, corpo e sabor). O café foi preparado e filtrado na concentração 7%. Os resultados foram coletados e analisados prelo programa Fizz (Byosysteme) - ANOVA e Tukey, p = 0,05). As amostras foram submetidas à análise física para determinar umidade, cinzas, proteínas, lipídios totais, carboidratos e cafeína. Resultados: o café descafeinado tratado pelo método químico apresentou média abaixo dos outros dois cafés nos quatro atributos, mas com diferenças estatisticamente significativa para o sabor e corpo. Entretanto, em relação ao sabor, houve diferença estatística entre os cafés tradicionais e descafeinado com água e o descafeinado com o diclorometano. Foram encontradas diferenças significativas nas análises físico-químicas para proteína e lipídios nos cafés descafeinados em comparação ao tradicional Discussão: a extração de compostos do café pelos métodos físico e químico resultou em diferentes bebidas no que se refere ao sabor. O método químico pôde mudar as características sensoriais da bebida. / Introduction: researches have been made to determine the coffee components and its functions, sensory characteristics and effects related to human health. Caffeine is one of the most consumed psychoactive substances in the world. During the last five decades, the worldwide caffeine consumption almost doubled, mainly trough coffee. For this reason, many studies have been conducted on the effects of this substance, resulting in the inability to reach a consensus on its positive and negative effects. This dichotomy ultimately causes increased consumption of decaffeinated coffee, often for medical advice. The decaffeination and raw whole grains in place before the process of roasting. Several methods of decaffeination use solvents for extraction of caffeine, dichloromethane is the most used in Brazil. During the extraction of caffeine, the loss of other components is expected. Objective: identify the degree of acceptance and preference of coffee prepared with different conditions of extraction of caffeine for habitual consumers of the drink. Methods: three samples of coffee were obtained: traditional (not decaf), decaffeinated by chemical method (dichloromethane) and decaffeinated by the natural method (water) and after roasted and grounded. 110 consumers received the coffee samples, monadic and random, with portionated sugar or sweetener. Tests were performed with affective form of quantitative assessment of (1: I hate very much to 7: I like very much) for 4 attributes (color, aroma, body and flavor). The coffee was filtrated (concentration 7%). The results were collected and analyzed through the Fizz (ANOVA and Tukey, p = 0,05) The samples were submited by a physicochemical analysis to determine moisture, ash, protein, total lipids, carbohydrates and caffeine. Results: the decaffeinated coffee treated by chemical methods presented lower acceptance when compared with the other two coffees on 4 attributes, but with differences to the flavor and body. However, related to flavor, there was statistical difference between the traditional and decaffeinated coffees with water with decaffeinated with the dichloromethane. Significant differences were found in physical-chemical analysis for protein and lipids in decaffeinated coffee compared to the traditional one. Discussion: the extraction of different compounds of coffee by the method of decaffeination showed particular physical and chemical differences of coffee flavor on the extraction with chemical method. This chemical method might change the sensory characteristics of the drink. No differences were perceived through the physicochemical analysis.

Dentro de la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (LGIC) se encuentra la familia de los receptores Cys-loop que incluye a canales catiónicos, como los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) y los receptores 5-HT3 de serotonina; y canales aniónicos, como los activados por GABA (GABAA) y glicina. Estos receptores revisten importancia tanto en la fisiología normal como así también en diversas y muy variadas patologías, entre las que se pueden mencionar las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Este hecho los posiciona como blancos moleculares importantes para el desarrollo de nuevos fármacos, y es por esto que el conocimiento de su función y modulación resulta un aspecto clave. Los receptores Cys-loop son proteínas transmembrana, por lo que su función se encuentra condicionada por su entorno lipídico y estímulos propios de la membrana celular, además de por distintos estímulos o factores externos a ella. Están formados por 5 subunidades organizadas pseudo-simétricamente alrededor de un poro o canal central. En estos receptores pueden distinguirse un dominio extracelular (ECD, del inglés extracellular domain), donde se encuentran los sitios de unión al agonista y/o antagonistas, un dominio transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domain), que contiene el canal iónico y que se encuentra en extenso contacto con los lípidos de la membrana, y un dominio pequeño intracelular (ICD, del inglés intracellular domain), que contiene distintos sitios de regulación y señalización intracelular. En esta Tesis Doctoral se profundizó en el estudio de la función y modulación de 2 receptores de neurotransmisores pertenecientes a los receptores Cys-loop: los nAChRs, muscular y α7 neuronal, y los receptores 5-HT3. En el capítulo I se estudió la modulación del nAChR muscular por el entorno lipídico de la membrana en la que se encuentra. Se hizo foco especialmente en el colesterol (Col), lípido clave para el correcto funcionamiento del nAChR y que presenta distintas asimetrías laterales y transmembrana en diferentes momentos de la vida y en condiciones de salud o enfermedad. Se trabajó con distintos sistemas modelo: vesículas unilamelares grandes (LUVs), vesículas unilamelares gigantes (GUVs), membranas ricas en nAChR de T. californica o células BOCSC 23 expresando heterologamente el nAChR muscular. A cada uno se le realizaron distintos tratamientos para modificar las condiciones de Col con el fin de obtener sistemas que presenten: i) un aumento del contenido de Col, ii) un aumento de esteroles en la hemicapa externa (por agregado de colesterol hemisuccinato (CHEMS)), o iii) transformación de parte del Col a colestenona (por la enzima colesterol oxidasa (Cox)). Mediante estudios de fluorescencia utilizando las sondas DPH, TMA-DPH y Laurdan se determinó que el orden de membrana aumentó cuando se incorporó CHEMS. Mediante estudios de espectrofotometría utilizando la sonda cristal violeta (CrV) y la técnica de patch-clamp se detectaron, respectivamente, modificaciones conformacionales en el nAChR y cambios en la activación del mismo cuando los diferentes sistemas habían sido incubados con CHEMS o Cox, no así con Col. Tratando LUVs con Tritón, y posterior centrifugación y separación por SDS-PAGE, se determinó que luego de la incorporación de Col o CHEMS al sistema, el nAChR se localizó mayoritariamente en fracciones ordenadas, mientras que cuando se produjo la transformación del Col a colestenona el receptor se localizó principalmente en fracciones desordenadas. Por último, estudios de microscopía confocal utilizando GUVs mostraron que alteraciones en el Col causaron cambios significativos en la presencia y distribución de dominios ordenados y desordenados; y que la presencia de un componente proteico en el sistema, como es un péptido representativo del segmento transmembrana yTM4 del nAChR, alteró las características de la membrana, llevando a todo el sistema a un mayor orden. De acuerdo con estos resultados, distintas modificaciones del Col en la membrana llevan a cambios de su orden y asimetría, y al mismo tiempo a cambios en la localización del nAChR en un determinado entorno, hecho que repercute directamente en su funcionalidad. Su localización en dominios ordenados ocasiona una disminución de su actividad, mientras que su presencia en dominios más desordenados lleva a un aumento de su función. De esta manera, la localización del nAChR en uno u otro dominio podría explicar los cambios en la señal colinérgica reportados en situaciones de envejecimiento y/o patologías como la EA. Existen numerosas evidencias de interacciones funcionales entre los péptidos β-amiloide (Aβ), involucrados en la enfermedad de Alzheimer, y el nAChR α7. En el capítulo II se estudió la modulación del nAChR α7 neuronal por oligómeros de Aβ1-40 y Aβ1-42. Se ha postulado que la acumulación excesiva de estos péptidos en el cerebro provoca la formación de placas seniles, directamente relacionadas con el proceso de neurodegeneración e inflamación característico de esta enfermedad. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que las especies más neurotóxicas serían las formas oligoméricas de Aβ. Mediante estudios de fluorescencia utilizando la sonda CrV se demostró que los oligómeros de Aβ provocan cambios conformacionales en el receptor α7. Utilizando la técnica de patch clamp se determinó que dichos oligómeros son capaces de activar al receptor α7 en muy bajas concentraciones y que, a concentraciones más altas, disminuyen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators). Estos resultados muestran un rol dual de los oligómeros de Aβ dependiente de su concentración, como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto agonista, potenciador de la señal colinérgica, podría tener un rol importante en la fisiología normal del individuo, mientras que el efecto inhibitorio, dado por su exacerbada producción, podría contribuir a la deficiencia en la memoria y cognición asociada a la EA. Teniendo en cuenta las características multifactoriales de la EA, la estrategia de búsqueda de nuevas moléculas apunta al descubrimiento y desarrollo de “multitarget drugs”, es decir de moléculas activas en varios blancos moleculares, por lo que el capítulo III se centró en el descubrimiento y optimización de nuevas moléculas bifuncionales que sean capaces de activar al nAChR e inhibir a la acetilcolinesterasa (ACE). Partiendo de un screening de extractos obtenidos de distintas plantas medicinales, mediante técnicas cromatográficas y de resonancia magnética nuclear se identificó a la molécula de cafeína como una molécula sumamente interesante para la EA. Además de confirmar su ya conocida actividad inhibidora de la ACE, utilizando técnicas de espectrofotometría con la sonda fluorescente CrV y de patch-clamp, en este trabajo se postula su actividad agonista sobre los nAChRs muscular y α7 neuronal. Caracterizada la actividad de la cafeína sobre el sistema colinérgico, se obtuvieron luego 5 análogos sintéticos de esta molécula mediante diseño racional. Se determinó que todos los análogos presentan actividad sobre ambos blancos moleculares, la ACE y los nAChRs, y cuya potencia es mayor a la de la cafeína. Mediante estudios de modelado molecular y docking se identificaron los sitios de inhibición de los análogos de la cafeína en la ACE y de interacción con el nAChR permitiendo postular a estos compuestos como agonistas parciales. Estos hallazgos resultan prometedores en la búsqueda de nuevos fármacos como una estrategia terapéutica para la EA. El otro receptor estudiado en este trabajo de Tesis fue el receptor 5-HT3, uno de los menos conocidos de la familia de los Cys-loop, el cual a nivel presináptico participa de la finalización de la señal nerviosa, tornándose un blanco molecular novedoso tanto en la EA como en otras patologías neurodegenerativas que requieran una potenciación de dicha señal. En el capítulo IV, utilizando el receptor de alta conductancia 5-HT3AHC, se descifraron por primera vez las diferencias entre la activación ortostérica del mismo y su activación alostérica por timol y carvacrol. Mediante la técnica de patch clamp, combinando registros de corrientes macroscópicas en la configuración whole-cell y de canal único en la configuración cell-attached, se caracterizó en primer lugar la activación del receptor humano 5-HT3AHC por los agonistas ortostericos 5-HT y triptamina, y luego la activación alostérica mediada por 2 terpenoides, carvacrol y timol. Se confirmó que tanto el carvacrol como el timol se comportan macroscópicamente como agonistas menos eficaces que 5-HT. Sin embargo, a nivel de canal único, estos 2 terpenoides activan a los receptores 5-HT3A con mayor eficacia que 5-HT. Más aún, se determinó que además de actuar como agonistas, el carvacrol y el timol actúan como modulares alostéricos positivos del receptor 5-HT3AHC humano, y que el efecto potenciador es evidente a concentraciones menores que el efecto agonista. De esta manera, los resultados de este capítulo permitieron definir las bases mecanísticas que subyacen a las diferencias entre la activación y potenciación alostérica u ortostérica del receptor humano 5-HT3A. En resumen, en este trabajo de Tesis se profundizó en el conocimiento de distintas formas de modulación de los nAChRs y del receptor 5-HT3, ya sea por moléculas exógenas o por el entorno lipídico en el que se encuentran, brindando bases moleculares para el entendimiento de su función, su modulación y su afección en determinadas patologías como la EA. En este trabajo se lograron avances significativos, con resultados de gran relevancia, ya sea para el estudio o tratamiento de esta enfermedad. / The Cys-loop receptor family, which belongs to the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily, includes cation channels, such as nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and serotonin 5-HT3 receptors, and anion channels, such as those activated by GABA (GABAA) and glycine. These receptors are important in normal physiology and in various pathologies, among which neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), are included. They are therefore important molecular targets for the development of new drugs, this being the reason why the knowledge of their function is indeed a very interesting aspect worth exploring. Cys-loop receptors are integral membrane proteins whose function is conditioned by their lipid environment as well as by different extrinsic factors. These receptors are formed by five subunits organized pseudo-symmetrically around a central pore. Three different domains can be distinguished: an extracellular domain (ECD), where the agonist and/or antagonist binding sites are localized, a transmembrane domain (TMD), which contains the ion pore and is in extensive contact with membrane lipids, and a small intracellular domain (ICD), which is important for the conductance of the channel and modulation. In this Doctoral Thesis, the function and modulation of two neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop receptor family, nAChRs and 5-HT3 receptors, were explored by using a large variety of fluorescence, confocal microscopy and electrophysiological approaches. In Chapter I, modulation of the muscle nAChR by its lipid environment was studied. Special attention was put on cholesterol (Chol), which displays different lateral and transmembrane asymmetries all throughout life as well as under health and disease conditions. This lipid is crucial for the proper functioning of the nAChR. Different model systems were used: large unilamellar vesicles (LUVs), giant unilamellar vesicles (GUVs), T. californica nAChR rich membranes and BOSC 23 cells heterologously expressing the muscle nAChR. The experimental systems were subjected to different treatments to modify their Chol conditions resulting in: i) an increment in Chol content, ii) an increment in sterols in the outer layer (after addition of cholesteryl hemisuccinate (CHEMS)), and iii) conversion of part of the Chol to cholestenone (through the enzyme Cholesterol Oxidase (ChOx)). Through fluorescence studies using DPH, TMA-DPH and Laurdan probes it was determined that the membrane order increased when CHEMS was incorporated. By using the fluorescent probe Crystal Violet (CrV) and patch-clamp recordings, conformational changes of the nAChR associated to changes in its activation properties were detected after incubation with either CHEMS or ChOx, but not with Chol. By treating LUVs with Triton, and subsequent centrifugation and separation by SDS-PAGE, it was determined that after incorporation of Chol or CHEMS to the system the nAChR was located mostly in ordered fractions, while after the conversion of Chol to cholestenone the receptor was found in disordered fractions. Confocal microscopy studies using GUVs showed that Chol alterations caused significant changes in the presence and distribution of ordered and disordered domains, and that the mere presence of a protein component in the system, specifically a peptide corresponding to the forth transmembrane segment of the nAChR (M4), led to a higher order of the entire system. According to our results, we conclude that modifications of membrane Chol lead to changes in membrane order and asymmetry, and, at the same time, in the location of the nAChR, a fact that would directly affect its functionality. The location of the nAChR in ordered domains causes a decrease in its activity whereas its location in more disordered domains enhances its function. In this way, the location of the nAChR in one or another domain fine-tunes its function and could explain the changes in the cholinergic signal reported in situations of aging and/or pathologies, such as AD. There is increasing evidence of functional interactions between β-Amyloid (Aβ) peptides, involved in Alzheimer's disease, and α7 nAChR. In Chapter II, modulation of α7 nAChR by Aβ1-40 and Aβ1-42 oligomers was studied. It has been postulated that the accumulation of these peptides in the brain causes the formation of senile plaques, which are directly related to the neurodegeneration and inflammation observed in AD. However, more recent evidence suggests that the most neurotoxic species are the oligomeric forms of Aβ. Fluorescence studies using the CrV probe demonstrated that Aβ oligomers cause conformational changes in the α7 receptor, which were dependent on the concentration. Accordingly, single channel recordings revealed that whereas at very low concentrations (pM to nM range) these oligomers are capable of activating the α7 receptor, at higher concentrations, which are compatible with those found in AD patients, they decrease the enhancement of α7 by positive allosteric modulators (PAMs). These results show a dual role of Aβ oligomers depending on their concentration, as agonists and as negative modulators of α7. The agonist effect, which enhances the cholinergic signal, could have an important role in normal physiology, while the inhibitory effect, given by the exacerbated production of Aβ, could contribute to the failure in memory and cognition associated with AD. Taking into account that Alzheimer’s is a multifactorial disease, the search for new molecules aims at discovering and developing “multitarget drugs”. Chapter III is focused on the discovery and optimization of new bifunctional molecules capable of activating the nAChR and inhibiting the AChE. Starting from a screening of extracts obtained from different medicinal plants and using chromatographic techniques and nuclear magnetic resonance, the caffeine molecule was identified as a highly interesting molecule for AD. In addition to its already known AChE inhibitory activity, using CrV fluorescence probe and patch-clamp techniques we postulated its agonist activity in the muscle and α7 nAChRs. After having characterized the activity of caffeine in the cholinergic system, five synthetic analogs of this molecule were obtained by rational design. It was determined that all the analogs have activity in both molecular targets, the AChE and the nAChRs, and that they have a greater potency than caffeine. Through docking studies, the sites of inhibition of caffeine analogs in the AChE and the sites of interaction with the nAChRs were proposed. These compounds are promising as new drugs for a therapeutic strategy for AD. The other receptor explored in this Thesis was the 5-HT3 receptor, one of the least known of the Cys-loop family, which has been recently proposed as a novel molecular target both in AD and in other neurodegenerative pathologies. In Chapter IV, by taking advantage of the high-conductance receptor 5-HT3AHC, differences between orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor were deciphered for the first time. By using the patch clamp technique, and combining macroscopic current recordings in the whole-cell configuration and single channel recordings in the cell-attached configuration, the activation of the human 5-HT3AHC receptor by the orthosteric agonists, 5-HT and tryptamine, and the allosteric activation, by carvacrol and thymol, were described. Both carvacrol and thymol were less effective agonists than 5-HT at the macroscopic level. However, at the single channel level, these two terpenoids activated 5-HT3A receptors more efficiently than 5-HT. Furthermore, it was demonstrated that in addition to acting as agonists, carvacrol and thymol behave as positive allosteric modulators of the human 5-HT3AHC receptor at low concentrations. In this way, these results made it possible to define the mechanistic bases underlying the differences between orthosteric and allosteric activation and potentiation of the human 5-HT3A receptor. Summing up, in this Doctoral Thesis we deepened into the knowledge of modulation of the nAChRs and the 5-HT3 receptor, either by extrinsic molecules or by the lipid environment in which they are located. Our findings provide molecular bases for the understanding of the function and modulation of these receptors and their implication in certain pathologies, such as AD. In this work, significant advances with highly relevant results were made for the study or treatment of this disease.

Muitas estratégias são indicadas a fim de suplantar a baixa permeabilidade de fármacos através da epiderme, umas delas, a de incluir promotores de penetração em formulações farmacêuticas e/ou cosméticas, formulados em sistemas terapêuticos transdérmicos (TTS). Estas substâncias são passíveis de modificar os domínios proteicos da epiderme e removerem provisoriamente a resistência da barreira do estrato córneo, permitindo o acesso dos fármacos aos tecidos viáveis através da circulação sistêmica. A natureza do veículo tópico é conhecida por desempenhar um papel importante na promoção da absorção dentro e através da pele. Os veículos tópicos convencionais, como pomadas, cremes ou géis, exercem predominantemente seus efeitos ao liberar o medicamento na superfície, e as moléculas dos fármacos, então, se difundem através de suas camadas. Os hidrogéis foram obtidos a partir de material polimérico reticulado por processo de radiação ionizante. A cafeína foi escolhida como substância modelo de permeação dérmica, por ser hidrofílica. Entretanto, para que a molécula penetre na barreira cutânea, deve ser associada a promotores de absorção cutânea. A papaína tem sido aplicada na pele íntegra como agente promotor de penetração e absorção cutânea. As enzimas interferem na absorção percutânea de fármacos por duas formas: como um potencializador de penetração e retardador de absorção. Neste trabalho, foram sintetizadas membranas de hidrogéis com poli (N-2- vinil - pirolidona) (PVP), poli (etilenoglicol) (PEG), poli (etilenoglicol diacrilato) (PEG-DA), cafeína e gel de papaína formado de polímero sintético pré-neutralizado para estudo da cinética de permeação cutânea, utilizando ecdise de cobra (Boa Constrictor) como membrana modelo de permeação. As membranas de hidrogel preparadas, foram caracterizadas por análise de termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), intumescimento, fração gel, microscopia eletrônica de varredura (MEV), e realizados ensaios de permeação dérmica em células de Franz e tomografia de coerência óptica (OCT). O teste de permeação \"in vitro\" desses hidrogéis na ecdise foram satisfatórios, comprovando a eficácia da papaína como promotora de permeação dérmica e contribuindo, assim, para futuros trabalhos que possam explorar ainda mais essa área de entrega de fármacos. / Many strategies are indicated for supplanting the low permeability of pharmaceuticals through the epidermis, one of them to include developers of access in cosmetics formulations, produced in Transdermal Drug Systems. Those substances are capable of modifying the protein dominates of the epidermis and temporarily remove the resistant barrier of the stratum cornea, allowing this way, the access to the pharmaceutical to the viable fabric through the systemic circulation. The nature of the topic vehicle is known for developing an important role of the absorption inside and through the skin. The conventional ways, as ointments, creams or gels, predominated theirs effects by liberating the medication in the superficies, so the pharmaceutical molecules defund beyond their layers. The hydrogels were got from the polymeric reticulate material for ionizing radiation process. The caffeine was chosen as a substance model of the dermis permeation, due to be hydrophilic. Moreover, for the molecule access, it is necessary to the developers of dermal absorption. The papain has been applied in the integra skin as agent promoter of access and dermal absorption. The enzymes interfere in the dermal absorption of the pharmaceutical in two forms: as optimizing, as well as, retarding absorption. This essay we could synthesized hydrogel membranes as Poly (N -2 - vinyl-pirolidon) (PVP), Poly(ethylene glycol) (PEG), Poly (ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA), caffeine and papain gel formed by polymeric synthetic pre-neutralized for the studies of kinetic of dermal access for using ecdysis of a snake (Boa constrictor) as a membrane model of access. The membranes of hydrogel prepared for this essay were characterized by thermogravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), swelling, gel fraction, scanning electron microscopy (SEM), and rehearsal of dermal access in Franz cells and optical coherence tomography (OCT). The test of permeation in vitro was satisfactory evidencing the efficacies of papain as a developer of dermal permeation, as well as, contributing for the future work that can explore even more this area of pharmaceutical delivery.

Orientador: Joaquim Gonçalves Machado Neto / Banca: Teresa Cristina Tarlé Pissarra / Banca: Regina Teresa Rosim Monteiro / Banca: Marco Antonio de Andrade Belo / Banca: José Roberto Ferreira / Resumo: Com esse estudo objetivou-se avaliar a qualidade das águas de pesque-pague quanto a presença de agrotóxicos e cafeína, determinar a toxicidade dessas águas para Daphnia magna e Lemna minor e avaliar o risco ambiental dos contaminantes prevalentes para D. magna, L. minor e Oreochromis niloticus. Para tanto, amostras de águas e de sedimentos de fundo dos tanques de peixes dos pesque-pague foram coletadas trimestralmente entre Junho/2014 e Maio/2015. As determinações dos resíduos de agrotóxicos e de cafeína foram realizadas por LC-MS/MS. As maiores contaminações das águas ocorreram, em ordem decrescente, com a cafeína e com os herbicidas tebutiuron, metolacloro, hexazinona, atrazina, ametrina e clomazone. Os fatores que mais influenciaram a contaminação das águas por agrotóxicos foram as características físicas e químicas dos herbicidas, quantidade de área cultivada com cana-de-açúcar no entorno dos pesque-pague e a coincidência ente as maiores precipitações pluviais e as aplicações dos agrotóxicos. Os lançamentos de efluentes de Estações de Tratamento de Esgoto em águas superficiais que margeiam os pesque-pague foi o fator responsável pela contaminação das águas com a cafeína. As águas dos pesque-pague não apresentaram toxicidade para D. magna e L. minor e a baixa concentração de nutrientes nessas águas foi um fator relevante para a inibição de crescimento de L. minor. O tebutiuron é o agrotóxico prevalente nas águas dos pesque-pague e é mais tóxico para os organismos-teste qu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the quality of fee-fishing pounds water about the pesticides and caffeine presence, to determine the water toxicity for Daphnia magna and Lemna minor, and to evaluate the environmental risk of contaminants prevalent for D. magna, L. minor and Oreochromis niloticus. For that, water and bottom sediments samples from the fish tanks of the fee-fishing pounds, were collected quarterly between June/2014 and May/2015. Residues determinations of pesticides and caffeine were performed by LC-MS/MS. The highest water contamination occurred, in descending order, with caffeine and the herbicides tebutiuron, metolachlor, hexazinone, atrazine, ametrine and clomazone. The factors that most influenced the water contamination by pesticides were the physical and chemical characteristics of the herbicides, the amount of area cultivated with sugarcane in the surroundings of the fee-fishing pounds and the coincidence between the greater precipitations and the pesticides applications. The effluent releases of Sewage Treatment Stations in surface water that border the fee-fishing pounds was the responsible factor for the contamination of the water by caffeine. The water of the fee-fishing pounds had no toxicity for D. magna and L. minor and the low concentration of nutrients in the water was a relevant factor for the inhibition of L. minor growth. Tebutiuron is the prevalent agrochemical in fee-fishing pounds water and it is more toxic to test organisms than caffeine. Due to acute toxicity, tebutiuron is classified as a high environmental intoxication risk for L. minor and a acceptable environmental intoxication risk for D. magna and O. niloticus. / Doutor