Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-06T15:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Candidemia is an infection recognized as public health problem related to health assistance. Filling the knowledge gaps through epidemiological studies and diagnostic tools to respond emerging threats that may be involved in the disease process is among the actions to eliminate these infections. The objective of this research was to study the Candida yeasts isolated from blood cultures of patients admitted in 11 hospitals of Manaus in 2013, as well to study the clinical epidemiological aspects of candidemia, the antifungal profile of susceptibility and virulence factors. The detection of yeasts in the collected samples was performed by conventional methodology. The antifungal susceptibility was determined using E-Test® strips. The studied virulence factors were proteinase, phospholipase, hemolysin and biofilm formation. During the study period, there were 85 cases of infection in the blood of 81 patients with Candida spp. In relation to gender, 67.9% were male, the median age of adult patients was 53 years and between pediatric patients was 60 days. The main risk conditions were: previous use of antibiotics (98.6%), presence of central venous catheter (95.9%), ICU (84.9%), use of protectors of gastric mucosa (84.4 %) and one-third of patients are from natal care and 72.8% of patients had up to 1 year old. According to the clinical course of patients, 40.7% died. C. albicans was the most frequently isolated species (34.57%), followed by C. tropicalis (32.1%) and Candida parapsilosis (17.28%). A susceptibility test was performed against Caspofungin, Micafungin, and Voriconazole, where the resistance 12.1%, 4.3% and 4.3% was respectively found. The virulence factors related to production of enzymes was: Proteinase with 56.4% of the isolates being producers, Phospholipase 36.2% and 78.7% hemolysin with this capability being more expressive in the species C. albicans. The biofilm formation was present in 34% of the isolates whose C. tropicalis was the most significant in this factor. The importance of epidemiology studies and local phenotypic studies may contribute to improve decision-making process and propose more effective measures for control and prevention of these infections. / As Candidemias são Infecções Relacionadas à Assistência a Saúde que são reconhecidamente um problema de saúde pública, e dentre as várias ações como medidas de eliminação destas infecções, estão o preenchimento das lacunas de conhecimento para responder as ameaças emergentes, isto se dá por estudos epidemiológicos, de diagnóstico e dos fatores que podem estar envolvidos no processo de adoecimento. O objetivo deste trabalho foi estudar as leveduras do gênero Candida isoladas a partir de hemoculturas de pacientes internados em 11 Hospitais de Manaus no ano de 2013, bem como estudar os aspectos clínicos epidemiológicos das candidemias, o perfil de susceptibilidade antifúngica e fatores de virulência. A detecção das leveduras presentes nas amostras coletadas foi realizada por meio de metodologia convencional. A susceptibilidade antifúngica foi determinada utilizando fitas de Etest® seguindo as recomendações do fabricante. Os fatores de virulência estudados foram: proteinase, fosfolipase, hemolisinas e formação de biofilme. No período de estudo, foram registrados 85 casos de infecção na corrente sanguínea de 81 pacientes por Candida spp. Em relação ao gênero 67,9% eram do sexo masculino, a mediana das idades entre os pacientes adultos foi de 53 anos e entre os pediátricos de 60 dias. As principais condições de risco foram: o uso prévio de antibióticos (98,6%), presença de cateter venoso central (95,9%), internação em UTI/CTI (84,9%), uso de gastroprotetores (84,4%) e um terço dos pacientes são procedentes de maternidades, e 72,8% dos pacientes tinham até 1 ano de idade. Segundo a evolução clínica dos pacientes, 40,7% foram a óbito. C. albicans foi a espécie isolada com mais frequência (34,57%), seguido de C. tropicalis (32,1%), C. parapsilosis (17,28%). Foi realizado teste de susceptibilidade frente a Caspofungina, Micafungina e Voriconazol, onde a resistência encontrada foi de 12,1%, 4,3% e 4,3% respectivamente. Os fatores de virulência relacionados à produção de enzimas foram: Proteinase com 56,4% dos isolados sendo produtores, Fosfolipase 36,2% e Hemolisina 78,7 com esta capacidade; sendo mais expressiva nas espécies de C. albicans. A formação de biofilme estava presente em 34% dos isolados, sendo a C. tropicalis a mais expressiva neste fator. A importância de estudos de epidemiologia e estudos fenotípicos locais podem contribuir para a melhoria da tomada de decisão e propor medidas mais efetivas de controle e prevenção destas infecções.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O monitoramento da sensibilidade antifÃngica em espÃcies de Candida de origem veterinÃria à uma prÃtica recente e os mecanismos envolvidos ainda nÃo foram completamente elucidados. Considerando que o arsenal de drogas antifÃngicas à limitado e que o fenÃmeno de resistÃncia tem se tornado mais freqÃente, a compreensÃo deste fenÃmeno e a busca por alternativas terapÃuticas se fazem necessÃrias. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo monitorar a sensibilidade in vitro de Candida spp. oriundas de animais, com Ãnfase na resistÃncia aos azÃlicos mediada por bombas de efluxo e na avaliaÃÃo da atividade do imidazÃlico levamisol sobre o crescimento destas leveduras. Para tanto, em um primeiro momento, foram avaliados 126 isolados de Candida, sendo 19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis, dos quais 22 foram isolados de rapinantes, 32 de periquitos do sertÃo, 56 de papagaios, 7 de araras canindà e 3 de um ouriÃo-cacheiro. Todas as cepas foram submetidas ao teste de microdiluiÃÃo em caldo, ante a anfotericina B, itraconazol, fluconazol, segundo metodologia padronizada pelo Clinical Laboratory Standards Institute (documento M27-A3). As concentraÃÃes inibitÃrias mÃnimas (CIMs) variaram de 0,03125 a 2 Âg/mL, 0,125 a 250 Âg/mL e de 0,03125 a 125 Âg/mL para anfotericina B, fluconazol e itraconazol, respectivamente. Dos 126 isolados avaliados por microdiluiÃÃo, 33 (26,2%) foram resistentes aos azÃlicos, sendo 7 (5,6%) resistentes somente a fluconazol, 1 (0.8%) resistente somente ao itraconazol e 24 (19%) resistentes a ambas as drogas. Em um segundo momento, todas estas cepas resistentes aos derivados azÃlicos, mais 20 C. albicans e 3 C. tropicalis resgatadas da nossa coleÃÃo de leveduras resistentes de origem veterinÃria, foram submetidas ao teste de inibiÃÃo de bomba de efluxo com prometazina, perfazendo um total de 56 cepas resistentes a azÃlicos. Dessa forma, as CIMs de fluconazol e itraconazol sofreram reduÃÃes significativas de 2 a 250 e de 16 a 4000 vezes, respectivamente. Investigou-se, ainda, a atividade antifÃngica do levamisol contra 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis e 12 C. tropicalis, sendo obtidas CIMs e concentraÃÃes fungicidas mÃnimas que variaram de 0,58 a 2,34 mg/mL e de 2,34 a 9,37 mg/mL, respectivamente. Paralelamente, foi demonstrado que o levamisol inibe a formaÃÃo do biofilme de C. albicans e C. tropicalis, bem como interfere na manutenÃÃo do biofilme maduro. Os dados apontam que a resistÃncia aos derivados azÃlicos Ã, pelo menos em parte, mediada por bombas de efluxo, bem como demonstram o potencial antifÃngico do imidazÃlico levamisol e sua capacidade de inibir o biofilme de cepas de Candida spp. oriundas de animais. / Monitoring of the antifungal susceptibility of Candida species from veterinary sources is a recent practice and the mechanisms involved in antifungal resistance have not been completely elucidated. Considering that the antifungal arsenal is limited and that antifungal resistance has become more frequent, the comprehension of this phenomenon and the pursuit for therapeutic alternatives are necessary. Thus, the present work aimed at monitoring the in vitro susceptibility of Candida spp. isolated from animals, with emphasis on efflux pump-mediated azole resistance and on the evaluation of the effect of the imidazole levamisole on the growth of these yeasts. For such, in a first approach, 126 Candida isolates (19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis), out of which 22 were recovered from raptors, 32 from cactus parakeets, 56 from Amazon parrots, 7 from blue-and-gold macaws and 3 from a Brazilian porcupine. All isolates were submitted to broth microdilution test against amphotericin B, itraconazole and fluconazole, according to the methodology recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute (document M27-A3). The MICs ranged from 0.03125 to 2 Âg/mL, 0.125 to 250 Âg/mL and 0.03125 to 125 Âg/mL for amphotericin B, fluconazole and itraconazole, respectively. Out of 126 evaluated isolates, 33 (26.2%) were resistant to azoles, with 7 (5.6%) isolates resistant to fluconazole, 1 (0.8%) isolate resistant to itraconazole and 24 (19%) resistant to both drugs. In a second approach, all these azole resistant isolates, plus 20 C. albicans and 3 C. tropicalis that were recovered from our collection of resistant yeasts from veterinary sources, were submitted to the efflux pump inhibition assay with promethazine, with a total of 56 azole resistant isolates. Thus, MICs for fluconazole and itraconazole significantly reduced from 2 to 250 times for fluconazole and from 16 to 4000 times for itraconazole. The antifungal activity of levamisole against 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis and 12 C. tropicalis, was also evaluated, and MICs and minimum fungicidal concentrations varying from 0.58 to 2.34 mg/mL and from 2.34 to 9.37 mg/mL were obtained, respectively. Parallelly, it was demonstrated that levamisole significantly inhibits biofilm formation and interferes with the maintenance of mature biofilms. These data show that azole resistance is partially mediated by efflux-pumps and demonstrate the antifungal potential of the imidazole levamisole and its capacity of inhibiting the biofilm of strains of Candida spp. from animals.

Orientador: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Mara Correa Lelles Nogueira / Resumo: As leveduras estão amplamente distribuídas em diversos ambientes, sendo também habitantes normais do corpo humano. São consideradas patógenos oportunistas causando infecções que variam desde superficiais até profundas e fatais. Espécies de Candida spp ocupam, atualmente, lugar de destaque como principais causadoras das infecções a corrente sanguínea. A investigação da suscetibilidade antimicrobiana, frente aos antifúngicos rotineiramente preconizados na terapêutica, é de fundamental importância, além disso, métodos moleculares como o RAPD (Polimorfismo do DNA aleatoriamente amplificado) e PFGE (Eletroforese em campo pulsátil) são conhecidos por ajudar na identificação das fontes de infecção e delineamento epidemiológico. O Laboratório de Microbiologia da FAMERP, em parceria com o Hospital de Base de São José do Rio Preto, vem desenvolvendo projetos de pesquisa que envolve o isolamento, a identificação e manutenção de coleção de culturas de espécies microbianas. O presente projeto teve como objetivo identificar as espécies leveduriformes presentes em isolados clínicos e ambientais, avaliar a sua suscetibilidade antimicrobiana, além de estudar a relação genética entre tais isolados por ambas técnicas - RAPD e PFGE, na tentativa de elucidar as possíveis fontes de aquisição, prática considerada fundamental na rede de vigilância. No período de agosto de 2007 a outubro de 2009, foram analisados 119 episódios de candidemia. A distribuição dos casos de candidemia foi mais frequente em pacientes com idade inferior a 1 ano e superior a 60 anos, não havendo tendência para nenhum gênero. O grupo geral manteve como período de internação uma média de 35 dias, com frequência de óbito correspondente a 61%. C. albicans foi a espécie mais prevalente (29%), seguida por C. parapsilosis (28%) e C. tropicalis (23%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: As leveduras estão amplamente distribuídas em diversos ambientes, sendo também habitantes normais do corpo humano. São consideradas patógenos oportunistas causando infecções que variam desde superficiais até profundas e fatais. Espécies de Candida spp ocupam, atualmente, lugar de destaque como principais causadoras das infecções a corrente sanguínea. A investigação da suscetibilidade antimicrobiana, frente aos antifúngicos rotineiramente preconizados na terapêutica, é de fundamental importância, além disso, métodos moleculares como o RAPD (Polimorfismo do DNA aleatoriamente amplificado) e PFGE (Eletroforese em campo pulsátil) são conhecidos por ajudar na identificação das fontes de infecção e delineamento epidemiológico. O Laboratório de Microbiologia da FAMERP, em parceria com o Hospital de Base de São José do Rio Preto, vem desenvolvendo projetos de pesquisa que envolve o isolamento, a identificação e manutenção de coleção de culturas de espécies microbianas. O presente projeto teve como objetivo identificar as espécies leveduriformes presentes em isolados clínicos e ambientais, avaliar a sua suscetibilidade antimicrobiana, além de estudar a relação genética entre tais isolados por ambas técnicas - RAPD e PFGE, na tentativa de elucidar as possíveis fontes de aquisição, prática considerada fundamental na rede de vigilância. No período de agosto de 2007 a outubro de 2009, foram analisados 119 episódios de candidemia. A distribuição dos casos de candidemia foi mais frequente em pacientes com idade inferior a 1 ano e superior a 60 anos, não havendo tendência para nenhum gênero. O grupo geral manteve como período de internação uma média de 35 dias, com frequência de óbito correspondente a 61%. C. albicans foi a espécie mais prevalente (29%), seguida por C. parapsilosis (28%) e C. tropicalis (23%)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-04T15:47:31Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Carneiro Naziasene Lima - 2014.pdf: 3242345 bytes, checksum: d0ace95b026350f2bf41251459258252 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-05T10:40:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Carneiro Naziasene Lima - 2014.pdf: 3242345 bytes, checksum: d0ace95b026350f2bf41251459258252 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T10:40:24Z (GMT). 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The genetic material was extracted by phenolchloroform extraction of the sample C. tropicalis, ATCC 28367 (C. albicans) and ATCC 22019 (C. parapsilosis) for use in a species-specific multiplex qPCR assay with analysis of differences in the curve fusion. Microdilution plate test and reduction of the tetrazolium salt for 21 isolates were performed for the susceptibility of sessile and free cells, respectively. The evaluation of the ultrastructure of the biofilm was performed on strips of polyurethane with visualization by scanning electron microscopy. The amplified products from C. albicans obtained three melting peaks with values of 75,2 °C, 76,8 °C and 79,8 °C, while C. tropicalis and C. parapsilosis showed one peak with values 73,5 °C and 78,5 °C, respectively. The identification test showed to be reliable for the identification of the most common species in the study. All of Candida yeasts were able to form biofilm with own organization of each specie. The in vitro susceptibility test of planktonic cells demonstrated that amphotericin B and caspofungin showed better activity compared to fluconazole and voriconazole who obtained 19% of resistant strains, all C. albicans. In assessing of the CIMs50% and CIMs80% of sessile cells, we observed an increase of at least 60 times the values of planktonic cells. It was observed a high percentage of BF that demonstrates the need for diagnosis and combat against this biomass formed by Candida species. The BF is a virulence factor determinant for decrease of susceptibility to antifungal agents thus compromising antifungal therapy. / O aumento no número de infecções fúngicas por espécies de Candida, como resultado do expressivo aumento de pacientes imunocomprometidos destaca a importância de estudos relacionados a esse gênero. A resistência destas leveduras aos fármacos antifúngicos é observada em isolados específicos, assim como em infecções associadas com a formação de biofilme (FB). O objetivo deste estudo foi comparar o perfil de suscetibilidade in vitro de células sésseis e planctônicas de diferentes isolados de Candida, diferenciando as espécies por qPCR multiplex e microscopia eletrônica de varredura. A amostra foi composta de 10 C. albicans, 10 C. parapsilosis e 1 C. tropicalis. O material genético foi extraído pelo método de extração fenol-clorofórmio da amostra de C. tropicalis, ATCC 28367 (C. albicans) e ATCC 22019 (C. parapsilosis) para utilização no ensaio espécie-específico qPCR multiplex com avaliação das diferenças na curva de fusão. Foram realizados teste de microdiluição em placa e redução do sal tetrazólio para 21 isolados a fim de determinar a suscetibilidade de células livres e sésseis, respectivamente. A avaliação da ultraestrutura do biofilme foi realizada em tiras de poliuretano com visualização por microscopia eletrônica de varredura. Os produtos amplificados de C. albicans, obtiveram três picos de fusão com valores de 75,2°C, 76,8°C e 79,8°C, enquanto C. parapsilosis e C. tropicalis mostraram um pico de valores 73,5°C e 78,5°C, respectivamente. O teste de identificação apresentou-se confiável para a identificação das espécies mais comuns no estudo. Todas as leveduras de Candida foram capazes de formar biofilme com organização própria de cada espécie. O teste de suscetibilidade in vitro das células planctônicas demonstrou que anfotericina B e caspofungina apresentaram melhor atividade em comparação com o fluconazol e voriconazol que obtiveram 19% das amostras resistentes, sendo todas C. albicans. Na avaliação da CIMs50% e CIMs80% das células sésseis, observou-se um aumento de pelo menos 60 vezes dos valores das células planctônicas. Foi observada porcentagem elevada de FB que demonstra a necessidade do diagnóstico e combate à essa biomassa formada pelas espécies de Candida, pois é um fator de virulência determinante para a diminuição da suscetibilidade aos antifúngicos comprometendo assim a terapêutica antifúngica.

Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um modelo PK/PD capaz de descrever o efeito fungistático de fluconazol (FCZ) contra diferentes espécies de Candida. Método: a fim de atingir esse objetivo, as seguintes etapas foram realizadas: i) métodos bioanalíticos foram desenvolvidos e validados em CL-EM/EM e CLAE/UV para a determinação do FCZ em plasma e microdialisado renal de rato, respectivamente; ii) a verificação das condições da microdiálise do FCZ e sua recuperação in vitro pelos métodos da diálise (RRD) e retrodiálise (RRE) e in vivo por RRE; iii) avaliação das concentrações livres de FCZ no rim de ratos Wistar saudáveis e infectados por Candida albicans através do uso da microdiálise após a administração de 10 mg/kg de FCZ pela via intravenosa e de 50 mg/kg de FCZ pela via oral, a fim de estabelecer a relação entre os níveis livres renais e plasmáticos totais do FCZ em ambas as condições, iv) a modelagem PK/PD do efeito fungistático do FCZ contra Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis empregando o modelo de Emax-modificado e a determinação de seus parâmetros PK/PD utilizando um modelo de infecção in vitro, em que as concentrações renais livres de FCZ esperadas em seres humanos após diferentes posologias foram simuladas: a) concentrações flutuantes do fármaco - 200, 400 e 800 mg q8h, q12h e q24h - e concentrações constantes, múltiplas da concentração inibitória mínima (CIM) – 0,5, 1, 2, 4 e 8 vezes a CIM. Os dados de farmacocinética e farmacodinâmica foram modelados com o auxílio do software Scientist®. Resultados e Conclusões: i) os métodos analíticos para quantificação do FCZ foram desenvolvidos e validados, sendo específicos, exatos e precisos, com limites de quantificação de 100 ng/mL e 10 ng/mL para detecção em plasma e microdialisado, respectivamente, ii) as recuperações determinadas in vitro por RRD e RRE foram independentes do fluxo e da concentração. Os valores de recuperação das sondas de microdiálise determinada in vitro por RRD (53,4 ± 2,3%) e RRE (54,2 ± 1,8%) e in vivo por RRE (49,7 ± 2,2%) foram estatisticamente semelhantes nas condições experimentais investigadas (α = 0,05), indicando que o FCZ é um fármaco adequado para ser avaliado por esta abordagem; iii) não houve diferença estatística na área sob a curva de concentração versus tempo (AUC 0-∞) renal livre e plasmática total em ratos Wistar, saudáveis ou infectados por Candida albicans, pela mesma via de administração investigada. A penetração renal do FCZ foi semelhante para ambas as doses nas condições investigadas (variando entre 0,77 e 0,84) e a sua fração plasmática livre, determinada por microdiálise, foi independente da concentração (86,0 ± 2,0%). Utilizando as equações farmacocinéticas apropriadas, os parâmetros plasmáticos farmacocinéticos determinados foram capazes de prever os valores de concentrações livres renais em ratos sadios e infectados, assumindo que a ligação a proteínas plasmáticas é conhecida. Além disso, a candidíase sistêmica não interfere na penetração renal do FCZ, indicando que as suas concentrações plasmáticas livres são boas preditoras do valor de concentração tecidual livre (farmacologicamente ativa) em animais sadios e infectados, podendo ser utilizada para estabelecer e otimizar os regimes posológicos do FCZ para o tratamento de candidíase disseminada; iv) a concentração que causa 50% do efeito fungistático máximo (CE50) do FCZ foi estatisticamente menor para C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) do que para C. parapsilosis e C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL e 8.3 ± 1.8 μg/mL respectivamente, ao simular-se diferentes regimes de dose, bem como concentrações constantes do fármaco (CE50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; CE50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; CE50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). A taxa de morte fúngica (kmax) foi estatisticamente semelhante para todas as espécies de Candida estudadas. (aproximadamente 0,4 h-1) e sempre estatisticamente menor do que a taxa de crescimento fúngico, k0 (aproximadamente de 2 h-1) (α = 0,05). O modelo PK/PD foi capaz de descrever o efeito fungistático do FCZ contra as três espécies de Candida investigadas in vitro. O FCZ se mostrou igualmente eficaz contra essas leveduras, porém sua potência foi maior frente a C.albicans do que frente a C. parapsilosis e C. tropicalis. O modelo PK/PD utilizado pode ser empregado para simular esquemas posológicos alternativos, para comparar o efeito farmacológico do FCZ com o efeito de outros antifúngicos e, finalmente, para otimizar a terapia deste fármaco para o tratamento de candidíase sistêmica. / Objective: The aim of this work was the development of a pharmacodynamic/pharmacokinetic (PK/PD) model able to describe the fungistatic effect of fluconazole (FCZ) against Candida spp. Method: in order to reach this objective, the following steps were realized: i) bioanalytical methods were developed and validated in LC-MS/MS and HPLC/UV for determination FCZ in rat plasma and kidney microdialisate, respectively; ii) analysis of microdialysis of FCZ conditions and its recovery in vitro by dialysis (RRD) and retrodialysis (RRE) methods and in vivo by RRE; iii) evaluation of free levels of FCZ in the kidney of healthy and Candida albicans infected Wistar rats using microdialysis, after a 10 mg/kg i.v. dosing and 50 mg/kg oral dosing in order to establish the relationship between free renal and total plasma levels in both conditions; iv) the fungistatic pharmacological effect of FCZ against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida tropicalis ATCC strains by pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling of the time–kill curves employing an Emax model was determined using an in vitro infection model, where the free kidney concentrations of FCZ in humans after different posologies were simulated: a) fluctuating drug concentrations - 200, 400 and 800 mg q8h, q12h e q24h – and constant concentrations, multiples of the minimum inhibitory concentrations (MIC) – 0,5, 1, 2, 4 and 8 times the MIC. The pharmacokinetic and pharmacodynamic data were modeled with the software Sientist®. Results and Conclusions: i) the analytical methods developed were specific, precise, and accurate with limits of quantification of 100 ng/mL and 10 ng/mL for microdialisate and plasma, respectively; ii) the recoveries determined by RRD and RRE in vitro were concentration independent and flow rate dependent on the ranges investigated. The recoveries determined in vitro by RRD (53.4 ± 2.3%) and RRE (54.2 ± 1.8%) and in vivo by RRE (52.3 ± 2.3%) were statistically similar under the experimental conditions investigated (α = 0.05), indicating that FCZ is a suitable drug to be evaluated by microdialysis; iii) There were no statistical differences between the area under the free concentration-time curve (AUC 0–∞) in plasma and in tissue for either healthy or infected groups for the same dose regimen investigated. The antifungal tissue penetration was similar for both doses and all conditions investigated (ranging from 0.77 to 0.84). Unbound FCZ plasma fraction, determined by microdialysis, was concentration-independent (86.0 ± 2.0%). Using appropriate equations, pharmacokinetic (PK) parameters determined by fitting plasma concentration-time profiles were able to predict free renal levels.The results showed FCZ easily penetrates the kidney and PK parameters determined in plasma can be used to predict free tissue levels of the drug assuming the drug protein binding is known. Furthermore, systemic candidiasis does not interfere with the drug kidney penetration, indicating that free plasma concentrations are a good surrogate for active levels in both healthy and infected kidney and can be used to establish and optimize FCZ dosing regimens to treat disseminated candidiasis; iv) FCZ concentration necessary to produce 50% of the maximal fungistati effect (EC50) was statiscally smaller against C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) than against C. parapsilosis and C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL and 8.3 ± 1.8 μg/mL respectively, when simulating multiple dosing regimens as well as constant concentrations (EC50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; EC50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; EC50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). The maximum killing rate constant (kmax) was statistically similar for the Candida spp. (approximately 0.4 h-1) and always statistically smaller than the natural grown rate k0 (approximately 2 h-1) (α = 0.05). The PK/PD model was able to describe the fungistatic effect of fluconazole in vitro against the three Candida spp investigated. Fluconazole showed equivalent efficacy against these yeasts and higher potency against C. albicans than against C. parapsilosis and C. tropicalis. The model can be used to simulate alternative regimens, to compare its pharmacological effect with other antifungals and to optimize FCZ therapy to treat systemic candidiasis.

Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um modelo PK/PD capaz de descrever o efeito fungistático de fluconazol (FCZ) contra diferentes espécies de Candida. Método: a fim de atingir esse objetivo, as seguintes etapas foram realizadas: i) métodos bioanalíticos foram desenvolvidos e validados em CL-EM/EM e CLAE/UV para a determinação do FCZ em plasma e microdialisado renal de rato, respectivamente; ii) a verificação das condições da microdiálise do FCZ e sua recuperação in vitro pelos métodos da diálise (RRD) e retrodiálise (RRE) e in vivo por RRE; iii) avaliação das concentrações livres de FCZ no rim de ratos Wistar saudáveis e infectados por Candida albicans através do uso da microdiálise após a administração de 10 mg/kg de FCZ pela via intravenosa e de 50 mg/kg de FCZ pela via oral, a fim de estabelecer a relação entre os níveis livres renais e plasmáticos totais do FCZ em ambas as condições, iv) a modelagem PK/PD do efeito fungistático do FCZ contra Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis empregando o modelo de Emax-modificado e a determinação de seus parâmetros PK/PD utilizando um modelo de infecção in vitro, em que as concentrações renais livres de FCZ esperadas em seres humanos após diferentes posologias foram simuladas: a) concentrações flutuantes do fármaco - 200, 400 e 800 mg q8h, q12h e q24h - e concentrações constantes, múltiplas da concentração inibitória mínima (CIM) – 0,5, 1, 2, 4 e 8 vezes a CIM. Os dados de farmacocinética e farmacodinâmica foram modelados com o auxílio do software Scientist®. Resultados e Conclusões: i) os métodos analíticos para quantificação do FCZ foram desenvolvidos e validados, sendo específicos, exatos e precisos, com limites de quantificação de 100 ng/mL e 10 ng/mL para detecção em plasma e microdialisado, respectivamente, ii) as recuperações determinadas in vitro por RRD e RRE foram independentes do fluxo e da concentração. Os valores de recuperação das sondas de microdiálise determinada in vitro por RRD (53,4 ± 2,3%) e RRE (54,2 ± 1,8%) e in vivo por RRE (49,7 ± 2,2%) foram estatisticamente semelhantes nas condições experimentais investigadas (α = 0,05), indicando que o FCZ é um fármaco adequado para ser avaliado por esta abordagem; iii) não houve diferença estatística na área sob a curva de concentração versus tempo (AUC 0-∞) renal livre e plasmática total em ratos Wistar, saudáveis ou infectados por Candida albicans, pela mesma via de administração investigada. A penetração renal do FCZ foi semelhante para ambas as doses nas condições investigadas (variando entre 0,77 e 0,84) e a sua fração plasmática livre, determinada por microdiálise, foi independente da concentração (86,0 ± 2,0%). Utilizando as equações farmacocinéticas apropriadas, os parâmetros plasmáticos farmacocinéticos determinados foram capazes de prever os valores de concentrações livres renais em ratos sadios e infectados, assumindo que a ligação a proteínas plasmáticas é conhecida. Além disso, a candidíase sistêmica não interfere na penetração renal do FCZ, indicando que as suas concentrações plasmáticas livres são boas preditoras do valor de concentração tecidual livre (farmacologicamente ativa) em animais sadios e infectados, podendo ser utilizada para estabelecer e otimizar os regimes posológicos do FCZ para o tratamento de candidíase disseminada; iv) a concentração que causa 50% do efeito fungistático máximo (CE50) do FCZ foi estatisticamente menor para C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) do que para C. parapsilosis e C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL e 8.3 ± 1.8 μg/mL respectivamente, ao simular-se diferentes regimes de dose, bem como concentrações constantes do fármaco (CE50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; CE50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; CE50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). A taxa de morte fúngica (kmax) foi estatisticamente semelhante para todas as espécies de Candida estudadas. (aproximadamente 0,4 h-1) e sempre estatisticamente menor do que a taxa de crescimento fúngico, k0 (aproximadamente de 2 h-1) (α = 0,05). O modelo PK/PD foi capaz de descrever o efeito fungistático do FCZ contra as três espécies de Candida investigadas in vitro. O FCZ se mostrou igualmente eficaz contra essas leveduras, porém sua potência foi maior frente a C.albicans do que frente a C. parapsilosis e C. tropicalis. O modelo PK/PD utilizado pode ser empregado para simular esquemas posológicos alternativos, para comparar o efeito farmacológico do FCZ com o efeito de outros antifúngicos e, finalmente, para otimizar a terapia deste fármaco para o tratamento de candidíase sistêmica. / Objective: The aim of this work was the development of a pharmacodynamic/pharmacokinetic (PK/PD) model able to describe the fungistatic effect of fluconazole (FCZ) against Candida spp. Method: in order to reach this objective, the following steps were realized: i) bioanalytical methods were developed and validated in LC-MS/MS and HPLC/UV for determination FCZ in rat plasma and kidney microdialisate, respectively; ii) analysis of microdialysis of FCZ conditions and its recovery in vitro by dialysis (RRD) and retrodialysis (RRE) methods and in vivo by RRE; iii) evaluation of free levels of FCZ in the kidney of healthy and Candida albicans infected Wistar rats using microdialysis, after a 10 mg/kg i.v. dosing and 50 mg/kg oral dosing in order to establish the relationship between free renal and total plasma levels in both conditions; iv) the fungistatic pharmacological effect of FCZ against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida tropicalis ATCC strains by pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling of the time–kill curves employing an Emax model was determined using an in vitro infection model, where the free kidney concentrations of FCZ in humans after different posologies were simulated: a) fluctuating drug concentrations - 200, 400 and 800 mg q8h, q12h e q24h – and constant concentrations, multiples of the minimum inhibitory concentrations (MIC) – 0,5, 1, 2, 4 and 8 times the MIC. The pharmacokinetic and pharmacodynamic data were modeled with the software Sientist®. Results and Conclusions: i) the analytical methods developed were specific, precise, and accurate with limits of quantification of 100 ng/mL and 10 ng/mL for microdialisate and plasma, respectively; ii) the recoveries determined by RRD and RRE in vitro were concentration independent and flow rate dependent on the ranges investigated. The recoveries determined in vitro by RRD (53.4 ± 2.3%) and RRE (54.2 ± 1.8%) and in vivo by RRE (52.3 ± 2.3%) were statistically similar under the experimental conditions investigated (α = 0.05), indicating that FCZ is a suitable drug to be evaluated by microdialysis; iii) There were no statistical differences between the area under the free concentration-time curve (AUC 0–∞) in plasma and in tissue for either healthy or infected groups for the same dose regimen investigated. The antifungal tissue penetration was similar for both doses and all conditions investigated (ranging from 0.77 to 0.84). Unbound FCZ plasma fraction, determined by microdialysis, was concentration-independent (86.0 ± 2.0%). Using appropriate equations, pharmacokinetic (PK) parameters determined by fitting plasma concentration-time profiles were able to predict free renal levels.The results showed FCZ easily penetrates the kidney and PK parameters determined in plasma can be used to predict free tissue levels of the drug assuming the drug protein binding is known. Furthermore, systemic candidiasis does not interfere with the drug kidney penetration, indicating that free plasma concentrations are a good surrogate for active levels in both healthy and infected kidney and can be used to establish and optimize FCZ dosing regimens to treat disseminated candidiasis; iv) FCZ concentration necessary to produce 50% of the maximal fungistati effect (EC50) was statiscally smaller against C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) than against C. parapsilosis and C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL and 8.3 ± 1.8 μg/mL respectively, when simulating multiple dosing regimens as well as constant concentrations (EC50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; EC50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; EC50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). The maximum killing rate constant (kmax) was statistically similar for the Candida spp. (approximately 0.4 h-1) and always statistically smaller than the natural grown rate k0 (approximately 2 h-1) (α = 0.05). The PK/PD model was able to describe the fungistatic effect of fluconazole in vitro against the three Candida spp investigated. Fluconazole showed equivalent efficacy against these yeasts and higher potency against C. albicans than against C. parapsilosis and C. tropicalis. The model can be used to simulate alternative regimens, to compare its pharmacological effect with other antifungals and to optimize FCZ therapy to treat systemic candidiasis.

Orientador: Rosemeire Cristin Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Maria Cristina Teixeira Duarte / Banca: Márcia de Souza Carvalho Melhem / Banca: Raquel Regina Duarte Moreira / Banca: Tais Maria Bauab / Resumo: O gênero Candida é causa frequente de infecção da mucosa oral e vaginal, sendo motivo de preocupação na área de saúde devido à reincidência das infecções, crescimento de infecções sistêmicas, resistência de diversas cepas e toxicidade dos antifúngicos. Plantas medicinais são usadas popularmente no tratamento de candidíases e por este motivo, busca-se, além de avaliar a composição fitoquímica do óleo de Melaleuca alternifolia (Myrtaceae) e do extrato de Plinia cauliflora (Myrtaceae), verificar o mecanismo de ação destas amostras sobre diferentes espécies de Candida. A constituição do óleo essencial de M. alternifolia está descrita na literatura e por cromatografia gasosa identificou-se a presença de substâncias importantes da sua composição na amostra utilizada. Foi traçado o perfil cromatográfico do extrato das folhas e das frações de P. cauliflora para conhecer sua constituição. Foram isoladas duas miricetinas e duas quercetinas glicosiladas e o elagitanino casuarinina. Na avaliação da atividade anti-Candida, o óleo essencial apresentou-se fungicida, com concentração citotóxica de 50% na mesma faixa. Entre as amostras avaliadas de P. cauliflora, o extrato, a fração butanólica e a fração enriquecida com o derivado elágico apresentaram a melhor atividade, foram fungistáticas e a concentração citotóxica foi maior que a concentração ativa. O óleo essencial mostrou-se inibidor da formação de hifas, reduziu a quantidade de ergosterol, sem se ligar a este composto e promoveu alterações significativas principalmente na parede celular da forma filamentosa. Por outro lado, as frações mais ativas de P. cauliflora inibiram o desenvolvimento de hifas, mas estimularam a síntese de ergosterol e indicaram ter mais de um alvo de ação, ligando-se ao ergosterol e agindo externamente por modificação do arranjo da parede celular das espécies... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Candida genus is often the reason of oral and vaginal mucosal infections and it is cause of concern in the health area due to the relapsing of infections, rising in the number of systemic infections, resistance of several strains and high toxicity of synthetized antifungal agents. Medicinal plants have been used in the treatment of candidiasis, and this is the reason to evaluate the phytochemical composition of essential oil from Melaleuca alternifolia (Myrtaceae) and extract of Plinia cauliflora (Myrtaceae) in order to verify their mechanism of action against different species of Candida. The constitution of the essential oil is already described in the literature and it was possible to confirm the compounds by gas chromatography in the sample utilized. It was studied the fingerprint of the extract of P. cauliflora leaves and fraction applying chromatographic techniques. It was isolated two glucosilated myricetin and quercetin and the ellagitannin casuarinin. The essential oil showed fungicidal activity against Candida with 50% of cytotoxicity in the same concentration rate of the activity. Among samples of P. cauliflora, extract, butanolic fraction and the riched fraction with the ellagic acid derivate showed the better activity but it was fungistatic. The cytotoxic concentration was higher than the concentration of action. The essential oil showed to inhibit hyphae formation, to reduced the amount of ergosterol without binding to it and there were significative changes mainly in the hyphal cell wall. The more active fractions of P. cauliflora inhibited hiphae development, stimulated ergosterol synthesis and indicated to have more than just one target since they bound directly to ergosterol and showed to act externally by changing cell wall assemble without changes in the composition. Thus, the fungicidal activity of M. alternifolia essential oil is mainly due... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-25T22:57:38Z No. of bitstreams: 1 LuandaBarbaraFerreiraCanarioDeSouza_DISSERT.pdf: 2996890 bytes, checksum: 9a5f76941d2b2ee6ded886c004b1965d (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-04-27T23:22:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LuandaBarbaraFerreiraCanarioDeSouza_DISSERT.pdf: 2996890 bytes, checksum: 9a5f76941d2b2ee6ded886c004b1965d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T23:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuandaBarbaraFerreiraCanarioDeSouza_DISSERT.pdf: 2996890 bytes, checksum: 9a5f76941d2b2ee6ded886c004b1965d (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / A candid?ase ? uma importante manifesta??o oral em pacientes transplantados renais. Candida spp. possuem fatores de virul?ncia que contribuem para o processo infeccioso, incluindo a capacidade de aderir a c?lulas epiteliais e a forma??o de biofilme em superf?cies bi?ticas e abi?ticas. O extrato obtido a partir das folhas de Eugenia uniflora [acetona: ?gua (7:3, v/v)] tem demonstrado atividade antif?ngica contra Candida spp. Este estudo avaliou a influ?ncia do extrato de E. uniflora na ades?o ?s C?lulas Epiteliais Bucais Humanas (CEBH) e forma??o de biofilme de 42 cepas de Candida spp. isoladas da cavidade oral de pacientes transplantados renais. As cepas de Candida spp. pertencentes a um banco de microorganimos foram reativadas e reidentificadas fenotipicamente atrav?s da metodologia cl?ssica e por m?todos moleculares (genotipagem ABC e RAPD), quando necess?rio, para a conclus?o da identifica??o em n?vel de esp?cie. Para os ensaios de virul?ncia avaliados in vitro, as leveduras foram cultivadas na presen?a e aus?ncia de 1000 ?g/ mL de extrato. Uma propor??o de 10:1 c?lulas (c?lulas Candida spp. x CEBHs) foi incubada durante 1 hora a 37 ?C, 200 rpm, fixadas com formalina a 10% e o n?mero de c?lulas de Candida aderidas a 150 CEBH foram determinadas em microsc?pio ?ptico. Os biofilmes foram formados em microplacas de poliestireno na presen?a e aus?ncia do extrato. A quantifica??o foi realizada com colora??o por cristal violeta a 570 nm. Todos os isolados apresentaram-se vi?veis e na reidentifica??o fenot?pica apresentaram caracter?sticas sugestivas de cada esp?cie identificada. Duas cepas identificadas presuntivamente como Candida dubliniensis foram confirmadas como pertencentes a esta esp?cie atrav?s da genotipagem ABC, e as cepas identificadas como pertencentes ao complexo Candida parapsilosis foram diferenciadas atrav?s da genotipagem por RAPD. Candida albicans destacou-se como a esp?cie com maior potencial de ades?o ao epit?lio bucal, enquanto que C. tropicalis apresentou expressiva forma??o de biofilme. Detectamos que o extrato de E. uniflora foi capaz de reduzir a ades?o ao CEBH tanto para Candida albicans como para as esp?cies de Candida n?o-Candida albicans. Por outro lado, apenas 16 cepas de Candida spp. (36%) apresentaram a forma??o de biofilme reduzida na presen?a do extrato. No entanto, duas cepas de C. tropicalis altamente produtoras de biofilme tiveram uma redu??o expressiva na capacidade de forma??o de biofilme. Este estudo refor?a a ideia de que, al?m da inibi??o do crescimento, E. uniflora pode interferir com a express?o de alguns fatores de virul?ncia de Candida spp., e pode ser eventualmente aplicada no futuro como um poss?vel agente antif?ngico. / Candidiasis is a major oral manifestation in kidney transplant patients. Candida spp. possess essential virulence factors which contribute for the infectious process, including the ability to adhere to epithelial cells and biofilm formation. The extract obtained from the leaves of Eugenia uniflora [acetone: water (7:3, v/v)] has demonstrated antifungal activity against Candida spp. This study evaluated the influence of the extract of E. uniflora in adhesion to human buccal epithelial cells (HBEC) and biofilm formation of 42 strains of Candida spp. isolated from the oral cavity of kidney transplant patients. Candida spp. strains belonging to a culture collection were reactivated and phenotypically re-identified by classical and molecular methods (genotyping ABC and RAPD), when necessary, to complete the identification to the species level. For the virulence tests evaluated in vitro, yeasts were grown in the presence and absence of 1000 ?g/mL of the extract. A ratio of 10: 1 (Candida spp. cells x HBECs) was incubated for 1 hour at 37 ? C, 200 rpm, fixed with 10% formalin and the number of Candida cells adhered to 150 HBEC determined by optical microscope. Biofilms were formed on polystyrene microplates in the presence or absence of the extract. The quantification was performed with crystal violet staining at 570 nm. All isolates were viable and exhibited phenotypic characteristics suggestive of each species identified. Two strains presumptively identified as Candida dubliniensis belonged to this species as determined with genotyping ABC, while strains identified as belonging to the Candida parapsilosis species complex were differentiated by RAPD genotyping. Candida albicans was found to be the most adherent species to the buccal epithelia, while C. tropicalis showed remarkable biofilm formation.We could detect that the extract of E. uniflora was able to reduce adhesion to HBEC for both Candida albicans and non-Candida albicans Candida species. On the other hand, only 16 Candida spp. strains (36 %) showed reduced biofilm formation. However, two highly biofilm producer strains of C. tropicalis had an expressive reduction in biofilm formation. This study reinforces the idea that besides growth inhibition, E. uniflora may interfere with the expression of some virulence factors of Candida spp., and may be possibly applied in the future as a novel antifungal agent.

Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um modelo PK/PD capaz de descrever o efeito fungistático de fluconazol (FCZ) contra diferentes espécies de Candida. Método: a fim de atingir esse objetivo, as seguintes etapas foram realizadas: i) métodos bioanalíticos foram desenvolvidos e validados em CL-EM/EM e CLAE/UV para a determinação do FCZ em plasma e microdialisado renal de rato, respectivamente; ii) a verificação das condições da microdiálise do FCZ e sua recuperação in vitro pelos métodos da diálise (RRD) e retrodiálise (RRE) e in vivo por RRE; iii) avaliação das concentrações livres de FCZ no rim de ratos Wistar saudáveis e infectados por Candida albicans através do uso da microdiálise após a administração de 10 mg/kg de FCZ pela via intravenosa e de 50 mg/kg de FCZ pela via oral, a fim de estabelecer a relação entre os níveis livres renais e plasmáticos totais do FCZ em ambas as condições, iv) a modelagem PK/PD do efeito fungistático do FCZ contra Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis empregando o modelo de Emax-modificado e a determinação de seus parâmetros PK/PD utilizando um modelo de infecção in vitro, em que as concentrações renais livres de FCZ esperadas em seres humanos após diferentes posologias foram simuladas: a) concentrações flutuantes do fármaco - 200, 400 e 800 mg q8h, q12h e q24h - e concentrações constantes, múltiplas da concentração inibitória mínima (CIM) – 0,5, 1, 2, 4 e 8 vezes a CIM. Os dados de farmacocinética e farmacodinâmica foram modelados com o auxílio do software Scientist®. Resultados e Conclusões: i) os métodos analíticos para quantificação do FCZ foram desenvolvidos e validados, sendo específicos, exatos e precisos, com limites de quantificação de 100 ng/mL e 10 ng/mL para detecção em plasma e microdialisado, respectivamente, ii) as recuperações determinadas in vitro por RRD e RRE foram independentes do fluxo e da concentração. Os valores de recuperação das sondas de microdiálise determinada in vitro por RRD (53,4 ± 2,3%) e RRE (54,2 ± 1,8%) e in vivo por RRE (49,7 ± 2,2%) foram estatisticamente semelhantes nas condições experimentais investigadas (α = 0,05), indicando que o FCZ é um fármaco adequado para ser avaliado por esta abordagem; iii) não houve diferença estatística na área sob a curva de concentração versus tempo (AUC 0-∞) renal livre e plasmática total em ratos Wistar, saudáveis ou infectados por Candida albicans, pela mesma via de administração investigada. A penetração renal do FCZ foi semelhante para ambas as doses nas condições investigadas (variando entre 0,77 e 0,84) e a sua fração plasmática livre, determinada por microdiálise, foi independente da concentração (86,0 ± 2,0%). Utilizando as equações farmacocinéticas apropriadas, os parâmetros plasmáticos farmacocinéticos determinados foram capazes de prever os valores de concentrações livres renais em ratos sadios e infectados, assumindo que a ligação a proteínas plasmáticas é conhecida. Além disso, a candidíase sistêmica não interfere na penetração renal do FCZ, indicando que as suas concentrações plasmáticas livres são boas preditoras do valor de concentração tecidual livre (farmacologicamente ativa) em animais sadios e infectados, podendo ser utilizada para estabelecer e otimizar os regimes posológicos do FCZ para o tratamento de candidíase disseminada; iv) a concentração que causa 50% do efeito fungistático máximo (CE50) do FCZ foi estatisticamente menor para C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) do que para C. parapsilosis e C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL e 8.3 ± 1.8 μg/mL respectivamente, ao simular-se diferentes regimes de dose, bem como concentrações constantes do fármaco (CE50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; CE50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; CE50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). A taxa de morte fúngica (kmax) foi estatisticamente semelhante para todas as espécies de Candida estudadas. (aproximadamente 0,4 h-1) e sempre estatisticamente menor do que a taxa de crescimento fúngico, k0 (aproximadamente de 2 h-1) (α = 0,05). O modelo PK/PD foi capaz de descrever o efeito fungistático do FCZ contra as três espécies de Candida investigadas in vitro. O FCZ se mostrou igualmente eficaz contra essas leveduras, porém sua potência foi maior frente a C.albicans do que frente a C. parapsilosis e C. tropicalis. O modelo PK/PD utilizado pode ser empregado para simular esquemas posológicos alternativos, para comparar o efeito farmacológico do FCZ com o efeito de outros antifúngicos e, finalmente, para otimizar a terapia deste fármaco para o tratamento de candidíase sistêmica. / Objective: The aim of this work was the development of a pharmacodynamic/pharmacokinetic (PK/PD) model able to describe the fungistatic effect of fluconazole (FCZ) against Candida spp. Method: in order to reach this objective, the following steps were realized: i) bioanalytical methods were developed and validated in LC-MS/MS and HPLC/UV for determination FCZ in rat plasma and kidney microdialisate, respectively; ii) analysis of microdialysis of FCZ conditions and its recovery in vitro by dialysis (RRD) and retrodialysis (RRE) methods and in vivo by RRE; iii) evaluation of free levels of FCZ in the kidney of healthy and Candida albicans infected Wistar rats using microdialysis, after a 10 mg/kg i.v. dosing and 50 mg/kg oral dosing in order to establish the relationship between free renal and total plasma levels in both conditions; iv) the fungistatic pharmacological effect of FCZ against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida tropicalis ATCC strains by pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling of the time–kill curves employing an Emax model was determined using an in vitro infection model, where the free kidney concentrations of FCZ in humans after different posologies were simulated: a) fluctuating drug concentrations - 200, 400 and 800 mg q8h, q12h e q24h – and constant concentrations, multiples of the minimum inhibitory concentrations (MIC) – 0,5, 1, 2, 4 and 8 times the MIC. The pharmacokinetic and pharmacodynamic data were modeled with the software Sientist®. Results and Conclusions: i) the analytical methods developed were specific, precise, and accurate with limits of quantification of 100 ng/mL and 10 ng/mL for microdialisate and plasma, respectively; ii) the recoveries determined by RRD and RRE in vitro were concentration independent and flow rate dependent on the ranges investigated. The recoveries determined in vitro by RRD (53.4 ± 2.3%) and RRE (54.2 ± 1.8%) and in vivo by RRE (52.3 ± 2.3%) were statistically similar under the experimental conditions investigated (α = 0.05), indicating that FCZ is a suitable drug to be evaluated by microdialysis; iii) There were no statistical differences between the area under the free concentration-time curve (AUC 0–∞) in plasma and in tissue for either healthy or infected groups for the same dose regimen investigated. The antifungal tissue penetration was similar for both doses and all conditions investigated (ranging from 0.77 to 0.84). Unbound FCZ plasma fraction, determined by microdialysis, was concentration-independent (86.0 ± 2.0%). Using appropriate equations, pharmacokinetic (PK) parameters determined by fitting plasma concentration-time profiles were able to predict free renal levels.The results showed FCZ easily penetrates the kidney and PK parameters determined in plasma can be used to predict free tissue levels of the drug assuming the drug protein binding is known. Furthermore, systemic candidiasis does not interfere with the drug kidney penetration, indicating that free plasma concentrations are a good surrogate for active levels in both healthy and infected kidney and can be used to establish and optimize FCZ dosing regimens to treat disseminated candidiasis; iv) FCZ concentration necessary to produce 50% of the maximal fungistati effect (EC50) was statiscally smaller against C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) than against C. parapsilosis and C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL and 8.3 ± 1.8 μg/mL respectively, when simulating multiple dosing regimens as well as constant concentrations (EC50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; EC50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; EC50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). The maximum killing rate constant (kmax) was statistically similar for the Candida spp. (approximately 0.4 h-1) and always statistically smaller than the natural grown rate k0 (approximately 2 h-1) (α = 0.05). The PK/PD model was able to describe the fungistatic effect of fluconazole in vitro against the three Candida spp investigated. Fluconazole showed equivalent efficacy against these yeasts and higher potency against C. albicans than against C. parapsilosis and C. tropicalis. The model can be used to simulate alternative regimens, to compare its pharmacological effect with other antifungals and to optimize FCZ therapy to treat systemic candidiasis.