SANTIAGO, Mayara Queiroz de. Caracterização de bioconjugados de pontos quânticos de ZnCdTe com a lectina de Canavalia brasiliensis. 2016. 61 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-19T17:21:52Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T20:14:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T20:14:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_mqsantiago.pdf: 3231763 bytes, checksum: 468a68767941f630f31f3ebca5cb18a4 (MD5) Previous issue date: 2016 / In recent years, researchers have focused their effort to the development of techniques with an interest in diagnostic strategies. To understand the onset and progression of various diseases before the action of any drug is necessary to evaluate the interactions of biological molecules in various cellular processes, this can be done by the use of biomarking strategies. Quantum dots (QDs) are fluorescent inorganic semiconductor compounds, which exhibit quantum confinement in three dimensions and unique optical properties and may be used in the imaging and detection of diagnostic signals. Lectins, proteins/glycoproteins that interact reversibly to specific carbohydrates, are already applied in several studies of biological activities due to its recognition properties. In view of this, the objective of this work was the bioconjugation of quantum dots ZnCdTe with the lectin of Canavalia brasiliensis (ConBr), the physicochemical characterization, evaluation of fluorescence properties and hemagglutination the formed system. The ZnCdTe synthesized nanoparticles were functionalized with a glutaraldehyde linker and then, submitted to bioconjugation reaction with the lectin. The obtained system ZnCdTe-ConBr was subjected to various analyzes such as particle size by Dynamic Light Scattering (DLS); evaluation of optical properties by UV/Visible Spectroscopy Absorption (UV/Vis) and photoluminescence spectroscopy; chemical evaluation of bioconjugation by Infrared Spectroscopy (FT-IR); assessment of morphology and microcomposition by Scanning Electron Microscopy (SEM); topographical evaluation, mechanical and physicochemical properties by Atomic Force Microscopy (AFM); and evaluation of lectin carbohydrate binding site integrity for haemagglutinating activity (H.A.). The results suggest that ZnCdTe-ConBr system was covalently conjugated after the reaction. It was also observed an increase in particle size and a greater homogeneity compared to non-conjugated quantum dots. The optical and functional properties of ZnCdTe-ConBr system was kept displaying a degree of high colloidal stability and functional over a period of 60 days. It was concluded that the system obtained here can be used as a biotechnological tool for use in diagnostic imaging technique. / Nos últimos anos, pesquisadores da área da saúde têm somado esforços voltados para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas biotecnológicas com um interesse especial em estratégias de diagnósticos. Para compreender o surgimento e a progressão de várias doenças diante de qualquer fármaco é necessário compreender a interação espaço-temporal das moléculas biológicas em vários processos celulares com o uso de estratégias de biomarcação para o monitoramento. Os pontos quânticos (PQs) são compostos inorgânicos semicondutores fluorescentes, que apresentam confinamento quântico em três dimensões e propriedades ópticas únicas e podem ser empregados na geração de imagens e detecção de sinais em diagnósticos. As lectinas, proteínas/glicoproteínas que interagem de forma reversível a carboidratos específicos, já são aplicadas em diversos estudos de atividades biológicas por esta propriedade de reconhecimento. Diante disto, o presente trabalho objetiva a bioconjugação de pontos quânticos de ZnCdTe com a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr), a caracterização físico-química e avaliação das propriedades de fluorescência e hemaglutinação do sistema formado. As nanopartículas de ZnCdTe foram obtidas do Laboratório de Quimica Biologica e Materiais (Quibiom) do Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (UFS), funcionalizadas com um linker de glutaraldeído, e em seguida foram submetidas à reação de bioconjugação com a lectina. O sistema obtido ZnCdTe-ConBr foi submetido a diversas análises como: tamanho de partícula por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS - Dynamic light scattering); avaliação das propriedades óticas por Espectroscopia de Absorção Ultravioleta/Visível (UV/Vis) e Espectroscopia de Fotoluminescência; avaliação química da bioconjugação por Espectroscopia no Infravermelho (FT-IR - Fourier Transform InfraRed); avaliação da morfologia e microcomposição por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); avaliação topográfica, propriedades mecânicas e físico-químicas por Microscopia de Força Atômica (AFM - Atomic Force Microscopy); e avaliação da integridade do sítio de ligação à carboidratos por Atividade Hemaglutinante (A.H.). Os resultados obtidos sugerem que o sistema ZnCdTe- ConBr foi conjugado covalentemente após a reação. Observou-se também um aumento do tamanho de partícula e uma homogeneidade maior comparado aos pontos quânticos não-conjugados. As propriedades óticas e funcionais (hemaglutinação) do sistema ZnCdTe-ConBr foram mantidas apresentando uma certa estabilidade coloidal e funcional durante um período de até 60 dias. Conclui-se então que o sistema aqui obtido pode ser utilizado como uma nova ferramenta biotecnológica para o desenvolvimento de uma técnica de diagnóstico por imagem.

OSTERNE, Vinícius José da Silva. Estudos de estrutura-função da lectina de sementes de Canavalia virosa com atividade inflamatória e citotóxica: uma potencial ferramenta anticâncer. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-19T17:48:06Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T20:17:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T20:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) Previous issue date: 2016 / Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and are capable of forming complexes with molecules containing saccharides without changing the structure of the glycosil ligands. Because of the diverse biological activities displayed by these proteins they have great applicability in biotechnology. In this context, this work reports the obtention of primary and three-dimensional structures of lectin extracted from Canavalia virosa seeds, called ConV, In addition to the analysis of its effects on inflammatory process and as cytotoxic agent for glioma cells. The Canavalia virosa plant belongs to the legume family, subtribe Diocleinae. The largest number of studies with lectins focuses on this family and the subtribe Diocleinae are noteworthy due to the presence of highly studied lectins such as ConA. Lectins from Diocleinae have high structural similarity but differ on the results of biological activities, which may be explained by the structural study of proteins. ConV was purified by a single step by affinity chromatography with Sephadex G-50 matrix. The amino acid sequence of the lectin was obtained by mass spectrometry and showed high similarity to other plant lectins derived from the same subtribe. ConV crystals used for determination of the three dimensional structure were obtained by vapor diffusion method at 293 K and belonged to orthorhombic space group P21221 with a dimer in its asymmetric unit. The structure was solved at 2.53 Å and the methodology chosen to solve the phase problem was the molecular replacement using coordinates of the lectin from Canavalia maritima (PDB: 2CWM). The structure obtained after all the refinements presented Rfactor and Rfree of 18.91% and 24.92% respectively, with no residues in not allowed regions of Ramachandran plot. The obtained structure proved to be very similar to other lectins from the same gender. In inflammatory tests, ConV elicited edema, increasing the animal’s paw volume, and the incubation of lectin with glucose before the application was able to reduce the edematogenic effect indicating the involvement of the carbohydrate recognition domain in this process. ConV showed high toxicity to glioma cells with IC 50 of 58.8 µg/mL, this toxicity is probably caused by the induction of autophagy in these cells, indicating a anticancer potential for the lectin. In silico studies confirmed that ConV interacts preferentially with dimmanosides and trimmanosides, carbohydrates that compose the N-glycans of glycoproteins. This finding corroborates with the hypothesis that the lectin domain interacts with receptors containing mannosides and this contributes to the effects observed in biological activities. / Lectinas são proteínas que se ligam de forma específica a carboidratos e são capazes de formar complexos com moléculas contendo sacarídeos, sem alterar a estrutura covalente dos ligantes glicosídicos. Devido as diversas atividades biológicas apresentadas por essas proteínas, elas possuem grande aplicabilidade em biotecnologia. Nesse contexto, o presente trabalho relata a obtenção das estruturas primária e tridimensional da lectina extraída de sementes de Canavalia virosa, denominada ConV, além da investigação dos seus efeitos no processo inflamatório e como agente citotóxico para células de glioma. A planta Canavalia virosa pertence a família das leguminosas, subtribo Diocleinae. A maior quantidade de estudos com lectinas se concentram nesta família e a subtribo Diocleinae merece destaque devido a presença de lectinas altamente estudadas como a ConA. As lectinas de Diocleinae apresentam alta similaridade estrutural mas apresentam diferenças nos resultados de atividades biológicas, o que pode ser explicado pelo estudo estrutural dessas proteínas. ConV foi purificada em um único passo em cromatografia de afinidade com matriz de Sephadex-G50. A sequência de aminoácidos da lectina foi obtida por espectrometria de massas e apresentou alta similaridade com outras lectinas extraídas de plantas da mesma subtribo. Cristais de ConV utilizados para determinação da estrutura tridimensional foram obtidos pelo método de difusão de vapor a 293 K, apresentaram grupo espacial ortorrômbico P21221 com um dímero na unidade assimétrica. A estrutura foi resolvida a 2,53 Å e a metodologia escolhida para resolver o problema da fase foi a substituição molecular utilizando-se as coordenadas da lectina de Canavalia maritima (PDB: 2CWM) que demonstra 99% de similaridade com ConV. A estrutura obtida após todos os refinamentos apresentou Rfactor e Rfree de 18,91% e 24,92% respectivamente com nenhum resíduo em regiões não permitidas do gráfico de Ramachandran. A estrutura obtida se mostrou bastante semelhante a outras lectinas dos mesmo gênero. Nos ensaios de inflamação, ConV elicitou edema, aumentando o volume da pata dos animais, e a incubação da lectina com glicose antes da aplicação foi capaz de reduzir o efeito edematogênico indicando a participação do domínio de reconhecimento a carboidrato nesse processo. ConV apresentou alta toxicidade para células de glioma com IC50 de 58,8 µg/mL, essa toxicidade provavelmente é causada por indução de autofagia dessas células, indicando potencial anticâncer para a lectina. Estudos in silico confirmaram que ConV interage preferencialmente com dimanosídeos e trimanosídeos, carboidratos que compõem os N-glicanos de glicoproteínas. Esse dado corrobora com a hipótese que o domínio lectínico interage com receptores contendo manosídeos e isso contribui para os efeitos observados nas atividades biológicas.

NÓBREGA, Raphael Batista da. Estruturas cristalográficas da lectina de canavalia brasiliensis complexadas com adenina e ribose: analise estrutural e perspectivas. 2016. 100 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-08-11T17:17:13Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-08-22T21:09:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T21:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rbdanobrega.pdf: 1747142 bytes, checksum: 2fc1ddf9766df7742629554dc08e08d0 (MD5) Previous issue date: 2016 / Legume lectins (e.g ConA) are the most studied plant lectin family. The physiological and biological activities attribute to them, such as plant defense and antidepressant function, take into account their interactions with mono- and oligosaccharides in a specific and reversible manner. However, several studies show that these proteins can bind other biomolecules, such as hydrophobic compounds (e.g. adenine and indole acetic acid) and non protein amino acids (e.g. α-aminobutyric acid, AABA), although the structure-function relationship of these interactions remained poorly understood. In this study, we described two crystallographic structures of ConBr lectin isolated from the seeds of C. brasiliensis, complexed with two different ligands: a complex of the lectin with β-D-ribofuranose and another with adenine, both compounds found in the Carbohydrate-Recognition Domain (CRD). Based on the location of these binders, it is suggested by the docking ConBr can bind to adenosine. In addition, this study shows that AABA can take different provisions in its binding site. Taken together, these results reveal new insights into the physiological and biological activities legume lectins. / A família de lectinas vegetais mais estudadas é a das plantas leguminosas como a Concanavalina A (ConA) – Canavalia ensiformes. As atividades fisiológicas e biológicas atribuídas, tais como defesa da planta e ação antidepressiva, leva em consideração as suas interações com mono e oligossacarídeos de uma maneira específica e reversível. Embora lectinas da subtribo Diocleinae, como a ConA, sejam consideradas específicas para glicose e manose, estudos comparativos mostram que lectinas de diferentes espécies apresentam desempenhos diferenciados frente a um determinado modelo de atividade biológica, algo que parece estar relacionado à arquitetura do Domínio de Reconhecimento a Carboidrato (CRD) e à capacidade (ou não) de ligação a determinados mono- e oligossacarídeos. Além disso, tais atividades parecem não depender apenas da interação com carboidratos, haja vista que diversos estudos mostram que estas proteínas podem se ligar a outras biomoléculas, como compostos hidrofóbicos (a exemplo de adenina e ácido indolacético) e aminoácidos não protéicos (a exemplo do ácido α-aminobutírico – AABA). Neste trabalho, foram descritas duas estruturas cristalográficas da lectina ConBr, isolada de sementes da Canavalia brasiliensis (feijão-bravo-do-Ceará), complexada com dois diferentes ligantes: um complexo da lectina com a β-D-ribofuranose e outro com a adenina, ambos compostos localizados no CRD. Baseado na localização desses ligantes, sugere-se, por Docking que a ConBr pode se ligar à adenosina. Além disso, esse estudo mostra que o AABA pode assumir diferentes disposições em seu sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes resultados revelam novas perspectivas para as atividades fisiológicas e biológicas de lectinas de leguminosas.

FRUTUOSO, Mércia Sindeaux. Efeito adjuvante da lectina de Canavalia brasiliensis no tratamento de Leishmaniose cutânea experimental. 2016. 117 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:05:19Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Rejected by Jairo Viana (jairo@ufc.br), reason: Está faltando título em inglês on 2017-09-19T19:06:36Z (GMT) / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:07:21Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) Previous issue date: 2017 / The leishmaniases are importante public health problem, comprising a very wide spectrum of clinical presentations. The host protection and cure, depend on his or her capacity to mount an imune response type Th1, and IFN-γ is a key molecule on this protective response. The drugs of first choice for the treatment are the pentavalent antimonials, which cause several side effects and the most concerning side effect is the cardiotoxic ones. On the search for alternative treatment, fluconazole has shown promising results, however it has to be given for a longer time and in higher doses to achieve a better response. The Canavalia brasiliensis lectin (ConBr) has been described as a potent immune modulator, as it induces lymphocytic proliferation, with the production of IFN-γ. Based on these data we studied, if ConBr would potentiate the effect of fluconazole on the treatment of experimental cutaneous leishmaniasis, caused by L. braziliensis. To evaluate this, BALB/c mices (n=40) were infected with L. braziliensis and were divide randomly 10 days post-infection, in 5 groups, with the following treatments: 1- fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os); 2- Glucantime® (60mg/Kg/day/10days, intramuscular); 3- ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 4- Fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os) plus ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 5- Saline solution per os. The parameters evaluated on the 200 day post infection were: the thickness of the lesion every third day; parasite load on the draining lymph node; production of IFN-γ, IL-10, and TGF-β in cell culture of the draining lymph node supernatant, stimulated in vitro with promastigotes of L. braziliensis; relative liver and spleen weight and histopathological analysis of the lesions. Animals that were treated with the association of fluconazole and ConBr, when compared with those treated with saline solution, presented a significant reduction on the parasite load on the draining lymph nodes (p=0,006), reduction in lesion size (p=0,03) and higher production of IFN-γ on the supernatant of cell culture of regional lymph nodes (p=0,03). Similar data were observed on the group treated with Glucantime®, and all together, demonstrate that the association of fluconazole and ConBr was capable of inducing a therapeutic response similar to the one seen in the group treated with Glucantime®, which is considered the gold standard in the treatment for leishmaniasis. / As leishmanioses constituem grande problema de saúde pública, compreendendo um amplo espectro de síndromes clínicas que pode ter manifestações diversas. Proteção e cura do hospedeiro se correlacionam com o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1, e IFN-γ é considerada uma molécula chave nesta resposta protetora. A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses é o antimonial pentavalente, que possui vários efeitos colaterais, especialmente seu efeito cardiotóxico. Na busca de novas alternativas de tratamento, o fluconazol vem apresentando dados promissores, porém necessita de um maior tempo de tratamento ou de doses mais elevadas para apresentar uma melhor resposta. A lectina de Canavalia brasilienses (ConBr) tem sido descrita como potente imunomodulador, pois induz proliferação linfocitária com produção de IFN-γ. Com base nesses dados, buscou-se avaliar se ConBr potencializaria o efeito do Fluconazol no tratamento da leishmaniose cutânea experimental por Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isso, camundongos BALB/c (n=40) foram infectados com L. braziliensis e divididos aleatoriamente, após 10 dias de infecção, em cinco grupos, com os seguintes tratamentos: 1- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral); 2- Glucantime® (60mg/Kg/dia/10dias, por via intramuscular); 3- ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, por via intramuscular); 4- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral) associado com ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, intramuscular); 5- solução salina por via oral. Os parâmetros avaliados no 20o dia pós-infecção foram: a espessura das lesões a cada três dias; a carga parasitária no linfonodo de drenagem; secreção de IFN-γ, IL-10, TGF-β no sobrenadante de culturas de células do linfonodo de drenagem reestimulados in vitro com promastigotas de L. braziliensis; peso relativo do fígado e do baço e análise histopatológica das lesões. Os animais que foram tratados com a associação Fluconazol-ConBr, quando comparados com o grupo tratado com salina, apresentaram uma redução significativa da carga parasitária do linfonodo de drenagem (p=0,006), redução no tamanho da lesão (p=0,03) e maior síntese de IFN-γ no sobrenadante das culturas de células do linfonodo regional (p=0,03). Dados semelhantes foram observados no grupo tratado com Glucantime®, o que em conjunto, demonstra que a associação Fluconazol-ConBr foi capaz de induzir uma resposta terapêutica semelhante ao tratamento com Glucantime®, considerado padrão ouro.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Resumo não disponível.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.