O consumo dos diferentes tipos de drogas está associado a problemas sociais, econômicos e de saúde pública, em todas as regiões no mundo. Dentre os problemas de saúde pública, podemos destacar a alta prevalência de comorbidade entre o uso de drogas e os transtornos mentais. A Cannabis, a cocaína e o crack são as drogas ilícitas mais consumidas no Brasil. A utilização do cabelo como matriz biológica para determinação destas drogas permite avaliar o uso crônicos pelos indivíduos, uma vez que o cabelo é uma matriz estável, de fácil manipulação e a janela de detecção depende apenas do comprimento do cabelo. Entretanto, a análise em cabelo ainda representa um desafio analítico. Foram desenvolvidos dois métodos para a detecção das diferentes drogas no cabelo, com diferentes enfoques analíticos. O primeiro método (desenvolvido durante o estágio de doutorado sanduíche na Itália) identificou e quantificou cocaína e metabólitos usando a técnica de column switching e detecção por LC-MS/MS. O segundo método foi desenvolvido para determinação de canabinóides nas amostras de cabelo utilizando GC-MS. O diferencial deste método foi a utilização de um novo dispositivo de extração em fase sólida (as ponteiras DPX) para concentração e purificação do extrato, utilizando menor quantidade de solventes. A determinação dos canabinóides e cocaínicos foi realizada nas amostras de cabelo da população atendida no CAPS - AD de Ribeirão Preto, São Paulo. Além da coleta da amostra de cabelo, o sujeito foi submetido a uma entrevista, onde os seguintes instrumentos de avaliação foram aplicadas: Questionário sobre a saúde do Paciente 9, Inventário de fobia social, Self Report Questionnaire, Questionário de Ansiedade de Beck, Inventário de Depressão de Beck e Questionário sobre o uso da Cannabis, bem como um questionário elaborado pelo pesquisador para coleta de dados sociodemográficos, consumo de substâncias e dados sobre a amostra de cabelo, como comprimento, cor, tintura ou coloração. As amostras de cabelo foram analisadas e a média das concentrações de cada droga encontrada no cabelo foi correlacionada com os indicadores clínicos de transtorno mentais, obtidos através dos instrumentos de avaliação psiquiátrica. A maior prevalência de indicadores clínicos positivos para transtornos psiquiátricos entre a população estudada foi de transtornos mentais comuns, entre eles a ansiedade e depressão. A comparação da média de concentração de Cannabis, cocaína e crack no cabelo com os indicadores clínicos positivos para os transtornos não apresentou resultados estatisticamente significantes. Entretanto, podemos inferir que os sujeitos que apresentaram maior concentração média de Cannabis e cocaína no cabelo possuíam mais indicadores clínicos positivos para sintomas mentais comuns e depressão maior enquanto que os sujeitos usuários de crack possuíam mais indicadores clínicos positivos para sintomas ansiedade. Apesar de algumas limitações, podemos concluir que o estudo possibilitou estimar a prevalência da morbidade entre abuso de drogas ilícitas e transtornos psiquiátricos na população atendida no Centro de Atenção Psicossocial Álcool e drogas de Ribeirão Preto. / Different kinds of drug use have been associated to social, economic and health public problems worldwide. Among the high prevalent public health problems is the comorbidity between drug abuse and psychiatric disorders. Cannabis, cocaine and crack are the most consumed illicit drugs in Brazil. Hair use as the biological matrix for the determination of these drugs allows to evaluate chronic use, once hair is a stable matrix, easy to manipulate and the window detection only depends on the size of the hair. However, hair analysis still represents an analytical challenge. It was developed two methods for the detection of the drugs in hair, with different analytical approach. The first method (developed during doctoral stage in Italy) had identified and quantified cocaine and metabolites using column switching technique and LCMS/ MS detection. The second method was developed for determination of cannabinoids in hair samples using GC-MS. Decontamination procedure was the same cited above. The differential of this method was the use of a new device in solid phase extraction (DPX tips) for the extracts concentration and purification, using less solvents volumes. Cannabinoids and cocaine analysis were performed in hair samples from people who were enrolled in the CAPS - AD of Ribeirão Preto, São Paulo. Besides hair collection, the individual was submitted to an interview, where it was applied the following evaluation scales: Patient health questionnaire - 9, Social phobia inventory, Self report questionnaire, Beck anxiety inventory, Beck depression inventory and Cannabis research questionnaire as well as a questionnaire made by the author to collect sociodemographic data, substance consume and hair data. Hair samples were analyzed and the concentrations were correlated with positive clinical factors of mental disorders obtained through evaluation scales. The highest prevalence of positive clinical indicators for psychiatric disorders among the population studied was of common mental disorders, including anxiety and depression. The comparison of the average concentration of Cannabis, cocaine and crack in the hair with the positive clinical indicators for the disorders did not show statistically significant results. However, we can infer that the subjects who had higher average concentration of Cannabis and cocaine in hair had showed positive indicators for common mental symptoms and major depression as well as the subjects who had higher average concentration of crack in hair had showed positive indicators for anxiety. Despite of some limitations, we can conclude that the study had allowed estimating the prevalence of morbidity among illicit drugs abuse and psychiatric disorders in the population enrolled in the psychosocial care center in Ribeirão Preto.

O preparo da amostra é uma das etapas mais importantes em toda a análise química. O isolamento e a concentração dos componentes da amostra são cruciais e busca-se sempre que essas etapas sejam as mais simples e consumam o mínimo possível de tempo e reagentes. Nos últimos anos, um tipo de material tem se mostrado bastante útil para análises químicas a partir de fluidos biológicos, os polímeros molecularmente impressos (MIPs). Os MIPs são sintetizados por reações de polimerização, na presença de uma molécula molde (template). A molécula molde se liga aos monômeros funcionais do polímero durante a reação de polimerização e permanece ligada à superfície das cadeias poliméricas quando a reação se completa. Terminada a polimerização, realiza-se a completa lavagem das moléculas molde, assim, restam na superfície polimérica cavidades tridimensionais complementares à molécula empregada como molde. Essas cavidades permitem a ligação reversível e preferencial da molécula molde ou outras com estrutura química semelhante. A Cannabis sativa é a droga ilícita mais consumida em todo o mundo e nos últimos anos muita atenção tem se voltado a seus efeitos toxicológicos no corpo humano e a aplicações medicinais. Nesta dissertação, foi sintetizado um MIP com a molécula molde catequina para a extração e posterior análise por LC-MS/MS dos canabinóides Δ9-tetrahidrocanabinol (THC), 11-hidroxi-Δ9-tetrahidrocannabinol (THC-OH) e 11-nor-Δ9-tetrahidrocannabinol-9-ácido carboxílico (THC-COOH) em amostras de urina. O MIP produzido foi empacotado em microdispositivo e empregado no preparo das amostras de urina por microextração por sorvente empacotado (MEPS). O método desenvolvido apresentou boa linearidade (valores de r de 0,977 para o THC e 0,994 para THC-OH e THC-COOH). Os limites de detecção e de quantificação foram respectivamente de 5 ng mL-1 e 20 ng mL-1, para os compostos THC e THC-OH, na faixa linear de 25 a 250 ng mL-1. Para o composto THC-COOH os limites de detecção e quantificação alcançados foram de 1 ng mL-1 e 5 ng mL-1, respectivamente, na faixa linear de 5 a 170 ng mL-1. O método apresentou valores razoáveis de precisão entre 3,2% (THC-COOH) e 25,1% (THC) e de exatidão, que variou entre -18,4 e 17,4 (ambos para o THC). O MIP empregado no preparo da amostra mostrou-se mais seletivo e específico do que materiais normalmente empregados para a extração dos canabinoides das amostras de urina, além de a técnica de extração por MEPS apresentar baixo consumo de solventes e amostra para a extração dos analitos e posterior análise por LC-MS/MS. / The sample preparation is one of the most important steps in every chemical analysis. The isolation and concentration of the sample components are crucial and it is always sought that these steps are simple and consume the lowest amount of time and reagents. In the recent years, a type of material has proved to be very useful for chemical analyzes of biological fluids, the molecularly imprinted polymers (MIPs). MIPs are synthesized by polymerization reactions in the presence of a template molecule. The template molecule binds to the functional monomers of the polymer during the polymerization reaction and remains bonded to the surface of the polymeric chains after the reaction is complete. After the polymerization is finished, the complete washing of the template molecules is carried out, thus, three-dimensional cavities, complementary to the molecule used as a template, remain on the polymer surface. These cavities allow the reversible and preferential bonding of the template molecule or others with similar chemical structure. Cannabis sativa is the most commonly consumed illicit drug in the world and in recent years much attention has focused on its toxicological effects on human body and for medical applications. In this master dissertation, a MIP was synthesized with the catechin molecule as template, for extraction and subsequent analysis by LC-MS/MS of the cannabinoids Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (THC-OH), and 11-nor-Δ9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid (THC-COOH) in urine samples. The MIP produced was packed in a microdevice and used in the preparation of the urine samples by microextraction by packed sorbent (MEPS). The developed method showed good linearity (r values of 0.977 for THC and 0.994 for THC-OH and THC-COOH). The detection and quantification limits were respectively 5 ng mL-1 and 20 ng mL-1 for THC and THC-OH in the linear range from 25 to 250 ng mL-1. For the compound THC-COOH the limits of detection and quantification achieved were 1 ng mL-1 and 5 ng mL-1, respectively, in the linear range from 5 to 170 ng mL-1. The method presented reasonable values of precision, between 3.2% (for THC-COOH) and 25.1% (for THC) and displayed accuracy ranging from -18.4 to 17.4 (both for THC). The MIP used in the sample preparation was more selective and specific than other materials usually employed for the extraction of the cannabinoids from the urine samples. The MEPS technique also showed low consumption of solvents and sample for sample preparation, extraction of analytes and subsequent analysis by LC-MS/MS.

O aleitamento materno está associado a benefícios de ordem nutricional, imunológica, afetiva, econômica e social. Grande parte das drogas lícitas e ilícitas consumidas pela lactante pode ser transferida para o leite, o que pode representar potenciais efeitos nocivos para a criança em curto e longo prazos. Embora o conhecimento a respeito de substâncias psicoativas durante a lactação venha sendo ampliado, ainda há poucas informações sobre as concentrações de substâncias excretadas por essa via e muitas dúvidas sobre os efeitos delas em crianças durante o período de amamentação. O leite materno é uma matriz não convencional que pode ser usada para avaliar a exposição de crianças a substâncias durante o aleitamento e sua principal vantagem é a coleta simples e não-invasiva. Contudo, a extração destas a partir do leite materno é um desafio analítico devido ao seu alto conteúdo lipídico e proteico, bem como a alteração na sua composição durante o período pós-parto. No presente trabalho, técnicas analíticas miniaturizadas foram desenvolvidas visando a detecção das substâncias psicoativas cocaína, cocaetileno, norcocaína, tetraidrocanabinol, canabinol, canabidiol em amostras de leite materno, utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). A microextração em fase líquida (LPME) foi aplicada para analitos de cocaína e a microextração em fase sólida (SPME) para canabinoides. Após o desenvolvimento e validação dos métodos, as análises foram aplicadas em amostras de leite coletadas no hospital municipal Dr. Arthur Ribeiro de Saboya (n=109). Além das técnicas terem se mostrado adequadas à extração e detecção dos analitos, confirmou-se a excreção de cocaína no leite materno em quantidades moderadas com resultado positivo para uma amostra (138 ng/mL). Bem como foi detectado tetraidrocanabinol nas concentrações de 20 ng/mL e 31 ng/mL em amostras de leite humano. / Maternal breastfeeding is related with nutritional, immunological, affective, economic, and social benefits. Most licit and illicit substances consumed by the nursing mother might be excreted in breast milk, which may cause potential harmful effects to the breastfed infant at short and long terms. Although the knowledge about the psychoactive substances during lactation is increasing, there is still few information on the levels in which these substances are excreted in breast milk and many questions about the possible effects of these substances in the infant during the nursing period still remain unanswered. Breast milk is an unconventional matrix that can be used to assess infant exposure to drugs, and its main advantage is its easy and non-invasive collection. However, the extraction of substances from breast milk is an analytical challenge because of its high protein and fat content and changing composition during the postpartum period. In this study, miniaturized analytical techniques will be carried out to determine psychoactive substances such as cocaine, cocaethylene, norcocaine, tetrahydrocannabinol, cannabinol, and cannabidiol in milk samples by using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Liquid-phase microextraction (LPME) was applied to cocaine analytes and solid-phase microextraction (SPME) was applied to cannabinoids. After the development and validation, the methods were applied in milk samples collected from municipal hospital Dr. Arthur Ribeiro de Saboya (n=109). These techniques have proved to be suitable for analyte extraction and detection. Cocaine excretion in breast milk has been confirmed given that one sample was positive to cocaine in moderate amounts (138 ng/mL), as well as, two samples could be confirmed positive to tetrahydrocannabinol at 20 ng/mL and 31 ng/mL.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-28 / Objetivo: Avaliar, através de uma revisão sistemática da literatura, os efeitos antitumorais dos canabinóides em qualquer tipo de neoplasia, utilizando como amostra seres humanos e animais de laboratório com tumores, bem como culturas de células tumorais. Método: A pesquisa incluiu as seguintes bases eletrônicas de dados: PUBMED, EMBASE, LILACS e “The Cochrane Collaboration Controlled Trials Register”. Todos os estudos publicados que envolveram os efeitos antitumorais (mecanismos celulares e moleculares) dos canabinóides foram considerados para esta revisão. Desta forma, foram levados em conta não somente ensaios clínicos (randomizados ou não) como também estudos experimentais in vivo e in vitro. A estratégia de busca bibliográfica compreendeu todas as publicações de cada base de dados até 31 de dezembro de 2009. O exame minucioso de todas as referências bibliográficas dos artigos importantes para esta revisão (incluindo artigos de revisão) foi igualmente realizado com o objetivo de selecionar artigos que não tivessem sido capturados pela estratégia de busca eletrônica. Resultados: De 3.920 artigos inicialmente identificados, 117 preencheram os critérios de inclusão para esta revisão. Todos os estudos incluídos nesta revisão sistemática foram experimentais (in vivo e/ou in vitro), excetuando-se um estudo clinico piloto fase I/II em humanos. Em todos os estudos experimentais incluídos, os canabinóides exerceram atividade antitumoral in vitro e/ou evidência antitumoral in vivo em vários modelos de células tumorais e tumores, respectivamente. As atividades antitumorais incluíram: efeitos antiproliferativos (sequestro do ciclo celular), diminuição da viabilidade e morte celular por toxicidade, apoptose, necrose, autofagia, efeitos antiangiogênicos e antimigratórios. As evidências antitumorais incluíram: diminuição do tamanho tumoral, efeitos antiangiogênicos e antimetastáticos. Adicionalmente, a maioria dos estudos descreveu que os canabinóides apresentaram seletividade na ação antitumoral em vários modelos tumorais. Desta forma, as células normais usadas como controle não foram atingidas. O fator segurança na administração dos canabinóides também foi demonstrado in vivo, em ratos com tumores marcados com células tumorais. O único estudo realizado em humanos, por sua vez, demonstrou segurança na administração intratumoral do delta-9-THC em pacientes com glioblastoma multiforme recorrente. Conclusões: Os vários canabinóides testados em múltiplos modelos de tumores apresentaram efeitos antitumorais in vitro e in vivo. Estes achados indicam que os canabinóides são compostos promissores para o tratamento das neoplasias. No entanto, pesquisas em seres humanos através de ensaios clínicos randomizados, metodologicamente bem conduzidos, devem ser realizadas para a avaliação de eficácia dos mesmos antes que eles possam ser indicados para esta finalidade. Este é o caso do delta- 9-THC e do canabidiol, que já foram testados e aprovados para uso em humanos em outras condições clínicas. Outros canabinóides, no entanto, necessitam ainda de pesquisas farmacocinéticas, farmacodinâmicas e toxicológicas antes de poderem ser testados em seres humanos. / Objective: To evaluate, through a systematic review of the literature, the antitumoral effects of cannabinoids on any type of cancer, involving both human beings and animal samples, as well as cultured tumor cells. Method: Research included the following electronic databases: PUBMED, EMBASE, LILACS and "The Cochrane Collaboration Controlled Trials Register. All published studies involving the antitumoral effects (cellular and molecular mechanisms) of cannabinoids were considered for this review. Thus, not only clinical trials (randomized or not) but experimental studies (both in vivo and in vitro) were taken into account. The bibliography search strategy included all publications of each of these databases until December 31, 2009. The scrutiny of all the references from the relevant articles for this review (which included review articles) was also performed, in order to select items that could not have been captured by the chosen electronic search strategy. Results: From 3,920 initially identified articles, 117 fulfilled the inclusion criteria for this review. All the studies included in this systematic review were experimental (in vivo and/or in vitro), except for a pilot clinical trial phase I/II involving humans. In all experimental studies included, cannabinoids exerted antitumoral activity in vitro and/or antitumoral evidence in vivo in several models of tumor cells and tumors, respectively. The antitumor activity included: antiproliferative effects (cell cycle arrest), decreased viability and cell death by toxicity, apoptosis, necrosis, autophagy, as well as antiangiogenic and antimigratory effects. Antitumoral evidence included: reduction in tumor size, antiangiogenic, and antimetastatic effects. Additionally, most of the studies described that the canabinnoids exercised selective antitumoral action in several distinct tumor models. Furthermore, normal cells used as controls were not affected. The safety factor in the cannabinoids’ administration has also been demonstrated in vivo in rats with tumors which were marked with tumor cells. The sole study in humans demonstrated safety in intratumoral administration of delta-9- THC in patients with recurrent glioblastoma multiforme. Conclusions: The various cannabinoids tested in multiple tumor models showed antitumoral effects both in vitro and in vivo. These findings indicate that cannabinoids are promising compounds for the treatment of cancer. However, methodologically well conducted research on humans through clinical trials has yet to be performed in order to evaluate their effectiveness. This is the case of delta-9-THC and cannabidiol, which have been tested and approved for use in humans in other clinical conditions. In the case of other cannabinoids, however, further pharmacokinetic as well as pharmacodynamic and toxicological studies are required before their being tested in humans. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

The drug abuse has created several problems, moral, social and economical, and does not have borders of social class, educational and religious. The chemicaltoxicological analysis is an indispensable resource to confirm the exposure of humans to these drugs. Depending on the purpose of analysis, various biological matrices can be used. Nowadays, hair is being recognized as a third fundamental biological sample for drug testing besides urine and blood. The collection of hair samples is simple, noninvasive being difficult its adulteration. The techniques based on the miniaturization of extraction have gained an important role on the world stage in relation to conventional techniques. Among these techniques, stand out to solid phase microextraction (SPME) and liquid phase microextraction (LPME). In this work, a analytical method was developed for determination of 9- tetrahydrocannabinol (9-THC), cannabidiol (CBD) and cannabinol (CBN) in human hair by headspace solid-phase microextraction (SPME) and hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) using gas chromatography coupled to mass spectrometry, operating in tandem mode (GC-MS/MS). Initially, in step sample preparation, a small mass of hair (10 mg) was decontaminated with petroleum ether (2 mL) for 10 minutes of ultrasound application (3 times) followed by alkaline digestion (NaOH 1 M). A univariate design was used for the determination the better condictions of the parameters of HS-SPME: pH (10), temperature (90 °C), mass of hair (10 mg), extraction time (40 min), desorption time (10 min), ionic strength (Na2CO3), saturation time (10 min) and fiber (PDMS). For HF-LPME a fractional factorial design was used in the screening of some variables of this technique followed by central composite design in the evaluation of optimal values of variables. The variables assessed and the optimum values of these were: extraction solvent (butyl acetate), donor phase pH (14), agitation speed (600 rpm), extraction time (20 min), ionic strength (6.8 % m/v) and acceptor phase volume (20 μL). The methods were submitted to the validation process showed good linearity with coefficient of determination (R2) above 0.994. Precision was determined using two different concentrations (upper and lower limits of the linear range) and RSD values were between 6.6 and 16.4 % for HS-SPME and 4.4-13.7% for HF-LPME. Absolute recoveries were in the range 1.1 to 8.7 % (HS-SPME) and 4.4 to 8.9 % (HF-LPME). The limits of detection and quantification ranged between 7-62 pg mg-1 and from 0.0005-0.020 ng mg-1 to HS-LPME and HF-LPME, respectively. The 9-THC showed values of limits of quantification for both methods below the cut-off (LQ ≤ 100 pg mg-1). Finally, the methods developed and validated were applied in determining CBD, 9-THC and CBN in hair samples of patients from a center of rehabilitation for drug addicts. The concentrations were in the range of LD-0.018 ng mg-1 for CBD, LD-232 pg mg-1 for 9-THC and 9-300 pg mg-1 for CBN show the applicability of the method in monitoring studies. The concentration of cannabinoids in the samples ranged from limit of detection to 18 pg mg-1 for CBD, limit of detection to 232 pg mg -1 for 9-THC and 9 to 300 pg mg-1 to CBN demonstrate the applicability of the method in monitoring studies. / O consumo de drogas de abuso tem criado diversos problemas de ordem moral, social e econômica, além de não possuir fronteiras de classes sociais, educacionais e religiosas. A análise químico-toxicológica é um recurso indispensável para confirmar a exposição de pessoas a essas drogas. Dependendo da finalidade da análise, diversas matrizes biológicas podem ser utilizadas. Atualmente, o cabelo é reconhecido como uma das principais amostras biológicas para determinação de drogas, ao lado da urina e do sangue. A coleta de amostras de cabelo é um processo simples, não invasivo, sendo difícil sua adulteração. As técnicas baseadas na minituarização de extração têm ganhado um papel importante no cenário mundial frente às técnicas convencionais. Entre essas técnicas destacam-se a microextração em fase sólida (SPME) e a microextração em fase líquida (LPME). No presente trabalho, um método analítico foi desenvolvido para determinação de 9-tetraidrocanabinol (9- THC), canabidiol (CBD) e canabinol (CBN) em cabelo humano por microextração em fase sólida no modo headspace (HS-SPME) e microextração em fase líquida por fibra oca (HF-LPME) por cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massas operando no modo tandem (GC-MS/MS). Na etapa de preparação da amostra, uma pequena massa de cabelo (10 mg) foi descontaminada com éter de petróleo (2 mL) por 10 minutos em ultra-som (3X), seguida de digestão alcalina (NaOH 1 mol L-1). Um planejamento univariado foi utilizado para o estudo das condições ótimas dos parâmetros de HS-SPME, tendo sido deferidos: pH (10), temperatura (90 ºC); massa de cabelo (10 mg); tempo de extração (40 min); tempo de dessorção (10 min); força iônica (Na2CO3); tempo de saturação (10 min) e fibra (PDMS). Para HF-LPME um planejamento fatorial fracionário foi empregado na triagem de algumas variáveis desta técnica seguido pelo planejamento composto central na avaliação dos valores ótimos das variáveis escolhidas: solvente de extração (acetato de butila), pH da fase doadora (14), velocidade de agitação (600 rpm), tempo de extração (20 min), força iônica (6,8 % m/v) e volume da fase aceptora (20 μL). Os métodos foram submetidos ao processo de validação demonstrando boa linearidade, com coeficientes de determinação (R2) acima de 0,994. A precisão foi determinada a partir dos limites inferior e superior da faixa linear apresentando valores de RSD entre 6,6 e 16,4% para HS-SPME e 4,4-13,7 % para HF-LPME. Recuperações absolutas foram de 1,1 a 8,7 % (HS-SPME) e 4,4 a 8,9 % (HF-LPME). Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram de 7 a 62 pg mg-1 e 0,5 a 20 pg mg-1 para HS-SPME e HFLPME, respectivamente. O 9-THC apresentou valores de limites de quantificação para os dois métodos abaixo do valor de cut-off (LQ ≤ 100 pg mg-1). Finalmente, os métodos desenvolvidos e validados foram aplicados na determinação de CBD, 9- THC e CBN em amostras de cabelo de pacientes de centro de reabilitação de dependentes químicos. As concentrações dos canabinóides nas amostras variaram do limite de detecção a 18 pg mg-1 para CBD, do limite de detecção a 232 pg mg-1 para 9-THC e 9-300 pg mg-1 para CBN, demonstram a aplicabilidade do método em estudos de monitorização.

O consumo dos diferentes tipos de drogas está associado a problemas sociais, econômicos e de saúde pública, em todas as regiões no mundo. Dentre os problemas de saúde pública, podemos destacar a alta prevalência de comorbidade entre o uso de drogas e os transtornos mentais. A Cannabis, a cocaína e o crack são as drogas ilícitas mais consumidas no Brasil. A utilização do cabelo como matriz biológica para determinação destas drogas permite avaliar o uso crônicos pelos indivíduos, uma vez que o cabelo é uma matriz estável, de fácil manipulação e a janela de detecção depende apenas do comprimento do cabelo. Entretanto, a análise em cabelo ainda representa um desafio analítico. Foram desenvolvidos dois métodos para a detecção das diferentes drogas no cabelo, com diferentes enfoques analíticos. O primeiro método (desenvolvido durante o estágio de doutorado sanduíche na Itália) identificou e quantificou cocaína e metabólitos usando a técnica de column switching e detecção por LC-MS/MS. O segundo método foi desenvolvido para determinação de canabinóides nas amostras de cabelo utilizando GC-MS. O diferencial deste método foi a utilização de um novo dispositivo de extração em fase sólida (as ponteiras DPX) para concentração e purificação do extrato, utilizando menor quantidade de solventes. A determinação dos canabinóides e cocaínicos foi realizada nas amostras de cabelo da população atendida no CAPS - AD de Ribeirão Preto, São Paulo. Além da coleta da amostra de cabelo, o sujeito foi submetido a uma entrevista, onde os seguintes instrumentos de avaliação foram aplicadas: Questionário sobre a saúde do Paciente 9, Inventário de fobia social, Self Report Questionnaire, Questionário de Ansiedade de Beck, Inventário de Depressão de Beck e Questionário sobre o uso da Cannabis, bem como um questionário elaborado pelo pesquisador para coleta de dados sociodemográficos, consumo de substâncias e dados sobre a amostra de cabelo, como comprimento, cor, tintura ou coloração. As amostras de cabelo foram analisadas e a média das concentrações de cada droga encontrada no cabelo foi correlacionada com os indicadores clínicos de transtorno mentais, obtidos através dos instrumentos de avaliação psiquiátrica. A maior prevalência de indicadores clínicos positivos para transtornos psiquiátricos entre a população estudada foi de transtornos mentais comuns, entre eles a ansiedade e depressão. A comparação da média de concentração de Cannabis, cocaína e crack no cabelo com os indicadores clínicos positivos para os transtornos não apresentou resultados estatisticamente significantes. Entretanto, podemos inferir que os sujeitos que apresentaram maior concentração média de Cannabis e cocaína no cabelo possuíam mais indicadores clínicos positivos para sintomas mentais comuns e depressão maior enquanto que os sujeitos usuários de crack possuíam mais indicadores clínicos positivos para sintomas ansiedade. Apesar de algumas limitações, podemos concluir que o estudo possibilitou estimar a prevalência da morbidade entre abuso de drogas ilícitas e transtornos psiquiátricos na população atendida no Centro de Atenção Psicossocial Álcool e drogas de Ribeirão Preto. / Different kinds of drug use have been associated to social, economic and health public problems worldwide. Among the high prevalent public health problems is the comorbidity between drug abuse and psychiatric disorders. Cannabis, cocaine and crack are the most consumed illicit drugs in Brazil. Hair use as the biological matrix for the determination of these drugs allows to evaluate chronic use, once hair is a stable matrix, easy to manipulate and the window detection only depends on the size of the hair. However, hair analysis still represents an analytical challenge. It was developed two methods for the detection of the drugs in hair, with different analytical approach. The first method (developed during doctoral stage in Italy) had identified and quantified cocaine and metabolites using column switching technique and LCMS/ MS detection. The second method was developed for determination of cannabinoids in hair samples using GC-MS. Decontamination procedure was the same cited above. The differential of this method was the use of a new device in solid phase extraction (DPX tips) for the extracts concentration and purification, using less solvents volumes. Cannabinoids and cocaine analysis were performed in hair samples from people who were enrolled in the CAPS - AD of Ribeirão Preto, São Paulo. Besides hair collection, the individual was submitted to an interview, where it was applied the following evaluation scales: Patient health questionnaire - 9, Social phobia inventory, Self report questionnaire, Beck anxiety inventory, Beck depression inventory and Cannabis research questionnaire as well as a questionnaire made by the author to collect sociodemographic data, substance consume and hair data. Hair samples were analyzed and the concentrations were correlated with positive clinical factors of mental disorders obtained through evaluation scales. The highest prevalence of positive clinical indicators for psychiatric disorders among the population studied was of common mental disorders, including anxiety and depression. The comparison of the average concentration of Cannabis, cocaine and crack in the hair with the positive clinical indicators for the disorders did not show statistically significant results. However, we can infer that the subjects who had higher average concentration of Cannabis and cocaine in hair had showed positive indicators for common mental symptoms and major depression as well as the subjects who had higher average concentration of crack in hair had showed positive indicators for anxiety. Despite of some limitations, we can conclude that the study had allowed estimating the prevalence of morbidity among illicit drugs abuse and psychiatric disorders in the population enrolled in the psychosocial care center in Ribeirão Preto.

La consommation de cannabis chez les adolescents et les jeunes adultes constitue un facteur de risque de développement de symptômes psychotiques. L’objectif de cette thèse était d’étudier les conséquences à l’âge adulte d’une exposition chronique aux cannabinoïdes pendant l’adolescence. Nous avons réalisé ces études chez le Rat et démontré que l’administration chronique d’un agoniste des récepteurs cannabinoïdes, le CP55, 940, durant l’adolescence (JPN 29 à 50) entraîne à l’âge adulte des déficits significatifs et durables de la mémoire à court terme et de la mémoire de travail spatiale. Le même traitement administré à l’âge adulte (JPN 70 à 91) n’entraîne pas de déficits cognitifs à long terme. L’apport de ces travaux et leur originalité a été de contribuer à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement de ces déficits cognitifs. Nous avons mis en évidence, chez ces rats à l’âge adulte, une diminution significative de l’amplitude de la PLT induite sur le circuit reliant l’hippocampe au cortex préfrontal, fortement impliqué dans les processus de mémoire et dans la physiopathologie de la schizophrénie. Ce déficit de PLT a été mis en relation avec des modifications de la morphologie des neurones pyramidaux de la couche II/III du cortex préfrontal et de certains marqueurs de la plasticité synaptique. Ces résultats confirment que l'adolescence est une période critique et vulnérable aux effets délétères des cannabinoïdes sur les processus cognitifs. L’étude des bases neurobiologiques de ces effets, en particulier en ce qui concerne les altérations des circuits préfrontaux, devrait améliorer notre compréhension des mécanismes de l'émergence de la psychose et conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques et de prévention. / Cannabis use among adolescents and young adults is a risk factor for developing psychotic symptoms. The aim of this thesis was to study the consequences at different levels (behavioral, functional and structural in adulthood) of chronic exposure to synthetic cannabinoids during adolescence in the rat. We showed that chronic administration of a cannabinoid receptor agonist, CP 55940, during adolescence (PND 29-50) in rats leads to significant long-term deleterious effects in short-term memory and in spatial working memory in adulthood. The same treatment administered in adulthood (PND 70-91) does not cause long-term cognitive deficits. We further demonstrated that cannabinoid during adolescence leads in adults to a significant decrease in the expression of LTP induced in hippocampal to prefrontal cortex synapses, a circuit directly involved in memory processes and in the pathophysiology of schizophrenia. This alteration could be associated with changes in the morphology of pyramidal neurons in layer II / III of PFC and/or in the density of synaptic markers that we also identified in these cannabinoid-treated rats. These findings demonstrate that adolescence is a critical and vulnerable period to the deleterious effects of cannabinoids on cognitive processes. The neurobiological basis for this effect, especially with regard to alterations to prefrontal circuitry, which we partially provide should improve our understanding of the emergence of psychosis and lead to new therapeutic strategies and prevention.

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive B-cell malignancy with bad prognosis, which predominates in males with advanced age. However, studies of the endocannabinoid system and how it affects tumour behaviour provides the basis for designing innovative therapeutic strategies that could open new opportunities for treatment of patient with MCL. It has earlier been shown that the cannabinoid receptor ligand (R)-(+)-methanandamide (R-MA) induce cell death in MCL by accumulation of ceramide. Ceramide has a pro-apoptotic effect on the cell but could be metabolized by the enzymes glucosylceramide synthase (GCS) and sphingosine kinase 1 (SphK1) to molecules with pro-proliferative effect. Therefore, treatments with R-MA on Jeko-1 MCL cell line were performed in this study to determine interference in the proliferative behaviour as well as in the gene expression of the enzymes GCS and SphK1. In addition, treatments with chemotherapeutic substances, such as doxorubicin or cytarabine (Ara-C), and combinations of R-MA and chemotherapeutic substance, were performed for the same reason. Results showed that the proliferation behaviour of Jeko cells remained unaffected when treated with R-MA, in contrast to the decreased proliferative effects shown when treated with cytostatics or combinations of R-MA and cytostatics. Furthermore, a tendency for up-regulation of GCS and SphK1 expression was recognized when cells were treated with cytostatics or combination of cytostatics and R-MA, in contrast to cells treated with R-MA alone. Although, R-MA alone had a tendency for a small down-regulation of GCS expression, it contributed to a potential elevation of GCS expression when combined with Ara-C or doxorubicin. It is believed that the effect from upregulated levels of the metabolizing enzymes GCS and SphK1 is balanced by, earlier observed, up-regulations of the ceramide synthesis enzymes.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Adult hematopoietic stem cells (HSC) are routinely used to reconstitute hematopoiesis after myeloablation; however, transplantation efficacy and multilineage reconstitution can be limited by inadequate HSC number, or poor homing, engraftment or self-renewal. We have demonstrated that mouse and human HSC express prostaglandin E2 (PGE2) receptors, and that short-term ex vivo exposure of HSC to PGE2 enhances their homing, survival and proliferation, resulting in increased long-term repopulating cell and competitive repopulating unit (CRU) frequency. HSC pulsed with PGE2 are more competitive, as determined by head-to-head comparison in a competitive transplantation model. Enhanced HSC frequency and competitive advantage is stable and maintained upon multiple serial transplantations, with full multi-lineage reconstitution. PGE2 increases HSC CXCR4 mRNA and surface expression and enhances their migration to SDF-1α in vitro and homing to bone marrow in vivo and stimulates HSC entry into and progression through cell cycle. In addition, PGE2 enhances HSC survival, associated with an increase in Survivin mRNA and protein expression and reduction in intracellular active caspase-3. While PGE2 pulse of HSC promotes HSC self-renewal, blockade of PGE2 biosynthesis with non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) results in expansion of bone marrow hematopoietic progenitor cells (HPC). We co-administered NSAIDs along with the mobilizing agent granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) and evaluations of limiting dilution transplants, assays monitoring neutrophil and platelet recoveries, and secondary transplantations, clearly indicate that NSAIDs facilitate mobilization of a hematopoietic graft with superior functional activity compared to the graft mobilized by G-CSF alone. Enhanced mobilization has also been confirmed in baboons mobilized with G-CSF and a NSAID. Increases in mobilization are the result of a reduction of signaling through the PGE2 receptor EP4, which results in marrow expansion and reduction in the osteoblastic HSC niche. We also identify a new role for cannabinoids, an eicosanoid with opposing functions to PGE2, in hematopoietic mobilization. Additionally, we demonstrate increased survival in lethally irradiated mice treated with PGE2, NSAIDs, or the hypoxia mimetic cobalt chloride. Our results define novel mechanisms of action whereby eicosanoids regulate HSC and HPC function, and characterize novel translational strategies for hematopoietic therapies.

Tesis por compendio / [EN] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) is an angiosperm, allogamous and dicotyledonous species that includes short and neutral-day varieties with dioecious specimens (males and females), and monoecious plants. Among its many applications, its industrial and medicinal uses stand out. Despite the fact that cannabis has been used by humans since ancient times and the growing interest that the C. sativa therapeutic properties have aroused in researchers around the world, the psychoactivity of some of its varieties, derived from its ¿9-tetrahydrocannabinol (THC) content, has motivated the prohibition of its cultivation for almost sixty years. The strict control to which cannabis has been subjected has prevented professionals from all over the world from carrying out genetic breeding programs for this species, which has resulted in the absence of uniform varieties. In this Doctoral Thesis, different biotechnological tools for cannabis genetic improvement have been developed. In the first place, given the lack of reproducibility of some cannabis plant in vitro regeneration protocols and the great influence that the genotype exerts on their effectiveness, plant in vitro regeneration competence of different explants was evaluated. As a result, an hormone-free protocol from C. sativa hypocotyls that presents high regeneration rates (ranging from 32.26% to 71.15%) in all the genotypes evaluated, also presenting a 17.94% of spontaneous rooting rate of regenerants has been developed. At the same time, the polysomatic pattern of different cannabis explants has been studied, and it has been possible to regenerate, from them, a significant percentage of mixoploid specimens (17.65% from cotyledons and 13.33% from hypocotyls) that, as described in the existing literature, could show a greater capacity for cannabinoid synthesis. On the other hand, given the absence of scientific publications in this regard, and the potential that this technique presents to alleviate the intrinsic variability of this species, the most in-depth study to date on the male floral biology of C. sativa has been developed. Up to 476,903 microspores and pollen grains per male flower, with in vivo microspore viability rates from 53.71 to 70.88% have been found. Furthermore, all stages of development of the microgametophyte have been correlated with an easily measurable floral morphological marker such as the bud length, identifying bud length intervals containing mostly vacuolate microspores and young bi-cellular pollen grains in all the phenotypes evaluated. In this way, and although the starch presence in C. sativa microspores and pollen grains follows a similar pattern to that observed in species recalcitrant to androgenesis, it has been possible to address the induction of microspore embryogenesis in this species, obtaining for the first time microspore-derived multicellular structures after one week long cold-shock bud pretreatment. Finally, as a prerequisite for the genetic editing of C. sativa by using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas systems, and taking advantage of the in vitro plant regeneration protocol which resulted from this Doctoral Thesis, it has been possible to develop for the first time a protocol for the production of stably transformed cannabis plants, which represents a historical milestone in the genetic improvement of the species. After co-culture with A. tumefaciens and subsequent culture in antibiotic-containing selective regeneration medium, hypocotyls achieved 23.1% and 5.0% of regeneration and transformation rates respectively. As a whole, the present Doctoral Thesis provides a range of biotechnological tools that will allow the development of a new generation of high-yield cannabis varieties with uniform traits, resistant to multiple biotic and abiotic stresses, and therefore being suitable for both industrial and medicinal use. / [ES] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) es una especie angiosperma, alógama y dicotiledónea compuesta por variedades de día corto y día neutro que presentan ejemplares dioicos (machos y hembras), y plantas monoicas. Entre sus múltiples aplicaciones destacan tanto su uso industrial como su uso medicinal. A pesar de que el cannabis ha sido empleado por el ser humano desde tiempos ancestrales, la psicoactividad que presentan algunas de sus variedades, derivada de su contenido en ¿ 9 -tetrahidrocannabinol (THC), ha motivado la prohibición de su cultivo durante casi sesenta años. La estricta fiscalización a la que ha sido sometido el cannabis, ha impedido llevar a cabo programas de mejora genética de esta especie, lo que se ha traducido en la ausencia de variedades uniformes. En esta Tesis Doctoral se han desarrollado diferentes herramientas biotecnológicas para la mejora genética del cannabis. En primer lugar, dada la falta de reproducibilidad de algunos protocolos de cultivo in vitro de cannabis y la gran influencia que el genotipo ejerce en la efectividad de los mismos, se evaluó la capacidad de regeneración in vitro de diferentes explantes. Como resultado, se ha desarrollado un protocolo libre de hormonas a partir de hipocótilos de C. sativa que presenta altas tasas de regeneración (las cuales oscilan del 32,26% al 71,15%) en todos los genotipos evaluados, presentando además un 17,94% de tasa de enraizado espontáneo de los regenerantes. A su vez, se ha estudiado el patrón polisomático de diferentes explantes de cannabis y se ha conseguido regenerar, a partir de los mismos, un porcentaje significativo de ejemplares mixoploides (17,65% procedentes de cotiledones y 13,33% de hipocotilos) que, tal y como describe la bibliografía existente, podrían mostrar una mayor capacidad de síntesis de cannabinoides. Por otro lado, dada la ausencia de publicaciones científicas al respecto y el potencial que esta técnica presenta para paliar la variabilidad intrínseca de esta especie, se ha desarrollado el estudio más profundo hasta la fecha relativo a la biología floral masculina de C. sativa. Se han descrito hasta 476.903 microsporas y granos de polen por flor masculina, con tasas de viabilidad in vivo de las microsporas del 53,71 al 70,88%. Además, se han correlacionado todas las etapas de desarrollo del microgametofito con la longitud de la yema, identificando intervalos de longitud de yema que contienen mayoritariamente microsporas vacuoladas y granos de polen joven bicelular en todos los fenotipos evaluados. De este modo, y aunque la presencia de almidón en las microsporas y granos de polen de C. sativa sigue un patrón similar al observado en especies recalcitrantes a la androgénesis, ha sido posible abordar la inducción de la embriogénesis de microsporas en esta especie, consiguiendo producir por primera vez estructuras multicelulares derivadas de las microsporas tras aplicar sobre las yemas un pretratamiento de frío de una semana de duración. Finalmente, como requisito previo para la edición genética de C. sativa mediante los sistemas CRISPR/Cas, y haciendo uso del protocolo de regeneración in vitro de plantas surgido de la presente Tesis Doctoral, se ha conseguido desarrollar por primera vez un protocolo para producir plantas de cannabis transformadas genéticamente de forma estable, lo que supone un hito histórico en la mejora genética de la especie. Después del cocultivo con A. tumefaciens y el posterior cultivo en medio de regeneración selectiva con antibióticos, los hipocótilos lograron respectivamente un 23,1% y un 5,0% de tasas de regeneración y transformación. En su conjunto, la presente Tesis Doctoral proporciona un abanico de herramientas biotecnológicas que permitirán el desarrollo de una nueva generación de variedades de cannabis de alto rendimiento, que presenten caracteres homogéneos, resistentes a múltiples estreses tanto bióticos como abióticos, y siendo así aptas tanto para un uso industrial como medicinal. / [CAT] Cannabis sativa L. (Cannabaceae) és una espècie angiosperma, alógama i dicotiledònia composta per varietats de dia curt i dia neutre que presenten exemplars dioics (mascles i femelles), i plantes monoiques. Entre les seues múltiples aplicacions destaquen tant el seu ús industrial com el seu ús medicinal. Tot i que el cànnabis ha sigut emprat per l'ésser humà des de temps ancestrals, la psicoactivitat que presenten algunes de les seues varietats, derivada del seu contingut en ¿9-tetrahidrocannabinol (THC), ha motivat la prohibició del seu cultiu durant gairebé seixanta anys. L'estricta fiscalització a la qual ha sigut sotmés el cànnabis, ha impedit que professionals de tot el món puguen dur a terme programes de millora genètica d'aquesta espècie, la qual cosa s'ha traduït en l'absència de varietats uniformes. En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat diferents eines biotecnològiques per a la millora genètica del cànnabis. En primer lloc, donada la falta de reproducibilitat d'alguns protocols de cultiu in vitro de cànnabis i la gran influència que el genotip exerceix en l'efectivitat d'aquests, es va avaluar la capacitat de regeneració in vitro de diferents explants. Com a resultat, s'ha desenvolupat un protocol lliure d'hormones a partir de hipocòtils de C. sativa que presenta altes taxes de regeneració (les quals oscil·len del 32,26% al 71,15%) en tots els genotips avaluats, presentant a més un 17,94% de taxa d'arrelat espontani dels regenerants. Al mateix temps, s'ha estudiat el patró polisomàtic de diferents explants de cànnabis i s'ha aconseguit regenerar, a partir d'aquests, un percentatge significatiu d'exemplars mixoploids (17,65% procedents de cotilèdons i 13,33% de hipocòtils) que, tal com descriu la bibliografia existent, podrien mostrar una major capacitat de síntesi de cannabinoids. D'altra banda, donada l'absència de publicacions científiques sobre aquest tema i el potencial que aquesta tècnica presenta per a pal·liar la variabilitat intrínseca d'aquesta espècie, s'ha desenvolupat l'estudi més profund fins hui relatiu a la biologia floral masculina de C. sativa. S'han descrit fins a 476.903 microspores i grans de pol·len per flor masculina, amb taxes de viabilitat in vivo de les microspores del 53,71 al 70,88%. A més, s'han correlacionat totes les etapes de desenvolupament del microgametòfit amb la longitud de la gemma, identificant intervals de longitud de gemma que contenen majoritàriament microspores vacuolades i grans de pol·len jove bi-cel·lular en tots els fenotips avaluats. D'aquesta manera, i encara que la presència de midó en les microspores i grans de pol·len de C. sativa segueix un patró similar a l'observat en espècies recalcitrants a la androgènesi, ha sigut possible abordar la inducció de la embriogènesi de microspores en aquesta espècie, aconseguint produir per primera vegada estructures multicel·lulars derivades de les microspores després d'aplicar sobre les gemmes un pretractament de fred d'una setmana de duració. Finalment, com a requisit previ per a l'edició genètica de C. sativa mitjançant els sistemes CRISPR/Cas, i fent ús del protocol de regeneració in vitro de plantes sorgit de la present Tesi Doctoral, s'ha aconseguit desenvolupar per primera vegada un protocol per a produir plantes de cànnabis transformades genèticament de manera estable, la qual cosa suposa una fita històrica en la millora genètica de l'espècie. Després del cocultiu amb A. tumefaciens i el posterior cultiu en medi de regeneració selectiva amb antibiòtics, els hipocòtils van aconseguir respectivament un 23,1% i un 5,0% de taxes de regeneració i transformació. En el seu conjunt, la present Tesi Doctoral proporciona un ventall d'eines biotecnològiques que permetran el desenvolupament d'una nova generació de varietats de cànnabis d'alt rendiment, que presenten caràcters homogenis, resistents a múltiples estressos tant biòtics com abiòtics, i sent així aptes tant per a un ús industrial com medicinal. / Galán Ávila, A. (2021). Development of biotechnological tools for the genetic improvement of Cannabis sativa L [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176013 / Compendio