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Antígeno B de Echinococcus : instabilidade genômica, variação no verme adulto e anticorpos policlonais

Graichen, Daniel Ângelo Sganzerla January 2011 (has links)
Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.
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Expressão e funcionalidade do receptor P2X7 em linhagem de glioma de camundongo GL261

Tamajusuku, Alessandra Sayuri Kikuchi January 2010 (has links)
O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença. / Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.
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Antígeno B de Echinococcus : instabilidade genômica, variação no verme adulto e anticorpos policlonais

Graichen, Daniel Ângelo Sganzerla January 2011 (has links)
Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.
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Persistência da infecção por Leishmania braziliensis em camundongos BALB/c mediada por citocinas e quimiocinas / Persistence of Leishmania braziliensis infection in BALB/c mice mediated by chemokines and citokynes

Viana, Sayonara de Melo January 2013 (has links)
VIANA, Sayonara de Melo. Persistência da infecção por Leishmania braziliensis em camundongos BALB/c mediada por citocinas e quimiocinas. 2013. 63 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-09T11:31:11Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_smviana.pdf: 993841 bytes, checksum: 334429f92171ab2195fc74d23d724801 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-10T10:49:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_smviana.pdf: 993841 bytes, checksum: 334429f92171ab2195fc74d23d724801 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-10T10:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_smviana.pdf: 993841 bytes, checksum: 334429f92171ab2195fc74d23d724801 (MD5) Previous issue date: 2013 / Leishmania braziliensis is the main causative agent of American cutaneous leishmaniasis in Brazil. Altough L. braziliensis infection is self-limited it is distinguished by its latency and chronicity and can persist in mice and patients even after spontaneous clinical cure or treatment. Little is known about the persistence feature in L. braziliensis’ infection in humans and mice. Thereby, the aim of this study was to characterize the parasite’s persistence in the murine model. The parasite load, lesion thickness and pattern of cytokines and chemokines involved in persistence were evaluated through BALB/c mice infection with a L. braziliensis strain and observation for 90 days after infection. The results showed that parasites gradually disappear in the footpad, while the parasite load was sustained in the draining lymph node until 90 days post-infection (p.i). In the footpad, TNF-α expression was higher at 30 days p.i, followed by the decrease in parasite load and lesion thickness in the site. IL-10 and TGF-β were more expressed at first and decreased after 30 days of infection. A higher concentration of TNF-α and IFN-γ was observed at 15 and 30 days post-infection in the draining lymph node, while IL-4 was significantly increased at 15 days post-infection, and IL-10 and TGF-β were the predominant cytokines after 90 days of infection. CCL2, CCL3, CXCL1 e CXCL10 were expressed in the footpad, with a peak at 30 days p.i. and reduction at 60 days. In the draining lymph node, CCL2 and CXCL10 presented a low expression at first, increasing to a peak at 45 days p.i., while CCL3 was more expressed at 30 days p.i., the same period of the maximum lesion thickness. In our work, we observed that Leishmania persists in draining lymph nodes, while CCL2, CXCL10, IL-10 and TGF- are significantly expressed/produced. These results indicate that these citokynes act synergistically, which can determinate parasite persistence in the draining lymph node. / A infecção por Leishmania braziliensis se distingue por sua latência e cronicidade, podendo persistir em camundongos e nos pacientes após a cura clínica espontânea ou após o tratamento. A persistência da infecção por L. braziliensis ainda tem sido pouco estudada, seja em humanos, seja em modelos experimentais. O objetivo deste trabalho, portanto, foi caracterizar a persistência da infecção por L. braziliensis utilizando o modelo murino. Foram avaliados em diferentes tempos a espessura da lesão, a carga parasitária e o padrão de citocinas e quimiocinas envolvidas no processo. Para isso, camundongos BALB/c foram infectados com uma cepa de L. braziliensis e acompanhados por 90 dias. Os resultados mostraram que os parasitos desapareceram gradativamente da pata, enquanto nos linfonodos a carga parasitária se manteve, mesmo 90 dias pós-infecção (p.i.). Houve pouca expressão de IFN-γ nas patas durante os períodos analisados, enquanto a expressão de TNF-α apresentou-se alta aos 30 dias de infecção. IL-10 e TGF-β apresentaram maior expressão inicialmente e regrediram a partir de 30 dias p.i. Quanto às quimiocinas, observou-se expressão de CCL2, CCL3, CXCL1 e CXCL10 nas patas; aos 30 dias todas as quimiocinas apresentaram máxima expressão, e diminuíram no 60o dia p.i. Através de detecção por ELISA no linfonodo de drenagem, observou-se um pico de concentração de TNF-α aos 15 dias e de IFN-γ aos 30 dias pós-infecção, o que precedeu a redução na espessura da lesão e diminuição da carga parasitária na pata. IL-4 foi predominante aos 15 dias p.i., tendo sua concentração muito diminuída aos 30 dias; a partir desse período a citocina foi pouco detectada. Já a concentração de IL-10 e TGF-β manteve-se alta e estável, a partir dos 30 dias p.i. Nos linfonodos, a expressão de CCL2 e CXCL10 aumentou gradativamente, atingindo pico aos 45 dias p.i., enquanto a expressão de CCL3 apresentou pico aos 30 dias p.i., regredindo depois. Em conclusão, os parasitos persistem no linfonodo de drenagem em períodos crônicos de infecção, quando CCL2, CXCL10, IL-10 e TGF- continuam sendo expressos/produzidos em quantidade. O quadro observado sugere um equilíbrio entre essas citocinas, o que pode ser determinante para a persistência do parasito no linfonodo.
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Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares / Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares

Silva, Cristina Aragão January 2009 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T19:26:50Z No. of bitstreams: 1 Cristina Aragao Silva. Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares..pdf: 2328830 bytes, checksum: 174ad1e8df08de4d7fd4ed21f53e51a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T19:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristina Aragao Silva. Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares..pdf: 2328830 bytes, checksum: 174ad1e8df08de4d7fd4ed21f53e51a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A transferência de genes mediada por vírus, em especial pelos vetores lentivirais, é atualmente reconhecida como um eficiente sistema de transmissão de genes, resultando em altas taxas de animais fundadores carreando o transgene. Menos invasiva para os embriões, mais custo-efetivo e tecnicamente menos exigente, optamos por essa metodologia para gerar camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde em diferentes órgãos e tecidos, para subsequente uso em terapia celular. Sob controle de três promotores diferentes, ubiquitina-C, que controla a expressão da proteína nos embriões e em todos os tecidos do camundongo adulto, da alfa-miosina cardíaca, que direciona a expressão no coração, e da FmTie, que controla a expressão apenas em células endoteliais de vasos, os zigotos foram microinjetados no espaço subzonal e transferidos para fêmeas pseudogestantes. Dos 31 animais nascidos, 22 animais (72%) apresentam o transgene integrado em seu genoma. Entretanto, nenhum deles expressou a proteína fluorescente verde. Como a inserção no genoma é aleatória, o efeito de posição frequentemente observado pode afetar a expressão do transgene e de genes endógenos, além de interromper estes últimos – mutagênese insercional – levando ao chamado silenciamento gênico. Desta forma, estudos subsequentes devem ser efetuados a fim de solucionar essa ausência de expressão dos transgenes inseridos no genoma dos camundongos fundadores, viabilizando, consequentemente, todo o processo de desenvolvimento de camundongos transgênicos. / Gene transfer mediated by viruses, in particular by vectors lentivirais, is now recognized as an efficient system of gene transmission, resulting in high rates of founder animals carrying the transgenesis. Less invasive for the embryos, more cost-effective and technically less demanding, we choose this methodology to generate transgenic mice expressing the green fluorescent protein in different organs and tissues for subsequent use in cell therapy. Using three different promoters as control: ubiquitin-C, which controls the expression of the protein in embryos and in all tissues of adult mice; the alpha-cardiac myosin, which directs the expression in the heart, and FmTie, which controls the expression only in endothelial cells of vessels; the zygotes were microinjected in subzonal space and transferred to pseudopregnancy females.22 animals (72%) of 31 animals born, have integrated the transgene in its genome. However, none of them expressed the green fluorescent protein. How the insertion in the genome is random, the effect of position usually observed may affect the expression of the transgene and of the endogenous genes, stopping them - insertional mutagenesis - leading to genic silencing. Subsequent studies should be done to solve this lack of expression of the transgenesis inserted into the genome of founder mice, enabling the whole process of development of transgenic mice.
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Transecção do menisco medial em camundongos promove mais dor e lesão que a sua retirada / Transection of the medial meniscus in mice promotes more pain and injury that your recession

Teotonio, Maria Aline Alves January 2013 (has links)
TEOTONIO, Maria Aline Alves. Transecção do menisco medial em camundongos promove mais dor e lesão que a sua retirada. 2013. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-11-19T13:20:06Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_maateotonio.pdf: 925385 bytes, checksum: 3cd976b3d49ab88303521df2ac35a3ff (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-11-19T13:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_maateotonio.pdf: 925385 bytes, checksum: 3cd976b3d49ab88303521df2ac35a3ff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-19T13:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_maateotonio.pdf: 925385 bytes, checksum: 3cd976b3d49ab88303521df2ac35a3ff (MD5) Previous issue date: 2013 / Abstract Osteoarthritis (OA) is a chronic degenerative joint disease characterized by loss of joint of function and disability, reduced with the quality of life. In humans, the lack of reliable and objective methods to evaluate the progression of OA limits their clinical study. Thus, animals are commonly used as model in an attempt to understand the pathophysiology of the disease and investigate new therapies. Considered one of the most experimental models of OA used, the mechanical instability of surgically induced experimentally reproduce the chronic trauma observed in human OA. Using models of surgical meniscectomy (meniscus removal) and destabilization of the medial meniscus (DMM) aimed to evaluate the difference in the development of OA in these experimental models and their response to different anti-inflammatory drugs. Swiss mice underwent surgery and the animals were sacrificed after 7 weeks, with daily assessment of joint pain (hypernociception). After sacrifice, the intra-articular lavage was colleted. The supernatant stored for evaluate cytokine-induced nitric oxide (NO). Histopathologic evaluation of the joints was performed according to the OARSI scores. Groups false-operated (Sham) were used for comparison. Meniscotomizados groups of animals receiving morphine (2 mg/kg, ip), naloxone (1 mg/kg, ip), indomethacin (2 mg/kg, sc), 1400W (0.5 mg/kg, sc), HOE-140 (1 mg/kg, sc) or anti-TNF (25-50 l) intraarticular. The hypernociception was recorded first and third hours after drug administration. Untreated group received vehicle only. Data were expressed as mean ± SEM, and ANOVA followed by Tukey test. The histopathological scores were expressed as median followed by Kruskal-Wallis. Statistical significance was set at P <0.05. In destabilization of the medial meniscus and meniscectomy, articular hyperalgesia increased significantly in the 16 days after surgery, compared to the sham group (false-operated animals). This hyperalgesia persisted in group destabilization of the medial meniscus until the 49th day of observation (P <0.05). The cellular influx was higher and articular lesions were more severe, particularly in tibial portion, destabilization of the medial meniscus group (P <0.05). Indomethacin, 1400W, HOE and morphine significantly reduced hypernociception, with reversal of the effect of morphine by naloxone. The analgesic effect of anti-TNF persisted for 7 days after administration. The levels of IL-1, TNF-α, IFN-γ and NO were undetectable. The destabilization of the medial meniscus is a more severe OA, involving the participation of cyclooxygenase, inducible nitric oxide synthase, bradykinin, opioids and TNF. / A Osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica degenerativa, caracterizada pela perda da função e incapacitação, interferindo na qualidade de vida. Em humanos, a inexistência de métodos objetivos e confiáveis para avaliar a evolução da OA limita o seu estudo clínico. Assim, modelos animais são amplamente utilizados na tentativa de se compreender os aspectos fisiopatológicos da doença e investigar novas terapias. Considerado como um dos modelos experimentais de OA mais utilizado, o de instabilidade mecânica induzida por cirurgia reproduz experimentalmente o trauma crônico observado na OA humana. Utilizando os modelos cirúrgicos de meniscectomia (retirada do menisco) e desestabilização do menisco (corte do menisco) objetivou-se avaliar a diferença do desenvolvimento da OA nesses modelos experimentais e sua resposta a diferentes drogas anti-inflamatórias. Camundongos Swiss foram submetidos à cirurgia e sacrificados após 7 semanas, com avaliação diária da dor articular (hipernocicepção). Após o sacrifício, o lavado articular foi coletado e o sobrenadante armazenado para a dosagem de citocinas e óxido nítrico (NO). Avaliação histopatológica das articulações foi feita segundo os escores Osteoartrite Research Society International (OARSI).Grupos falso-operados (Sham) foram utilizados para comparação. Grupo de animais meniscotomizados receberam morfina (2 mg/kg; i.p.), naloxona (1 mg/kg; i.p.), indometacina (2 mg/kg; s.c.), 1400W (0,5 mg/kg; s.c.), HOE-140 (1 mg/kg; s.c.) ou anti-TNF (25-50 μL) intra-articular . A hipernocicepção foi registrada 1 e 3 horas após a administração das drogas. Grupo não tratado recebeu apenas veículo. Os dados foram expressos como média ± e.p.m, seguidos por ANOVA e teste de Tukey. Os escores histopatológicos foram expressos como mediana, seguidos por teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância foi de P<0,05. Na meniscectomia e meniscotomia, a hiperalgesia articular aumentou significativamente nos 16 dias após o procedimento cirúrgico, comparada ao grupo sham (animais falso-operados). Essa hiperalgesia persistiu no grupo meniscotomia até o 49º dia de observação (P<0,05). O influxo celular foi maior e as lesões articulares foram mais graves, particularmente na porção tibial, no grupo meniscotomia (P<0,05). Indometacina, 1400W, HOE e morfina reduziram significativamente a hipernocicepção, com reversão do efeito da morfina pelo naloxona. O efeito analgésico de anti-TNF persistiu por 7 dias após a administração. Os níveis de IL-1, TNF-α, IFN-γ e NO foram indetectáveis. A meniscotomia é um modelo mais grave de OA, envolvendo a participação de cicloxigenase, óxido nítrico sintase indutível, bradicinina, opioides e TNF
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Efeitos comportamentais do metilfenidato e da reboxetina em modelo animal de déficit de atenção induzido pela lesão por etanol em camundongos / Behavioral Effects of Methylphenidate and Reboxetine in animal model of attention deficit induced in mice by ethanol lesion

Ribeiro, Monique Vieira January 2008 (has links)
RIBEIRO, Monique Vieira. Efeitos comportamentais do metilfenidato e da reboxetina em modelo animal de déficit de atenção induzido pela lesão por etanol em camundungos. 2008. 103 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-07T16:11:14Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_mvribeiro.pdf: 1087470 bytes, checksum: bbfa4f09eaa9d84febbf8644cf45bc36 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-08T16:53:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_mvribeiro.pdf: 1087470 bytes, checksum: bbfa4f09eaa9d84febbf8644cf45bc36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-08T16:53:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_mvribeiro.pdf: 1087470 bytes, checksum: bbfa4f09eaa9d84febbf8644cf45bc36 (MD5) Previous issue date: 2008 / Attention Deficit and Hyperactivity Disorder (ADHD) is a neurobehavioral disorder that affects between 3 - 5% of scholar-aged children. The disorder is characterized by inattention, hyperactivity and impulsivity. Children exposed to alcohol during pregnancy may exhibit hyperactivity, language and learning deficits. Dopamine and Norepinephrine seem to have an important role in the pathophysiology, which is confirmed by the response to psychostimulants, which increase the availability of these neurotransmitters in the synaptic cleft. The psychostimulant Methylphenidate is the gold-standard in the treatment of ADHD. Non-stimulant medications, such as norepinephrine reuptake inhibitor Reboxetine are gaining space as an alternative in the treatment of ADHD. In rats, when ethanol is given during the period of brain development, it may cause pre-frontal circuits’ dysfunction and abnormal dopaminergic transmission. The aim of this work is to evaluate the behavioral effects (attention, memory, motor activity, anxiety and depression) of Methylphenidate (MPH) and Reboxetine (RBX) in an experimental model of attention deficit induced by ethanol in mice. Male and female Swiss mice on the post-natal day 10 were injected with ethanol (2 x 2,5g/kg, s.c., 6 h-interval) or saline (same volume). On post-natal day 30, behavioral testing was started (T-maze, Y-maze, passive avoidance, forced swim test, open field, plus maze and dark/light box). The subjects received either MPH (2,5mg/kg) or RBX (10 mg/kg) p.o, 30 minutes before each test session. There were no histopathologic changes in cerebral cortex of mice that received ethanol. In the T-maze, ethanol subjects had significant attention deficits, taking a longer time to learn, but these were reversed by MPH and RBX (Cont. 1,5±0,32, Et 7,18±0,32, MPH+Et 3,14±0,88, RBX+Et 1,55±0,33). During delayed discrimination, ethanol group had memory deficits, with fewer correct choices than controls. MPH ameliorated the deficits, but RBX did not (Cont. 25,78±0,86, Et 21,27±1,02, MPH+Et 25,14±1,03, RBX+Et 21,88±1,00). There were no deficits in aversive memory during passive avoidance test. In the Y-Maze, ethanol subjects had working memory deficits, that were mitigated MPH, but not by RBX. (Cont. 73,28±4,75, Et 43,53±4,65, MPH+Et 60,57±1,92, RBX+Et 54,63±2,80) . At the open field, ethanol subjects had motor hypoactivity that was reversed by MPH and RBX (Cont. 93,59±6,38, Et 66,52±5,87, MPH+Et 98,14±9,23, RBX+Et 77,3±7,68). At the Light/dark paradigm, ethanol subjects displayed anxious behavior, remaining more time in the dark side and this behavior was reversed by RBX only (Cont. 149±5,99, Et 115,4±4,27, MPH+Et 120,1±6,81, RBX+Et 149,1±2,55). At the Plus-Maze, ethanol subjects had an anxiogenic behavior, remaining less time in the open arms, and this effect was reversed by RBX (Cont. 88,06±12,52, Et 50,53±5,99, MPH+Et 39,86±12,00, RBX+Et 86,29±9,49). At the forced swimming test, ethanol subjects had prolonged immobility, which was not reversed by MPH or RBX (Cont. 74,17±23,43, Et 141,8±19,3, MPH+Et 178,9±12,43, RBX+Et 118,5±18,25). In conclusion, mice exposed to ethanol during brain development have attention and memory deficits that are reversed by MPH and partially by RBX. RBX may be used as a second line treatment in subjects that do not respond to stimulants or have comorbid anxiety. / O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é uma desordem do desenvolvimento neurocomportamental que afeta de 3 a 5% das crianças em idade escolar. O transtorno é caracterizado pela presença de sintomas como desatenção, hiperatividade e impulsividade. Crianças expostas ao álcool durante o período gestacional exibem um padrão de hiperatividade, déficit de linguagem e aprendizado. A Dopamina e a Noradrenalina parecem ter um papel primário na gênese do transtorno, o que é confirmado pela resposta ao psicoestimulantes que aumentam suas quantidades na fenda sináptica. O psicoestimulante Metilfenidato é a droga de primeira escolha no tratamento do TDAH. Medicações não-psicoestimulantes como o inibidor da recaptação de noradrenalina Reboxetina, têm ganhado força como possível alternativa no tratamento do déficit de atenção. Em ratos, o etanol administrado no período de neurodesenvolvimento gera disfunção em circuitos pré-frontais, levando a transmissão dopaminérgica anormal. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos comportamentais (memória, atenção, atividade locomotora, depressão e ansiedade) do Metilfenidato (MFD) e da Reboxetina (RBX) em modelo de déficit de atenção induzido em camundongos pela lesão por etanol. Camundongos Swiss machos e fêmeas no 10o dia de vida foram submetidos a injeção de etanol (2 x 2,5g/kg, s.c., 6 h-intervalo) ou solução salina (mesmo volume). No 30o dia, iniciaram-se testes comportamentais (T-maze, Y-Maze, esquiva passiva, nado-forcado, plus-maze, caixa claro-escuro e campo-aberto). Os animais receberam MFD (2,5mg/kg) ou RBX (10 mg/kg) por gavagem 30 minutos antes de cada sessão de testes.. Não se observaram alterações histopatológicas em cortes de córtex cerebral dos camundongos lesados por etanol. No T-Maze, o grupo do etanol apresentou significativos (p<0,001, Teste de Kruskal-Wallis) déficits de atenção, necessitando de mais sessões para aprender. Os déficits foram revertidos pelo MFD e pela RBX. (Cont. 1,5±0,32, Et 7,18±0,32, MFD+Et 3,14±0,88, RBX+Et 1,55±0,33). Na fase de discriminação tardia, os animais lesados também apresentaram déficits de memória, com menor número de acertos quando comparados aos controles. O efeito revertido pelo MFD, mas não pela RBX. (Cont. 25,78±0,86, Et 21,27±1,02, MFD+Et 25,14±1,03, RBX+Et 21,88±1,00) Não houve déficits de memória aversiva na Esquiva Passiva. No Y-Maze, o grupo do etanol apresentou déficits de memória de trabalho, revertidos pelo MFD, mas não por RBX. (Cont. 73,28±4,75, Et 43,53±4,65, MFD+Et 60,57±1,92, RBX+Et 54,63±2,80). No Campo Aberto, o grupo do etanol teve hipoatividade motora, o que foi mitigado por MFD e RBX (Cont. 93,59±6,38, Et 66,52±5,87, MFD+Et 98,14±9,23, RBX+Et 77,3±7,68) No Claro-Escuro, o grupo do etanol mostrou comportamento ansiogênico, permanecendo menos tempo no claro, o que foi revertido pela RBX. (Cont. 149±5,99, Et 115,4±4,27, MFD+Et 120,1±6,81, RBX+Et 149,1±2,55). No Plus-Maze, o grupo etanol apresentou comportamento ansiogênico, revertido pela RBX, mas não pelo MFD (Cont. 88,06±12,52, Et 50,53±5,99, MFD+Et 39,86±12,00, RBX+Et 86,29±9,49). No Nado-Forçado, o grupo do etanol teve um comportamento depressivo que não foi melhorado por MFD ou RBX (Cont. 74,17±23,43, Et 141,8±19,3, MFD+Et 178,9±12,43, RBX+Et 118,5±18,25). Concluímos que camundongos lesados por etanol no período neonatal apresentam déficits de atenção e memória que são adequadamente revertidos por MFD. A RBX permanece como droga de segunda escolha, principalmente em casos onde existem comorbidades como ansiedade.
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Investigação dos mecanismos de ação da atividade gastroprotetora de 1,4-cineol em modelos de úlcera gástrica em camundongos / Investigation of mechanisms of action of gastroprotective activity of 1,4-cineole in gastric ulcer models in mice

Feitosa, Mariana Lima January 2012 (has links)
FEITOSA, Mariana Lima. Investigação dos mecanismos de ação da atividade gastroprotetora de 1, 4-cineol em modelos de úlcera gástrica em camundongos. 2012. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-03T14:01:30Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mlfeitosa.pdf: 1031845 bytes, checksum: a7c8912562cdd64b18d303e6b41aad66 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-03T14:12:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mlfeitosa.pdf: 1031845 bytes, checksum: a7c8912562cdd64b18d303e6b41aad66 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-03T14:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mlfeitosa.pdf: 1031845 bytes, checksum: a7c8912562cdd64b18d303e6b41aad66 (MD5) Previous issue date: 2012 / 1,4-Cineole is a widely distributed monoterpene ether, which is one of the flavor constituents of lime juice. The aim of this work was to evaluate the gastroprotective effect of 1,4-Cineole (CIN 100 and 200 mg/Kg) on ethanol or piroxicam-induced lesions in mice and further investigate the possible pharmacological mechanisms involved in this action. The oral administration of 1,4-cineole 200 mg/kg was able to protect the gastric mucosa from ethanol injury (0.2 ml/animal, p.o.). This gastroprotection was also evaluated microscopically showing that CIN (200 mg/kg, p.o.) decreased the cell loss in the mucosa, submucosal edema, inflammatory infiltration and hemorrhage. 1,4-Cineole (100 and 200 mg/kg, p.o.) also reduced significantly the gastric lesions induced by piroxicam (30 mg/kg, s.c.). Gastroprotective mechanism of CIN was examined in the dose of 200 mg/kg, in the model of gastric lesions induced by ethanol in mice. In animals pretreated with L-NAME (10 mg/kg, i.p.), an inhibitor of nitric oxide synthase, or with glibenclamide (10 mg/kg, i.p.), a drug that blocks ATP-dependent potassium channels, or with capsazepine (5 mg/kg, i.p.), an antagonist of vanilloid receptor TRPV-1, the gastroprotective effect of CIN was not inhibited significantly, suggesting that the effect of CIN is not involved with this mechanisms. Otherwise, the gastroprotective effect of CIN (200 mg/kg, p.o.) was reverted in animals pretreated with indomethacin (10 mg/kg, p.o.), a nonselective inhibitor of cyclooxygenase, demonstrating that there is activation of these enzymes in the mechanism of action of CIN. This work also evaluated the antioxidant mechanism of CIN as gastroprotective agent against ethanol-induced lesions. Under our experimental conditions, the model of induction of ethanol injury caused changes in the antioxidant system of the gastric mucosa of mice as the decrease in the levels of sulfhydryl groups (GSH) and activity of superoxide dismutase (SOD), also showed increased activity of myeloperoxidase (MPO) and high concentration of species that react with thiobarbituric acid (TBARS) as index of lipid peroxidation (LPO). 1,4-Cineole (200 mg/kg, p.o.) in the model of ethanol did not interfere with the concentration of GSH, but allowed the restoration of normal SOD activity, normal levels of LPO and MPO activity. The data suggest that CIN 100 and 200 mg/kg promote gastroprotection against lesions induced by ethanol or piroxicam in mice whose mechanisms include the involvement of endogenous prostaglandins and potent antioxidant activity. / 1,4-Cineol é um monoterpeno éter amplamente distribuido, o qual é um dos constituintes responsáveis pelo odor do limão. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito gastroprotetor de 1,4-Cineol (CIN 100 e 200 mg/Kg) nos modelos de lesão induzidas por etanol ou piroxicam em camundongos e, posteriormente, investigar os possíveis mecanismos de ação farmacológica envolvidos nesta ação. A administração oral de 1,4-cineol 200 mg/Kg foi capaz de proteger a mucosa gástrica dos danos causados pelo etanol (0,2 ml/amimal, v.o). Esta gastroproteção foi também avaliada microscopicamente mostrando que CIN (200 mg/Kg, p.o.) diminuiu o edema na submucosa, o infiltrado inflamatório e a hemorragia. 1,4-Cineol (100 e 200 mg/Kg, v.o.) também reduziu significantemente as lesões gástricas causadas pelo piroxicam (30 mg/Kg, s.c.). O mecanismo de gastroproteção de CIN foi examinado na dose de 200 mg/Kg no modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos. Nos animais pré-tratados com L-NAME (10 mg/Kg, i.p.), um inibidor da oxido nítrico sintetase, com glibenclamida (10 mg/Kg i.p.), uma substância que bloqueia os canais de potássio ATP-dependente, ou com capsazepina (5 mg/Kg i.p.) um antagonista dos receptores vanilóides TRPV-1, o efeito gastroprotetor de CIN não foi significantemente inibido por estes mecanismos. Por outro lado, o efeito gastroprotetor de CIN foi revertido em animais pré-tratados com indometacina (10 mg/Kg v.o.), um inibidor não seletivo da ciclooxigenase, demostrando que há uma ativação desta enzima no mecanismo de ação de CIN. Este trabalho avaliou também o mecanismo antioxidante de CIN como um agente gastroprotetor contra as lesões induzidas pelo etanol. Sob as nossas condições experimentais, o modelo de indução pelo etanol causou mudanças nos sistema antioxidante da mucosa gástrica dos camundongos, como a diminuição dos níveis de grupamentos sulfidrila (GSH) e da atividade da superóxido dismutase (SOD), também mostrou um aumento da atividade da mieloperoxidade (MPO) e uma concentração aumentada das espécies que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) como índice de peroxidação lipídica (LPO). 1.4-Cineol (200 mg/Kg, v.o.) no modelo de úlcera por etanol, não interferiu na concentração do GSH, mas permitiu a restauração da atividade normal de SOD, níveis normais de LPO e de atividade da MPO. Estes dados sugerem que CIN 100 e 200 mg/Kg promovem gastroproteção contra lesões induzidas pelo etanol e/ou piroxicam em camundongos nos quais o mecanismo de ação incluem o envolvimento de prostaglandinas endógenas e uma potente atividade antioxidante.
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AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA CLARITROMICINA E DA AMICACINA NO TRATAMENTO DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS BALB/c PELO Mycobacterium massiliense.

COLOMBO, D. C. 21 August 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_5814_.pdf: 1830756 bytes, checksum: 55a7814867e39fbb1ce396fc67d61324 (MD5) Previous issue date: 2012-08-21 / Infecções nosocomiais causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm aumentado significativamente nos últimos anos em países desenvolvidos e em desenvolvimento. No Brasil, a ocorrência de surtos de infecções por MCR foi descrita durante a última década e envolveu, na grande maioria dos casos, uma mesma cepa de M. massiliense, denominada BRA100. Essa micobactéria, assim como as demais espécies do grupo MCR, apresenta resistência a um amplo espectro de antimicrobianos, o que limita as opções terapêuticas de tratamento dos pacientes enfermos. Em razão da inexistência de ensaios clínicos que estabeleçam regimes ou esquemas terapêuticos apropriados, as diretrizes atuais para o tratamento das infecções causadas por esses microrganismos são baseadas nas atividades in vitro dos antimicrobianos e em relatos de experiências clínicas de casos. Entretanto, existem variações na correlação entre os resultados dos testes de susceptibilidade in vitro e a resposta clínica terapêutica observada, o que gera uma polêmica acerca do seu uso para fundamentar a terapia medicamentosa das infecções por MCR. Nesse contexto, realizamos este estudo para avaliar a atividade da claritromicina e da amicacina contra Mycobacterium massiliense em camundongos BALB/c infectados. A determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) da claritromicina e da amicacina para o isolado de M. massiliense, obtido de um surto hospitalar ocorrido em 2007, foi realizada pelo método de microdiluição em caldo Müeller-Hinton. Para os testes in vivo, camundongos BALB/c foram infectados, via intravenosa, com aproximadamente 1-2 x 107 UFC/mL de M. massiliense. O tratamento com amicacina ou com lactobionato de claritromicina teve início um dia após a infecção. Os animais receberam diariamente, via subcutânea, 0,1 mL de lactobionato de claritromicina (50mg/kg/12h), ou 0,1 mL de amicacina (100mg/Kg/dia), durante 14 dias, e foram sacrificados 24h-48h após a administração da última dose. Baço e fígado foram removidos para determinação do peso e contagem do N° de UFC (log10) por órgão. Os nossos resultados demonstraram atividade in vitro da claritromicina e da amicacina contra o isolado de M. massiliense. O tratamento de camundongos BALB/c com claritromicina impediu a evolução da hepatoesplenomegalia, bem como a formação de lesões granulomatosas durante os 15 dias de infecção com M. massiliense. Apesar disso, a claritromicina e mesmo a amicacina não foram eficientes na redução da população bacteriana de M. massiliense nos órgãos. A susceptibilidade in vitro das bactérias isoladas dos órgãos dos camundongos tratados com lactobionato de claritromicina ou com amicacina e dos camundongos controles foi determinada e demonstrou que não houve o desenvolvimento de resistência induzível a esses antimicrobianos durante o tratamento. Em conclusão, não houve correlação entre as atividades in vitro e in vivo da claritromcina e da amicacina contra M. massiliense. PALAVRAS CHAVES: Mycobacterium massiliense, tratamento, camundongos.
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Expressão e funcionalidade do receptor P2X7 em linhagem de glioma de camundongo GL261

Tamajusuku, Alessandra Sayuri Kikuchi January 2010 (has links)
O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença. / Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.

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