Le XXe siècle a marqué le succès de la construction du modèle standard de la physique des particules. Elaborée entre les années 1930 et 1970, cette théorie des particules élémentaires et des interactions électromagnétique, faible et forte a depuis été abondamment vérifiée auprès des collisionneurs tels que le LEP et le Tevatron. Malgré ce succès, certaines questions laissées en supsens ont nécessité l'élaboration de nouvelles théories permettant de dépasser le cadre du modèle standard. Parmi ces théories nombreuses sont celles prédisant l'existance d'un nouveau boson Z' à l'échelle du TeV. Les données du LHC, recueillies depuis son démarrage à l'automne 2008, offrent une nouvelle fois l'opportunité de confronter le modèle standard à ses prédictions et de rechercher les signatures de l'existence de nouvelle physique jusqu'à des énergies inégalées. Le travail mené au sein de l'expérience ATLAS au cours de ces quatres premières années s'est ainsi orienté autour de la compréhension du détecteur et de l'analyse des premières données. Cette thèse couvre ces deux aspects. La première partie du travail présenté revient ainsi sur la mise en évidence d'une pathologie de l'électronique de lecture du calorimètre à argon liquide d'ATLAS ainsi que sur l'étude de larges déviations cohérentes du bruit observées depuis sa mise en service. La mise en place d'une stratégie de préservation des données collectées y est détaillée. La seconde partie de ce manuscrit se concentre sur la recherche d'un nouveau boson Z'. Si tant est qu'une telle particule existe, sa décroissance en un électron et un positron devrait donner lieu à l'apparition d'une nouvelle résonance massive dans le spectre en masse invariante diélectron. Les performances de reconstruction et d'identification des électrons, particulièrement à haute impulsion transverse, sont étudiées. L'analyse des 4.9 fb-1 de données collectées en 2011 est décrite. En l'absence de déviation significative par rapport aux prédictions du modèle standard, le spectre en masse invariante diélectron est réinterprété afin de dériver les limites sur l'existence de nouveaux bosons issus de théories de grande unification (E6) et sur l'existence d'un boson de type SSM. Ces limites et celles obtenues par l'expérience CMS sont à l'heure actuelle les plus contraignantes quant à l'existence de ces nouveaux bosons. / The Standard Model of particle physics has known a tremendous rise during the twentieth century. Built up, from the early 1930s to the 1970s, this theory describing elementary particles and their interactions (electromagnetic, weak, strong) has now been intensivly tested by LEP and Tevatron colliders. Besides its succes, some problems remain and have lead to new theories attempting to go beyond the standard model. Many of them are predicting the existence of a new gauge boson Z', which is supposed to be observed at the TeV scale. Data recorded by the LHC since automn 2008 are a new opportunity to check the consistency of the Standard Model and to search for new physics evidence. Work that has been done by the ATLAS collaboration during the last four years has focused on understanding detector's behaviour and analysing the very first collected collisions. This thesis is reflecting these two aspects. Therefore, the first part of this thesis describes the caracterisation of a pathology of ATLAS liquid argon calorimeter electronics and of coherent noise bursts that have both been observed since the beginning of ATLAS operation. The policy deployed to preserve data quality is also detailled. The second part is focusing on the search for new Z' gauge boson. In case this particle was to exist, its decay into an electron and a positron would lead to a new massive resonance in the dielectron invariant mass spectrum. Therefore electron reconstruction and identification performances are closely looked at, especially at high transverse momentum. Analysis made on the 4.9 fb-1 of collected data is reported. As no significant excess with respect to Standard Model predictions is observed, the dielectron invariant mass spectrum is interpreted to derive mass limits concerning the existence of new Z' gauge bosons appearing in grand unification theories (E6) and effective sequential standard model (SSM). These limits and those derived by the CMS collaboration are the best ever set on such new bosons.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValdirMFF_TESE.pdf: 1925544 bytes, checksum: 2c6adf20cb05d72a5da15ba8f9a6a638 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / To study the thermal balance associated to methane emission in goats in a tropical environment, it was used nine Anglo Nubian females weighing in average 53.89 kg. The animals were observed during nine consecutive days from 08:00 to 17:00. An indirect open calorimetry system was used with a facial mask adjusted on the animal s muzzle and the volume of O2, CO2, CH4 and water vapor in the inspired and expired air were determined as well as the respiratory rate, respiratory volume and the temperature of expired air. Several parameters were also collected such as rectal temperature, body surface and hair coat temperature, air temperature and humidity and black globe temperature. The results showed that when the air temperature was below 26 °C the heat exchange for long-wave radiation and convection were effective to maintain the thermal equilibrium of the animals, since respiratory rate, respiratory volume, rectal temperature and metabolic heat production parameters did not change. When the air temperature increased to 28 °C, there was a slight change in physiological responses. When air temperature was higher then 30°C the variation in the physiological parameters was significant. These results demonstrated that the thermal balance in Anglo Nubian goats protected from direct solar radiation for an air temperature between 20 and 25 °C is maintained primarily by the sensible heat loss and when these temperature reaches values higher then 30 °C can only be maintained by latent heat loss for a cost of significant changes in respiratory rate and volume, hence thermal comfort zone was varying from 20 to 27 °C. In this environment, methane emission from enteric fermentation was in average 8.41 kg year-1 animal-1. There was no significant correlation between the methane emission and with physiological and environmental parameters but with individual characteristics of each animal, such as body weight / Com objetivo estudar o equilíbrio térmico associado à emissão de CH4 em caprinos em ambiente tropical, o presente trabalho utilizou nove fêmeas da raça Anglo Nubiano com peso corporal médio de 53,89 kg, que foram observadas durante nove dias consecutivos entre às 08:00 até 17:00 horas. Um sistema de calorimetria indireta aberta com auxílio de máscara facial ajustada ao focinho dos animais foi utilizado para determinar o volume de O2, CO2, CH4 e H2O (vapor) no ar inspirado e expirado. Simultaneamente a esses volumes também foram determinados nos animais à frequência e volume respiratório, além das temperaturas do ar expirado, retal, superfície da pele e pelame, enquanto no ambiente foram determinados a temperatura do ar e umidade, além da temperatura do globo negro. Os resultados mostraram para uma temperatura do ar inferior a 26°C as trocas de calor por radiação de ondas longas e convecção foram eficazes para manter o equilíbrio térmico dos animais, pois frequencia respiratória e volume respiratório, além da temperatura retal e produção de calor metabólico não se alteraram, mas quando a temperatura do ar passou de 28 °C, ocorreu uma leve alteração nas respostas fisiológicas e acima 30 °C essa alteração foi bem significativa. Esses resultados demonstraram que o equilíbrio térmico dos caprinos da raça Anglo Nubiano protegidos da radiação solar direta para uma faixa de temperatura do ar entre 20 a 25 °C é mantido basicamente pela perda de calor sensível e, após 30 °C, somente pode ser conseguido via perda de calor latente à custa de alterações significativas na frequência e volume respiratório, consequentemente sua faixa de zona de conforto térmico estaria variando entre 20 a 27 °C aproximadamente quando manejados protegidos da radiação solar. Nestas condições sua emissão de CH4 é da ordem de cerca de 8,41 kg ano-1 animal-1, sendo essa emissão não correlacionada de forma significativa com as variáveis fisiológicas e ambientais avaliadas e sim com características individuais de cada animal, como seu peso corporal

Introdução: O reconhecimento da importância da nutrição enteral em pacientes hospitalizados gerou novos métodos de administração, o que leva a muitas perguntas: quais são os efeitos cronobiológicos da terapia nutricional contínua ou intermitente? Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do horário de administração da nutrição enteral como Zeitgeber do ritmo biológico no gasto energético e consumo de oxigênio, mensurados por calorimetria indireta. Métodos: Ensaio clínico randomizado, realizado de dezembro de 2009 a novembro de 2010, em 34 pacientes com doença neurológica, com idade entre 52 e 80 anos, alimentados através de uma sonda nasoenteral, 15 através de infusão contínua por 24 horas/dia e 19 em quantidades comparáveis de forma intermitente, a cada 4 horas, dás 8 às 20 horas. Foram realizadas 4 medidas de calorimetria indireta nas 24 horas (A: 07:30 h, B: 10:30 h, C: 14:30 h e D :21:30 horas), durante 3 dias, para cada paciente. Resultados: A idade média foi de 69,5±8,50% eram do sexo masculino, IMC 22 ±3,9 kg/m²(homens) e 25±5,6 kg/m²(mulheres). O gasto energético e o consumo de oxigênio mostrou diferença significativa entre os grupos contínuo e intermitente: 1478±817 kcal/24h, (IC: 1249 – 1706), 1782±862 kcal/24h (IC: 1579 – 1984) (p=0.05); 212±117 ml/min (IC: 179 – 245); 257±125 ml/min (IC: 227 – 286) (p=0.048), respectivamente. No gasto energético e consumo de oxigênio diferenças estatisticamente significativas foram encontradas entre as mensurações A, B, C e D em ambos os grupos. Comparando o gasto energético e consumo de oxigênio entre os grupos por Mann-Whitney, houve uma diferença estatisticamente significativa em tempo B e C (p = < 0,01). Conclusão: Foi observado neste estudo uma variação circadiana do gasto energético e consumo de oxigênio nos dois métodos de administração da nutrição enteral, sugerindo que apenas uma medida de calorimetria indireta no dia não é capaz de mostrar a verdadeira necessidade do paciente. Observamos também que o gasto energético foi mais elevado à noite nos dois métodos de administração da alimentação. Além disso, o gasto energético e o consumo de oxigênio foi maior no método de administração intermitente em todos os tempos. / Introduction: The importance of enteral nutrition has grown in recognition resulting in new methods of administration. That leads to many questions such as: what are the chronobiologic effects of continuous or intermittent nutrition therapy? Objectives: The aim of this study was to evaluate the use of enteral nutrition as a Zeitgeber of biological rhythm. Energy expenditure and oxygen consumption were measured by indirect calorimetry in continuous or intermittent nutrition patterns. Methods: A randomized clinical trial was conducted from December 2009 to November 2010. Thirty four neurological patients received through the same kind of calibrated nasogastric tube the standard protein and energy intakes calculated for each subject, 15 through continuous infusion for 24 hours/day and 19 intermittently in comparable quantities, every 4 hours, from 8:00 to 20:00 h. Four indirect calorimetry measures were carried out during the 24 hours (A: 07:30h, B: 10:30h, C: 14:30h and D: 21:30h), for 3 days, for each patient. Results: The mean age was 69.5±8, 50% were male; BMI 22±3.9kg/m² (men), 25±5.6 kg/m² (women). Energy expenditure end oxygen consumption presented a significant difference between the continuous and intermittent groups (1478±817 kcal/24h, (CI: 1249 – 1706), 1782±862kcal/24h (CI: 1579 – 1984) (p=0.05); 212±117 ml/min (CI: 179 – 245); 257±125 ml/min (CI: 227 – 286) (p= 0.048), respectively). In the energy expenditure and oxygen consumption, statistically significant differences were found between the A, B, C and D measures in both groups. By comparing the energy expenditure and the oxygen consumption between the groups by the Mann-Whitney test a statistically significant difference was observed for times B and C (p=< 0.01). Conclusion: A circadian variation of energy expenditure and oxygen consumption was observed in both enteral nutrition administration methods used in this work, suggesting that only one indirect calorimetry measure per day is not able to show the patient’s true needs. It was also observed that the energy expenditure was higher at night in both food administration methods. Moreover, the energy expenditure and oxygen consumption was higher in the intermittent administration method in all times.

Neste trabalho é apresentada uma proposta para o ensino de termometria e calorimetria, em nível de ensino médio, que enfatiza a habilidade de leitura e interpretação de gráficos. A motivação do trabalho é o crescente aumento da importância, no cenário nacional, do Exame Nacional do Ensino Médio (ENEM) exigindo a referida habilidade em parcela significativa das questões. A fundamentação teórica está baseada na Teoria da Aprendizagem de David Ausubel, tanto no que diz respeito à concepção e elaboração do material instrucional, quanto à sua aplicação em sala de aula. O módulo didático, perfazendo um total de 20 horas aula, é composto por um conjunto de aulas expositivo-dialogadas, aulas práticas, listas de exercícios, que partem de exercícios elementares até exercícios de concursos de vestibular, exercícios associados à visualização de vídeos, correção de atividades com a projeção de respostas erradas inspiradas no Peer Instruction e um texto produzido especialmente para o produto educacional, constituindo-se este conjunto no produto educacional do mestrado. Quanto à habilidade de leitura e interpretação de gráficos, adotou-se a classificação de Curcio em três níveis: “ler os dados, ler entre os dados e ler além dos dados”. O módulo didático foi aplicado no Colégio Concórdia de Porto Alegre em uma turma de 37 alunos do segundo ano do Ensino Médio. Para avaliar os alunos na leitura e interpretação de gráficos foi produzido um teste de conhecimentos prévios e conhecimentos adquiridos, com quinze questões que envolvem a leitura e interpretação de gráficos em diferentes níveis conforme a classificação de Curcio. O teste de opinião aplicado para avaliar a percepção dos alunos em relação ao desenvolvimento da proposta, de um modo geral, foi favorável à proposta. / This dissertation presents a proposal for teaching thermometry and calorimetry at high school level, which emphasizes graphs reading and interpreting skills. The motivation behind this study is the increasing importance, on the Brazilian national scene, of the National Secondary Education Exam (ENEM), requiring these skills in a significant portion of the questions. The theoretical foundation is the Meaningful Learning Theory by David Ausubel, regarding the design and preparation of instructional material for its use in the classroom. The teaching module, comprising a total of 20 class hours, consists of a set of expository-dialogued classes, practical classes, exercises, starting from elementary exercises to university entrance exams questions, exercises associated with video watching, tasks correction with the projection of wrong answers based on Peer Instruction and a text produced especially for the educational product, constituting this set the educational product for a master degree program. As for graphs reading and interpreting skills, Curcio´s classification has been adopted on three levels: "reading the data, reading between the data and reading beyond the data". The teaching module was applied to a class of 37 students in the second year of high school at Concordia School in the City of Porto Alegre. In order to assess students about graphs reading and interpreting, it was produced a pretest with fifteen questions at different levels according to Curcio´s classification. This test was applied before the didactic proposal for two main reasons: to detect previous knowledge of the students and to evaluate their learning improvement after the implementation of the proposal, using the same test as a posttest. At the end of the teaching module, a test was applied to assess the acquired knowledge of thermometry and calorimetry. The opinion test used to assess the students' perception concerning the proposal, in general, was favorable to the proposal.

A presente tese explora aspectos importantes do suporte nutricional, no paciente crítico: método e vias de administração da nutrição enteral, determinação do gasto energético, monitorização da adequação do suporte nutricional e seu efeito sobre os desfechos em curto e longo prazo. Em face da evidência de benefícios significativos, a nutrição enteral é recomendada como a primeira opção para a maioria dos pacientes, quando comparada à nutrição parenteral. É comum a intolerância gástrica associada ao uso de opióides, choque e vasopressores, o que reduz a entrega de energia e talvez aumente a incidência de pneumonia hospitalar. A subalimentação parece estar associada com consequências indesejáveis, que incluem o risco aumentado de infecção, o desmame da ventilação prolongada, o tempo de internação na UTI e as taxas elevadas de mortalidade, na UTI e no hospital. A determinação do gasto energético é alvo de debates, pois vários são os fatores que influenciam diretamente o gasto energético do paciente crítico. O método calorimetria indireta é apontado como o mais preciso para adequar o suporte nutricional, quando comparado com as equações preditivas. Vale destacar, porém, que ainda é necessária maior evidência clínica sobre a real influência da calorimetria indireta nos desfechos clínicos (Tempo em VM, tempo de UTI e mortalidade em UTI, mortalidade hospitalar). Os estudos avaliam os desfechos clínicos mais relevantes, em curto prazo, e há uma escassez de estudos que avaliam a qualidade de vida dos sobreviventes, em médio ou longo prazo. Para a realização da tese, foram desenvolvidos três estudos, um ensaio clínico randomizado, em que foi definida a incidência de pneumonia e avaliada a taxa de mortalidade na UTI, comparando a nutrição por sonda gástrica com a por sonda jejunal. Não encontramos diferença na taxa de pneumonia, quando é utilizada a sonda em posição gástrica ou jejunal. Não observamos diferenças na sobrevida na UTI e hospitalar. Em nossa revisão sistemática, analisamos quatro artigos da literatura sobre paciente crítico adulto e adequação do suporte nutricional guiado pela calorimetria indireta, de 1950 a maio de 2014. Não encontramos estudos suficientes para evidenciar o impacto da utilização da calorimetria indireta, como método de adequação do suporte nutricional sobre os desfechos clínicos. Realizamos estudo observacional, onde procuramos definir as relativas contribuições da adequação nutricional maior ou igual a 70%, em relação ao previsto nas primeiras 72 horas de internação na UTI, para os desfechos clínicos em curto e longo prazo (capacidade de realizar atividades da vida diária). Os pacientes que receberam um aporte calórico igual ou superior a 70%, nas primeiras 72 horas de internação, não apresentaram melhores desfechos em curto prazo (tempo em VM, tempo de UTI e mortalidade em UTI), bem como melhora da capacidade funcional em um ano. Esta tese se justifica por buscar melhor entendimento dos principais aspectos do suporte nutricional enteral, no paciente crítico, mecanicamente ventilado e submetido à terapia intensiva. Como aspectos da terapia nutricional, destacamos a importância de investigar evidências clínicas do impacto do suporte nutricional enteral sobre desfechos clínicos. / This thesis explores important aspects of nutritional support in critically ill patients: method and routes for enteral nutrition administration; determining energy expenditure; monitoring the optimal nutritional support and its effect on short- and long-term outcomes. Given the evidence of significant benefits, enteral nutrition is recommended as the first choice for most patients compared to parenteral nutrition. Gastric intolerance associated with opioid use, shock, and vasopressors is common, which reduces energy delivery and may increase the incidence of hospital-acquired pneumonia. Malnutrition appears to be associated with undesirable consequences, including increased risk of infection; weaning from prolonged ventilation; length of stay in ICU; and high mortality rates in ICU and hospital. Determining energy expenditure is subject to debate because several factors directly influence it for critically ill patients. The method of indirect calorimetry is pointed out as the most accurate for establishing adequate nutritional support compared with predictive equations. It is worth noting, however, that more clinical evidence is needed on the real influence of indirect calorimetry on clinical outcomes (length of ventilation; length of stay in ICU and mortality in ICU; hospital mortality). The studies evaluate the most relevant clinical outcomes in the short term, and there is shortage of works assessing survivors’ quality of life in the medium or long term. Three studies were developed for the thesis: a randomized clinical trial where the incidence of pneumonia was established and the mortality rate in ICU was evaluated, comparing nutrition by gastric gavage with a jejunal probe. No difference was found in the rate of pneumonia when using the gavage in gastric or jejunal position. No differences in survival in ICU and hospital were found. In our systematic review, we analyze four articles on critically ill adult patients and optimization of nutritional support guided by indirect calorimetry, from 1950 to May 2014. We did not find enough studies to show the impact of using indirect calorimetry for optimizing nutritional support on clinical outcomes. We conducted an observational study to define the relative contributions of nutritional optimization higher or equal to 70% relative to predictions in the first 72 hours of ICU admission for clinical outcomes in the short and long term (ability to perform daily activities). Patients who received caloric intake equal to or higher than 70% in the first 72 hours of admission did not show better outcomes in the short term (time under MV, ICU stay, and ICU mortality) as well as improved functional capacity within one year. This thesis is justified for seeking to improve understanding of the key aspects of enteral nutritional support in critically ill, mechanically ventilated patients who have underwent intensive therapy. Important aspects of nutrition therapy include investigating clinical evidence of the impact of enteral nutritional support on clinical outcomes.

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB. / Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB. / Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.

Neuroglobin (Ngb) and cytoglobin (Cygb) are two new additions to the globin family, exhibiting heme iron hexa-coordination, a disulfide bond and large internal cavities. These proteins are implicated in cytoprotection under hypoxic-ischemic conditions, but the molecular basis of their cytoprotective function is unclear. Herein, a photothermal and spectroscopic study of the interactions of diatomic ligands with Ngb, Cygb, myoglobin and hemoglobin is presented. The impact of the disulfide bond in Ngb and Cygb and role of conserved residues in Ngb His64, Val68, Cys55, Cys120 and Tyr44 on conformational dynamics associated with ligand binding/dissociation were investigated. Transient absorption and photoacoustic calorimetry studies indicate that CO photo-dissociation from Ngb leads to a volume expansion (13.4±0.9 mL mol-1), whereas a smaller volume change was determined for Ngb with reduced Cys (ΔV=4.6±0.3 mL mol-1). Furthermore, Val68 side chain regulates ligand migration between the distal pocket and internal hydrophobic cavities since Val68Phe geminate quantum yield is ~2.7 times larger than that of WT Ngb. His64Gln and Tyr44Phe mutations alter the thermodynamic parameters associated with CO photo-release indicating that electrostatic/hydrogen binding network that includes heme propionate groups, Lys 67, His64, and Tyr 44 in Ngb modulates the energetics of CO photo-dissociation. In Cygb, CO escape from the protein matrix is fast (< 40 ns) with a ΔH of 18±2 kcal mol-1 in Cygbred, whereas disulfide bridge formation promotes a biphasic ligand escape associated with an overall enthalpy change of 9±4 kcal mol-1. Therefore, the disulfide bond modulates conformational dynamics in Ngb and Cygb. I propose that in Cygb with reduced Cys the photo-dissociated ligand escapes through the hydrophobic tunnel as occurs in Ngb, whereas the CO preferentially migrates through the His64 gate in Cygbox. To characterize Cygb surface 1,8-ANS interactions with Cygb were investigated employing fluorescence spectroscopy, ITC and docking simulations. Two 1,8-ANS binding sites were identified. One binding site is located close to the extended N-terminus of Cygb and was also identified as a binding site for oleate. Furthermore, guanidinium hydrochloride-induced unfolding studies of Cygb reveal that the disulfide bond does not impact Cygb stability, whereas binding of cyanide slightly increases the protein stability.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:41:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-06-09T18:33:58Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-06-09T18:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP