Urease, uma enzima encontrada em diversas espécies de plantas, catalisa a hidrólise de uréia, formando amônia e dióxido de carbono. Esta enzima é encontrada também em bactérias, fungos e alguns invertebrados e apresenta três domínios: alfa, beta e gama. Em Canavalia ensiformis, foram descritas mais de uma isoforma de urease: a urease clássica JBU (Jack bean urease - cDNA e proteína), o cDNA jbure-II e a proteína canatoxina. A sequência jbure-II, obtida previamente, codificava uma proteína hipotética incompleta nos domínios alfa e gama (correspondentes as regiões terminais 5´ e 3´ do cDNA). Neste trabalho, demonstramos a clonagem de um cDNA denominado jbure-IIB, que codifica uma proteína predita com os domínios completos. Análises filogenéticas e modelagem molecular da proteína predita foram realizadas. A estrutura proposta para a proteína hipotética JBURE-IIB possui uma forma similar às das ureases bacterianas, exceto pela presença de duas regiões de ligação, que conectam os três domínios das ureases, ausentes nas ureases bacterianas. Todos os resíduos críticos para a atividade ureásica foram detectados. Em seguida, o cDNA completo de jbure-IIB foi obtido através de sobreposição dos fragmentos clonados (5’, interno e 3’), utilizando uma técnica de “PCR overlap” modificada. O cDNA foi clonado no vetor pET101, a proteína heteróloga foi produzida em Escherichia coli e sua presença confirmada por análises de Western blot. A atividade da urease recombinante foi observada em placas das colônias transformadas induzidas, na presença de uréia e níquel. A proteína canatoxina apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos. Sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) pelas catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Baseado na seqüência N-terminal e tamanho de pepcanatox, projetamos oligonucleotideos para amplificar um fragmento de 270 pb, usando o cDNA jbure-II como molde. Este fragmento, denominado jaburetox-2 (“Jack bean urease toxin 2”) foi clonado em vetor pET101 e expresso em E. coli. O peptídeo recombinante foi denominado jaburetox-2Ec (“Jack bean urease toxin 2” expresso em células de E. coli, contendo uma metionina inicial e acrescido, na região Cxiii terminal, do epitopo V-5 e seis resíduos de Histidina). Sua atividade inseticida foi testada contra ninfas de Dysdercus peruvianus e larvas de Spodoptera frugiperda, obtendo-se 100% de mortalidade. Em seguida, cultivou-se a bactéria recombinante em biorreatores para obtenção de grandes quantidades de peptídeo, que foi purificado e testado contra Rhodnius prolixus (4º instars) e Triatoma infestans (5º instars e adultos). A injeção de jaburetox-2Ec (1 μg/mg de peso vivo do inseto) resultou em 100% de mortalidade. Em contraste, altas doses do peptídeo foram inócuas quando injetadas ou ingeridas por ratos neonatos e camundongos. Corroborando com estes resultados, a modelagem molecular “ab initio” de jaburetox-2Ec revelou um motivo de “grampo beta” consistente com atividade inseticida, possivelmente baseada em neurotoxicidade ou alteração de permeabilidade celular. Adicionalmente, plantas de tabaco foram transformadas com o vetor pCAMBIA contendo o fragmento de cDNA jaburetox-2 (acrescido de um códon de iniciação e um códon de terminação da tradução) e as plantas transformadas, PCR positivas, foram testadas contra S. frugiperda. Realizou-se alimentação direta com as folhas de tabaco e observaram-se diferentes níveis de mortalidade (50-100%), provocadas por diferentes plantas, após 15-30 dias. O conjunto de dados desta tese demonstra o potencial uso de jaburetox-2 como um transgene para construção de plantas resistentes a insetos e contribui para elucidação do mecanismo de ação da atividade inseticida de ureases, bem como seu possível papel na defesa da planta. / Urease, an ubiquitous enzyme in plants, catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Urease is also found in bacteria, fungi and some invertebrates. In Canavalia ensiformis there are more than one isoform of urease: the classic JBU (the major isoform), JBURE-II and the protein Canatoxin. In a previous study, a partial sequence of jbure-II was obtained that putatively codify for an enzyme incomplete at the alfa and gamma domains. In this work, we report the cloning of a cDNA named jbure-IIB, encoding a complete urease protein with the expected 90 kDa size. Phylogenetic studies of the urease sequence and the molecular modeling of the putative protein are also presented. Its modeled structure has an overall shape similar to that of related bacterial ureases except for the presence of two linking regions that connect the three domains of ureases. All critical residues for urease activity are present. The complete cDNA was obtained by overlapping the three parts of cloned cDNA (5’, middle part and 3’) using a modified PCR overlap technique. The cDNA was cloned into PET101 vector and the heterologous protein was produced in Escherichia coli cells and confirmed by Western blot analyses. The activity of the recombinant urease was observed in a urea segregation agar containing urea and nickel. Canatoxin displays insecticidal activity against different insect species. The entomotoxicity relies on an internal 10 kDa peptide (pepcanatox), released by hydrolysis of Canatoxin by cathepsins in the digestive system of susceptible insects. Here, based on the N-terminal sequence of pepcanatox, we designed primers to amplify by PCR a 270-bp fragment corresponding to pepcanatox using jbure-II cDNA as a template. This amplicon named jaburetox-2 (“jack bean urease toxin 2”) was cloned into pET101 vector and expressed in E. coli. The recombinant peptide was named jaburetox-2Ec and its insecticidal effect was demonstrated against Dysdercus peruvianus and Spodoptera frugiperda larvaes, in which it induced 100% mortality. Bacterial cultivation in bioreactors was carried out with lactose as inducer to obtain large amounts of recombinant peptide. It was tested against Rhodnius prolixus (4th instars) and Triatoma infestans (5th instars and xv adults) by injection and 1 μg/mg insect body weight resulted in 100% mortality. In contrast, high doses of jaburetox-2Ec were innocuous when injected or ingested by mice and neonate rats. Modeling of jaburetox-2Ec, and comparison with other peptide structures, revealed a prominent β-hairpin motif consistent with an insecticidal activity based on either neurotoxicity or alteration of cell permeability. Finally, tobacco plants were transformed with pCAMBIA vector containing the jaburetox-2 fragment (with a start and a stop codon) and the transformed plants were tested against S. frugiperda. Mortality varying from 50-100% of the insects feeding on different transformed plants was observed after 15-30 days. Our results showed the potential use of jaburetox-2 as transgene to engineering insect resistance into plant and contribute to elucidation of mechanisms of action of urease insecticidal activity, as well as its possible role in plant defense.

Ureases são enzimas altamente homólogas, encontradas em plantas, bactérias e fungos. A urease de feijão de porco, Canavalia ensiformis, foi a primeira enzima a ser cristalizada e também a primeira cuja presença de níquel foi demonstrada. Canatoxina, uma isoforma da urease de C. ensiformis, apresenta diversas atividades biológicas, além de sua atividade ureolítica: 1) atividade inseticida; 2) efeito secretagogo e pró-agregante em plaquetas de coelho; 3) ligação a glicoconjugados que contém ácido siálico; 4) atividade pró-inflamatória. Esses efeitos são independentes de sua atividade hidrolítica sobre a uréia, e envolvem ativação do metabolismo de eicosanóides e canais de cálcio. Outras ureases compartilham algumas atividades biológicas da canatoxina, como indução de agregação plaquetária por ureases de vegetais e de Bacillus pasteurii, e efeito inseticida, uma propriedade só encontrada para as ureases de plantas. Ureases microbianas contribuem para a patogênese de cálculos urinários, pielonefrites, incrustação de cateter, úlcera péptica e, possivelmente, tumores gástricos. Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, causa úlcera péptica e carcinoma gástrico distal por um mecanismo ainda não completamente elucidado até o momento. Neste trabalho ureases de bactérias são estudadas, objetivando investigar se elas apresentam alguns dos efeitos biológicos descritos para a canatoxina. Foi demonstrado que as ureases recombinante de H. pylori e nativa de B. pasteurii induzem agregação de plaquetas de coelho por um mecanismo, similar ao da canatoxina, mediado por eicosanóides derivados da via da lipoxigenase. Os efeitos pró-inflamatórios da urease de H. pylori são também similares ao apresentado pela canatoxina e mediados pelo mesmo mecanismo de sinalização. Esses resultados contribuem para o entendimento da fisiopatologia de distúrbios causados por organismos produtores de urease. / Ureases are highly homologous enzymes found in plants, bacteria and fungi. Urease of the jackbean, Canavalia ensiformis, was the first enzyme ever crystallized and also the first enzyme shown to contain nickel. Canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents several other biological effects besides its ureolytic property: 1) insecticidal effect; 2) pro-aggregating activity in rabbit platelets; 3) binding to sialic acid-containing glycoconjugates; 4) pro-inflammatory activity. These effects are independent of urea hydrolysis and require activation of the eicosanoid metabolism and calcium channels. Other ureases have some of biological activities described for canatoxin, such as induction of platelet aggregation by jackbean and soybean ureases, and also Bacillus pasteurii urease, while insecticidal effects were seen only for plant-derived ureases. Microbial ureases play a role in the pathogenesis of urinary stones, pyelonephritis, urinary catheter incrustation, peptic ulceration and possibly in gastric tumors. Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach mucosa, causes gastric ulcers and cancer through a mechanism not yet fully elucidated. In this work we studied bacterial ureases to find out if they present some of the biological properties described for canatoxin. We demonstrate that a recombinant Helicobacter pylori urease and a native Bacillus pasteurii urease induce aggregation of rabbit platelets by a mechanism similar to that recruited by canatoxin, involving mediation by lipoxygenase-derived eicosanoids. H. pylori urease also induces pro-inflammatory effects similar to those presented by canatoxin and are mediated by the same signalling pathway. These findings may contribute to the enlightening of physiopathology of diseases promoted by ureaseproducing bacteria.

Orientador: Graciliano de Oliveira Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-19T23:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RoverJunior_Laercio_M.pdf: 1973498 bytes, checksum: a8176355af0b235fa0b0fdf3bd93dfe8 (MD5) Previous issue date: 1995 / Mestrado

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-29Bitstream added on 2014-06-13T19:49:18Z : No. of bitstreams: 1 vacari_fcm_me_sjrp.pdf: 2872179 bytes, checksum: 1bf0cdb8298278a7abef6a8501917773 (MD5) / Este trabalho teve por objetivo cristalizar e resolver tridimensionalmente as estruturas das proteínas Canavalia gladiata lectin (CGL) e Canavalia marítima lectin (CML), ambas complexadas com o açúcar manose 1-6 manose, encontradas em sementes de leguminosas. Para o processo de cristalização foi utilizado um kit de cristalização, contendo 96 soluções previstas pelo método de cristalização da matriz esparsa, denominado Screen Index (Hampton Research). Para o processo de resolução de estrutura foi utilizado diversos métodos computacionais dentre eles, o programa CCP4 (Collaborative Computational Project n° 4). Já com a estrutura resolvida, pode-se observar o sítio de ligação da proteína e identificar quais aminoácidos fazem parte do mesmo; calcular o RMSD médio entre as estruturas nativa e complexada com o açúcar manose 1-6 manose; comparar os sítios de ligação das proteínas CGL e CML complexadas com os açúcares man 1-2 man, man 1-3 man, man 1-4 man e man 1-6 man. Enfim, o trabalho colaborou para que duas novas estruturas fossem depositadas no banco de dados PDB (Protein Data Bank), para que futuros pesquisadores possam realizar estudos utilizando essas estruturas já resolvidas. / This study aimed to crystallize and solve the three-dimensional structures of proteins Canavalia gladiata lectin (CGL) e Canavalia maritime lectin (CML), both complexed with sugar manose 1-6 manose, found in legume seed. For the crystallization process was used a kit of crystallization, containing 96 solutions provided by the method of crystallization of the sparse matrix, called Screen Index (Hampton Research). For the process of resolution structure was used several computation methods among them, the program CCP4 (Collaborative Computational Project n° 4). Now with the structure resolved, can observe the binding siti of protein and amino acids to identify which part of the same; calculate the avarage RMSD betweem the native and complexed structures with the sugar manose 1-6 manose; compare the binding sites of CGL and CML proteins complexed with sugars man 1-2 man, man 1-3 man, man 1-4 man and man 1-6 man. Finally, the work helped the two new structures were deposited in the PDB database, for future researchers to conduct studies using these structures already solved.

nÃo hà / Cristais da lectina de sementes de Canavalia maritima (ConM) nativa foram obtidos pelo mÃtodo da difusÃo de vapor em gota suspensa com soluÃÃo do reservatÃrio contendo tampÃo Hepes 0,1M pH 8.43 com 4% v/v de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amÃnio. AtravÃs de âsoakingâ dos cristais com ligantes glicÃdicos foram produzidos cristais da lectina complexada aos aÃucares maltose e trealose. Os cristais obtidos de ConM nativa difrataram a uma resoluÃÃo mÃxima de 1,56 Ã, pertencendo ao grupo primitivo ortorrÃmbico, P21212 com parÃmetros de cÃlula de a=67.9, b=71.0, c=97.6 à e apresentando um dÃmero na unidade assimÃtrica (VM = 2,4 A3 Da-1). Com base nas densidades eletrÃnicas dos resÃduos da estrutura tridimensional resolvida, constatou-se que a sequencia de Perez et al (1991) apresentava erros, que quando corrigidos e comparados com a seqÃÃncia de ConA, aumentaram para 98% o grau de similaridade entre as duas lectinas. A estrutura de ConM nativa exibe um alto grau de enovelamento terciÃrio, tÃpico das lectinas de leguminosas, com visÃvel conservaÃÃo do sÃtio de ligaÃÃo a metais e loops envolvidos na oligomerizaÃÃo molecular. Embora a especificidade e o nÃmero de pontes de hidrogÃnio formadas na interaÃÃo com os dissacarÃdeos maltose e trealose seja a mesma, estruturalmente ocorrem diferenÃas no padrÃo de formaÃÃo de pontes de hidrogÃnio, principalmente na distribuiÃÃo do nÃmero de pontes de hidrogÃnio entre os dois resÃduos de glicose dos dissacarÃdeos. Os ensaios de atividade biolÃgica mostraram que o efeito relaxante concentraÃÃo-dependente da lectina de sementes de Canavalia maritima em anÃis de aorta isolados ocorre provavelmente atravÃs da interaÃÃo com um sÃtio de ligaÃÃo lectina-especÃfico presente no endotÃlio, resultando em liberaÃÃo de Ãxido nÃtrico. / Crystals of Canavalia maritima seeds lectin (ConM) were obtained using the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix with reservatory solution containing 0,1 M HEPES, pH 8,43, 4% Polyethylene Glycol 400 and 2 M ammonium sulfate. The soaking technic was used to produce lectin crystals complexed with the carbohydrates maltose and trehalose. ConM native crystals diffracted to 1.56 à resolution, belonging to the primitive orthorhombic space group P21212, with unit-cell parameters a=67.9, b=71.0, c=97.6 Ã, consisting in a dimer in the asymmetric unit (VM = 2,4 A3 Da-1), with two metal binding sites per monomer, and loops involved in the molecular oligomerization. The structure was solved by standard molecular replacement techniques. The wrong amino acids residues previously suggested by manual sequencing by Perez et al. (1991) are now determinated as I17, I53, S129, S134, G144, S164, P165, S187, V190, S169, T196 and S202. These modifications confer 98% of similarity between ConM, ConA and ConBr. ConM structure presents a high level of tertiary protein folding, typically of legume lectins. Despite the specificity and the numbers of hydrogen bonds formed in the interaction with the disaccharides maltose and trehalose be the same, structurally changes occurs in the pattern of formation of the hydrogen bonds, especially in the distribution in the number of hydrogen bonds between the two glucose residues of the disaccharides. Our biological activity data show that the relaxant concentration-dependent effect of the seed lectin of Canavalia maritima on isolated aortic rings probably occurs via interaction with a specific lectin-binding site on the endothelium, resulting in a release of nitric oxide.

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Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10705_77 - Esequiel Santos.pdf: 4699017 bytes, checksum: 5fc00aa9ef34cb4c3df7b834203d08c2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Diversos fatores podem interferir no desempenho da fitorremediação de herbicidas no solo, em particular a mineralogia e a atividade microbiana. Com o objetivo de realizar investigações em condições edáficas, utilizando as espécies Canavalia ensiformis e Crotalaria juncea, foi avaliado o efeito da mineralogia e da rizosfera na fitorremediação do herbicida sulfentrazone. Na primeira etapa, os tratamentos foram compostos pela combinação entre três tipos de solos, com texturas diferentes, variando quanto à mineralogia da fração argila dominada por um tipo de mineral (caulinita, hematita e gibbsita) e duas doses de sulfentrazone (0 e 400 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 3 x 2, em DBC, com três repetições. Para o bioensaio, foi semeada uma espécie bioindicadora de resíduo de sulfentrazone no solo, o milheto (Pennisetum glaucum). Os resultados demonstraram que a movimentação do herbicida foi maior no solo caulinítico e a retenção do herbicida foi maior no solo hematítico. A fitorremediação foi mais eficiente no pré-cultivo da C. ensiformis no solo gibbsítico, reduzindo em 28% a carga de sulfentrazone aplicada. Não houve resultado para o solo hematítico. No solo caulinítico, a C. ensiformis reduziu a massa total de sulfentrazone em aproximadamente 11% e a C. juncea em 19%. Na segunda etapa, avaliou-se também a contribuição microbiana rizosférica dessas mesmas espécies na fitorremediação do sulfentrazone. Os tratamentos foram compostos pela combinação de dois solos rizosféricos (feijão de porco e crotalária) e um não-rizosférico com quatro níveis de contaminação pelo herbicida sulfentrazone (0, 200, 400 e 800 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 4. Foram avaliados evolução de CO2, carbono da biomassa microbiana (CBM), quociente metabólico (qCO2), componentes biométricos e fitotoxidade no P. glaucum, em bioensaio e cromatografia líquida do solo. Os resultados indicaram que o cultivo das espécies fitorremediadoras promoveu incremento da atividade microbiana e foi verificado que os perfis genéticos bacterianos foram formados de acordo com a planta e a característica de solo (rizosférico e não rizosférico), ampliando os conhecimentos a respeito das associações entre as plantas e microrganismos.

Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.

Ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Além disso, apresentam diversas propriedades independentes da catálise, sendo consideradas proteínas moonlighting. São amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em bactérias, arqueas, plantas e fungos, podendo se organizar em unidades funcionais compostas por uma, duas ou três subunidades. Sua ativação, que envolve a passagem da enzima de sua forma apo-urease a sua forma holourease, requer pelo menos três proteínas acessórias. Parte de suas propriedades não-catalíticas é associada à liberação de peptídeos internos da proteína nativa. Nesse contexto, a presente tese se dedicou ao estudo de diferentes aspectos da biologia estrutural de ureases. Ao elaborar uma narrativa filogenética, envolvendo varredura de bancos de dados em larga escala e diferentes algoritmos de reconstrução de árvores, foi possível propor uma rota evolutiva indicando a transição de três subunidades para uma única unidade funcional, sem passar por intermediários de duas cadeias. Quanto ao seu processo de ativação, por meio de múltiplos cálculos de atracamento baseados em dados experimentais prévios (especialmente SAXS), foram propostas estruturas para suas diferentes etapas, em resolução atomística. Finalmente, o comportamento dinâmico de diferentes peptídeos derivados de urease foram analisados computacionalmente por meio de simulações de longa duração (500 ns) e associados a outros dados obtidos in vitro, permitindo justificar efeitos diferenciais obtidos na aplicação destes peptídeos. De maneira geral, o trabalho empregou técnicas computacionais à análise de ureases, fornecendo bases para futuros estudos de suas propriedades, sejam catalíticas ou não, incluindo sua aplicação biotecnológica. / Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. They have many catalysis-independent properties, being considered moonlighting proteins. Ureases are found in bacteria, archaea, plants, and fungi, and may be organized in functional units composed by one, two, or three subunits. Their activation, involving the transition from apo to holourease, requires at least three accessory proteins. Some of their non-catalytic properties are related to the release of internal peptides from the native protein. In this context, this thesis was developed upon the study of different aspects of urease structural biology. By phylogenetical reconstruction, employing large-scale databank scans and different tree-building algorithms, we were able to propose an evolutionary route by which the transition from three to one functional subunits was possible, with no need for a two-chained intermediate. Regarding the activation mechanism, we have proposed structural models for the oligomeric intermediates of the process by multiple docking calculations, at atomistic resolution, based on previous experimental data (especially SAXS). Additionally, the dynamical behavior of different ureasederived peptides was analyzed by computational simulations at large time scales (500 ns) and correlated to in vitro results, allowing us to explain the variable effects observed after their application on test systems. In short, in this work we have employed computational techniques to the analysis of urease, providing working grounds for further studies of this enzyme and its properties (catalytical or not), including its biotechnological applicability.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.