When forensic biological samples yield low quality/low quantity DNA, thecurrent STR analysis methods do not generate acceptable profiles. Whole genomeamplification can be used to pre-amplify the entire genome for downstream analyses. A commercially available kit for DOP-PCR, a form of WGA, is currently being used in the clinical for downstream single locus targets. Forensic analyses utilize a multiplex amplification. This study determined that the "home brew" created by our lab performs the same as the commercially available kit. Future optimization studies of DOP-PCR can utilize this "home brew". Additionally, this research determined that a 10 second increase in electrokinetic injection time onto the Capillary Electrophoresis (CE) in combination with a post-STR amplification purification and elution into formamide produces a slightly higher percent STR allele success over the standard protocol. After future optimization studies, this may be a useful method to obtain more accurate and complete STR profiles from low quality/low quantity biological samples.

This thesis deals with optimization of capillary electrophoresis conditions for the separation of unreacted substrate and products (cellobiose, glucose) generated by the enzymatic cleavage of cellotriose with enzyme cellobiase. The optimal separation electrolyte was shown to be a solution containing 30 mmol·dm-3 sodium hydroxide with addition of 1.0 mmol·dm-3 sodium phosphate and 1.0 mmol·dm-3 sodium phosphate dibasic (pH = 12.38). With this separation electrolyte calibration curves and repeatability were measured and the limits of detection and quantification were determined. The relative standard deviations of peak areas ranged up to 6.1 % and they did not exceed 0.2 % for the migration time. Limits of detection were determined in the range from 0.020 to 0.026 mmol·dm-3 and limits of quantification from 0.066 mmol·dm-3 to 0.085 mmol·dm-3 . Subsequently the enzyme reaction was monitored in offline setup. Furthermore, the offline procedure was automated and the relative standard deviation of cellodextrines after 30 minutes of hydrolysis was ranging up to 13.0 % of glucose and cellotriose and 3.0 % cellobiose using this automated method, which makes it suitable for semiquantitative and comparative measurements. The last part of the experiment was to carry out enzymatic reaction in online setup....

A new laboratory system has been developed for rapid electrophoretic separations and determinations of inorganic and organic ions. The instrument employs short fused silica capillary in combination with contactless conductivity detection. The basic functions of the apparatus have been tested using mixture of inorganic ions. It has further been applied to separations of neutral mono- and disaccharides. The model mixture contains five saccharides (sucrose, lactose, glucose, fructose and ribose). The technique developed has been used to determine sucrose, glucose and fructose in high-energy drinks.

Master of Science / Department of Chemistry / Christopher T. Culbertson / Chemical separation involves selective movement of a component out of a region shared by multiple components into a region where it is the major occupant. The history of the field of chemical separations as a concept can be dated back to ancient times when people started improving the quality of life by separation of good materials from bad ones. Since then the field of chemical separation has become one of the most continually evolving branches of chemical science and encompasses numerous different techniques and principles. An analytical chemist’s quest for a better way of selective identification and quantification of a component by separating it from its mixture is the cause for these ever evolving techniques. As a result, today there are numerous varieties of analytical techniques for the separation of complex mixtures. High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Gas Chromatography (GC), Capillary Electrophoresis (CE) and Gel Electrophoresis are a few out of a long list. Each these techniques manipulates the different physical and chemical properties of an analyte to achieve a useful separation and thus certain techniques will be suited for certain molecules. This work primarily focuses on the use of Capillary Electrophoresis as a separation technique. The mechanism of separation in Capillary Zone Electrophoresis and principles of UV detection will discussed in chapter one. Chapter two contains a discussion about the application of Capillary Electrophoresis (CE) on microfluidc devices. This will include sections on: microfabrication techniques of PDMS and photosensitized PDMS (photoPDMS), a UV detector for microfluidic devices and its application for the detection of wheat proteins. In Chapter three we report the experimental part of this project which includes; investigations on the effect of UV exposure time and thermal curing time on feature dimensions of photoPDMS microfluidic device, investigations on the injection and separation performances of the device, characterization of a UV detector set up and its application for the separation and detection of wheat gliadin proteins. The results of these investigations are presented in chapter four.

Unfractionated heparin, which is a widely used anticoagulant, is frequently replaced with low-molecular-mass species. They are used due to their more predictable anticoagulant effect with less bleeding complications and also they have prolonged anticoagulant effect. For monitoring of low-molecular-mass heparin levels, anti-factor Xa assay is used, which has some significant drawbacks. This work is dedicated to determination of low-molecular-mass heparin, namely Fraxiparine, using affinity capillary electrophoresis. Heparin is a polysaccharide which does not exhibit a significant UV absorption; therefore, its indirect detection method was used. Fraxiparine forms a stable complex with protamine. Protamine is an arginine-rich, positively charged peptide which is used to suppress heparin anticoagulant effect. Because protamine has a complex, not precisely defined structure, it was replaced by well-defined tetraarginine. The method uses phosphoric acid of 9 mmol L-1 concentration with addition of 0.1% (w/v) hydroxyethylcellulose as the background electrolyte. The samples are injected hydrodynamically into the capillary by a pressure of 5 kPa. First, the zone of Fraxiparine was injected, followed by the zone of tetraarginine (5 s). After that, 30 kV voltage was applied for 30 s. During this time the...

Nos últimos anos têm crescido cada vez mais o número de pesquisas envolvendo nanotecnologia para obtenção de medicamentos com liberação controlada, pois esses sistemas podem: proteger o fármaco de incompatibilidades tanto biológicas quanto físico-químicas assim como controlar a biodisponibilidade do fármaco. Embora com todas essas vantagens não existem métodos in vitro realmente capazes de prever com precisão a liberação dos fármacos por esses sistemas, por esse motivo, é muito importante o desenvolvimento de métodos de liberação in vitro para determinar a cinética de liberação desses sistemas.O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar os métodos de eletroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinar a eficiência de encapsulação do fármaco imatinibe em nanopartículaspreviamente elaboradas e caracterizadas, assim como estudar sua liberação in vitro por CE. As nanopartículas foramdesenvolvidas pelo método de nanoprecipitaçãoe caracterizadas quanto ao tamanho, potencial zeta, morfologia e eficiência de encapsulação. A eletroforese capilar é uma técnica alternativa muito promissora em relação ao HPLC devido ao seu baixo custo, menor tempo de corrida e menos poluente ao meio ambiente. Os métodos de quantificação por CE e HPLCforam desenvolvidose validadossegundo as diretrizes do ICH, Farmacopeia Americana e ANVISA, permitindo desenvolver um estudo de liberação.As nanoesferas desenvolvidas apresentaram diâmetro médio próximo a 150nm, com índice de polidispersão menor que 0,1 e aproximadamente 90% de eficiência de encapsulação. Ambos métodos se mostraram lineares com coeficientes de determinação superiores a 0,99, os métodos se mostraram precisos (%DPR< 2), exatos(101,0±4,2% e 98,0±2,5% para HPLC e CE, respectivamente)e seletivos.O método de CE permitiu desenvolver um método de estudo de liberação independente das membranas de diálise. / In recent years, there has been a growing number of researches involving nanotechnology to obtain controlled release drugs, these systems can: protect the drug against biological and physico-chemical incompatibilities; controlling the bioavailability of the drug. Although with all these advantages there are no in vitro methods really capable of accurately predicting drugs release by such systems, therefore, the development of in vitro release methods to determine the release kinetics of such systems is very important. The objective of the present work was to develop and validate capillary electrophoresis (CE) and HPLC methods to determine the encapsulation efficiency of the imatinib drug in previously elaborated and characterized nanoparticles, as well as to study its release in vitro by CE method. The nanoparticles were synthesized using the nanoprecipitation method and characterized by size, zeta potential, morphology and encapsulation efficiency. Capillary electrophoresis is a very promising alternative to HPLC because of its low cost, less runtime and less polluting environment. The CE and HPLC methodswere developed and validated according ICH, American Pharmacopoeia and ANVISA guidelines.Developed nanospheres had an average diameter close to 150nm, with polydispersity index less than 0.1 and approximately 90% encapsulation efficiency. Both methods were linear with determination coefficients higher than 0.99, the methods were precise (%RSD < 2), accurate (101.0±4,2% and 98.0±2,5% for HPLC and CE, respectively) and selective. Capillary electrophoresis method allowed to develop a drug release study independent of dialysis membranes.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de extração hormonal à partir de fezes de onça-pintada (Panthera onca) e validar uma metodologia de análise destes extratos por eletroforese capilar, verificando a eficiência analítica desta técnica no estudo dos metabólitos de esteróides sexuais em fezes, com o intuito de utilização futura desta metodologia na rotina dos laboratórios de endocrinologia. Foram testados sete tratamentos para as amostras de fezes liofilizadas: quatro protocolos de extração em diferentes solventes, um de hidrólise ácida e dois protocolos de extração em fase sólida (SPE). O protocolo de extração em acetonitrila foi satisfatório como pré-tratamento da amostra e aliado à SPE C-18 apresentou bons resultados no que diz respeito à sensibilidade, precisão, recuperação e tempo de análise. Com base nos resultados obtidos, a eletroforese capilar pode ser considerada uma ótima alternativa para a prospecção de metabólitos de hormônios, podendo ser utilizada em análises de rotina nos laboratórios de endocrinologia animal, sobretudo naqueles que se dedicam às metodologias não-invasivas de avaliação da função reprodutiva em animais selvagens. / The objective of this work was to develop a protocol of hormonal extraction from jaguar feces (Panthera onca) and validate a methodology of analysis of these extracts with capillary electrophoresis, verifying the analytical efficiency of this technique in the study of the steroids metabolites in feces, with the objective of future use of this methodology in the routine of the endocrinology laboratories. Seven treatments were tested for the samples: four extraction protocols in different solvents, one of acid hydrolysis and two extraction protocols in solid phase (SPE). The extraction protocol in acetonitrila was satisfactory as pre-treatment of the samples and ally to SPE C-18, it presented good results with respect to the sensibility, precision, recovery and time of analysis. Based on the obtained results, the capillary electrophoresis can be considered a great alternative for the research of metabolites of hormones, it could also be used in routine analyses in the endocrinology laboratories, mainly in those that are devoted to the non-invasive evaluation methodologies of the reproductive function in wild animals.

A risperidona (RISP) é um fármaco neuroléptico que após sua administração oral é metabolizado resultando em dois metabólitos quirais, a 7-hidroxirisperidona (7- RispOH) e a 9-hidroxirisperidona (9-RispOH). A 9-RispOH é o metabólito majoritário da risperidona a qual é comercializada na forma de racemato com o nome de paliperidona. Esse projeto teve como finalidade avaliar a capacidade dos fungos endofíticos Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) e Glomerella cingulata (VA1) e do fungo de solo Mucor rouxii em biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo 9-RispOH enantiosseletivamente. Foi objeto de estudo também a otimização do processo de biotransformação através do emprego de diferentes meios de cultura (Czapek, Czapek Dox e Koch`s K1) para o cultivo dos fungos utilizados no estudo. O método escolhido para a separação da risperidona e seus metabólitos quirais foi a eletroforese capilar (CE). As separações eletroforéticas dos analitos foram realizadas empregando um capilar de sílica fundida de 40 cm de comprimento e 75 ?m de diâmetro interno, uma solução tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1 pH 3,0 contendo CD-?-sulfatada 2,0% (p/v) e carboximetil-?-CD 0,5% (p/v) como seletores quirais. Todos os experimentos no CE foram realizados no modo reverso aplicando uma tensão de -10kV. As amostras foram injetadas aplicando uma pressão 0,5 psi por 8 s. O capilar e as amostras permaneceram na temperatura de 20oC. Para a extração dos analitos do meio de cultura foi utilizado a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). A técnica de preparação de amostra foi realizada no modo de três fases utilizando uma fibra de polipropileno impregnada com n-octanol e preenchida com uma solução de ácido clorídrico 100 mmol L-1 pH 3,0. A fibra foi mergulhada na amostra tamponada com uma solução de fosfato de potássio dibásico 500 mmol L-1 pH 12,0. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para análise de fármacos em material biológico avaliando os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação e estabilidade. Todos os parâmetros avaliados ficaram dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA. Entre os fungos avaliados, apenas o Mucor rouxii foi capaz de biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo e quiral 9-RispOH. Nas condições empregadas a razão enantiomérica foi de 79,6%. / Risperidone (RISP) is a neuroleptic drug which after oral administration is metabolized into two chiral metabolites, 7-hydroxyrisperidone (7-RispOH) and 9- hydroxyrisperidone (9-RispOH). 9-RispOH is the major metabolite and it is commercialized under the generic name paliperidone. The objective of this project was to evaluate the capability of the endophytic fungi Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) and Glomerella cingulata (VA1) and the soil fungus Mucor rouxii to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH, enantioselectively. In addition, it was also optimized the biotransformation process through the use of different culture medium (Czapek, Czapek Dox and Koch`s K1). The chiral analysis was performed by capillary electrophoresis (CE). The electrophoretic separation of the analytes was accomplished in a silica capillary with 40 cm of length and 75 ?m of internal diameter. The background electrolyte was a sodium phosphate 100 mmol L-1 pH 3.0 plus 2.0% (w/v) sulfated-?-CD and 0.5% (w/v) carboxymethyl-?-CD. All experiment on CE was performed in reverse mode by applying a voltage of -10 KV. The samples were injected hydrodynamically by applying a pressure of 0.5 psi for 8 s. The temperature of analysis was 20oC. For the extraction of the analytes from the culture medium it was employed the hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME). The extraction conditions were: n-octanol as organic solvent and a hydrochloridric acid solution of 100 mm L-1 pH 3.0. The pH of the sample was controlled by the addition of potassium phosphate buffer 500 mmol L-1 pH 12.0. The method was validated according to ANVISA guidelines (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) for the analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and stability. All parameters were in agreement with the established limits by ANVISA. From all the evaluate fungi only Mucor rouxii was able to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH. In the conditions used in these project the enantiomeric ratio was 79.6%.

Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de metodologias para análise de metais pesados em águas de abastecimento (sistema Guarapiranga) e em água de chuva por métodos voltamétricos, a quantificação de cátions e ânions por eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (EC-DCC), a construção de eletrodos de prata a partir de CD-Rs e sua aplicação para medidas potenciométricas, amperométricas e voltamétricas, a confecção de microeletrodos de ouro explorando técnicas de micro-fabricação com toner e sua aplicação como detector amperométrico em eletroforese capilar e o uso de máscaras de toner para construção de redes de microeletrodos de ouro, platina e carbono. Para o desenvolvimento de metodologia para monitorar chumbo, cobre e mercúrio em águas de abastecimento e em água de chuva, enfatizou-se a utilização de dispositivos semidescartáveis de ouro construídos a partir de CD-Rs utilizando técnicas eletroanalíticas de redissolução. O limite de detecção para 300 s de pré-concentração foi calculado em 80, 90 e 100 ng L-1 para Pb2+, Cu2+ e Hg2+, respectivamente. O volume mínimo de amostra necessário para esta análise é de 0,5 mL. Para analisar estes metais em amostras de águas coletadas do sistema Guarapiranga, foi implementado um método alternativo simples e de baixo custo para eliminação da matéria orgânica presente nestas amostras. Este método permite o pré-tratamento de um grande número de amostras simultaneamente. Em adição à quantificação de metais pesados, ao longo deste trabalho também foi otimizada uma metodologia para o monitoramento de vários outros íons (Cl-, NO3-, SO42-, CH3COO-, F-, PO43-, NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+ e Li+) em águas do sistema Guarapiranga utilizando equipamento de eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (EC-DCC) construído no laboratório. O limite de detecção para estes íons foi calculado em 0,23, 0,43, 0,50, 4,26, 0,75, 1,00, 0,09, 0,18, 0,19, 0,20, 0,19 e 0,23 mg L-1, respectivamente. Além da utilização de eletrodos de ouro, ao longo desta tese também foi desenvolvida metodologia para a construção de sensores a partir de CD-Rs de prata. São discutidas as diferentes etapas envolvidas na elaboração destes dispositivos, é apresentada a sua caracterização e são mostrados os resultados obtidos por voltametria de redissolução para análise de chumbo, por amperometria/FIA para análise de cianeto e por potenciometria/FIA para análise de cloreto. A aplicação de técnicas de micro-fabricação com toner para desenvolver detectores amperométricos de ouro para eletroforese capilar foi outro assunto estudado. Estes sensores foram acoplados a um sistema de eletroforese capilar utilizando uma célula do tipo \"wall-jet\". A potencialidade deste tipo de detecção em eletroforese capilar foi demonstrada com a análise simultânea de iodeto, ácido ascórbico, dipirona e paracetamol. O limite de detecção para estes íons foi calculado em 0,1, 0,5, 3,1 e 1,1 µmol L-1, respectivamente. O uso de máscaras de toner para construir redes de microeletrodos de ouro, platina e carbono é outro tópico apresentado nesta tese. Informações detalhadas sobre as etapas e parâmetros envolvidos na construção deste tipo de sensor são apresentadas. O desempenho, assim como algumas características peculiares destes dispositivos são demonstradas através do uso de sistemas químicos conhecidos e os resultados obtidos comparados com os de um eletrodo convencional. / This study describe the development of methodologies for the analysis of heavy metals in drinking water supply (Guarapiranga system) and in rain water by using voltammetric methods, for the quantification of cations and anions by capillary electrophoresis using contactless conductometric detection (CE-CCD), the construction of silver electrodes utilizing recordable CDs and its application for potentiometric, amperometric and voltammetric analysis, the confection of microelectrodes utilizing microfabrication techniques with toner and its application as electrochemical detector in capillary electrophoresis and the utilization of toner masks to construct gold, platinum and carbon microelectrodes arrays. In the development of methodologies for lead, copper and mercury monitoring for natural waters and in rain water, was emphasized the utilization of semi-disposable gold electrodes constructed from recordable CDs, utilizing stripping analysis techniques. The detection limit utilizing 300 s pre-concentration time was calculated as 80, 90 and 100 ng L-1 for Pb2+, Cu2+ e Hg2+, respectively. The minimum sample volume for each analysis is 0.5 mL. For the analysis of these metals in waters samples collected in the Guarapiranga dam, a simple and alternative low cost method to eliminate the organic mater present in these samples was implemented. This method permits the pre-treatment of many samples simultaneously. In addition to the quantification of heavy metals, in the course of this work, the methodology for monitoring many other ions (Cl-, NO3-, SO42-, CH3COO-, F-, PO43-, NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+ e Li+) in the waters from Guarapiranga dam utilizing capillary electrophoresis with contactless conductometric detection (CE-CCD), an instrument constructed in the laboratory was also optimized. The detection limit for these ions was calculated as 0.23, 0.43, 0.50, 4.26, 0.75, 1.00, 0.09, 0.18, 0.19, 0.20, 0.19 e 0.23 mg L-1, respectively. Apart from the utilization of gold electrodes, on this work, we also developed a new methodology for the construction of sensors starting from silver CD-Rs. The different steps involved in the manufacture of these devices are discussed, its characterization is presented and the results obtained utilizing voltammetry for lead analysis, FIA/amperometry for the analysis of cyanide and FIA/potentiometry for the analysis of chloride. The utilization of microfabrication techniques with toner to develop amperometric gold detectors for capillary electrophoresis applications was another subject investigated. These sensors were coupled a capillary electrophoresis system using a wall-jet type cell. The potentiality of this type of detection for capillary electrophoresis was demonstrated for the simultaneous analysis of iodide, ascorbic acid, dipyrone and paracetamol. The detection limit for these ions was calculated as 0.1, 0.5, 3.1 and 1.1 µmol L-1, respectively. The utilization of masks made with toner to construct arrays of gold, platinum and carbon microelectrodes is another topic presented in this thesis. Detailed information about the steps and factors involved in the construction of this kind of sensor are presented. The performance as well as some peculiar characteristics of these devices are demonstrated utilizing well know chemical systems and the results obtained compared to the ones of a conventional electrode.

O interesse de plantas, do ponto de vista medicinal e cosmetológico, tem levado a necessidade de eficientes métodos de extração. A preparação da amostra é uma das mais importantes fases no desenvolvimento de uma metodologia analítica em preparações herbais. O presente trabalho teve como objetivo propor metodologias alternativas para a análise de metabólitos vegetais em produtos naturais, com ênfase em procedimentos de extração. As seguintes plantas foram avaliadas: soja (Glycine Max, Fabaceae), capsicum (Capsicum anuum, Solanaceae), camomila (Matricaria chamomilla, Compositae), guaraná (Paullinia cupana, Sapidaceae) e erva mate (Ilex paraguariensis, Aquifoliaceae). As principais classes de metabólitos vegetais estudadas foram os compostos fenólicos e metilxantinas, sendo utilizada a eletroforese capilar, como técnica de análise, em solução livre e em meio micelar. A otimização da metodologia de extração isoflavonas da soja, em cápsulas farmacêuticas, incluiu o uso de diferentes solventes, o tempo de extração, bem como a escolha do melhor solvente para a dissolução dos analitos para posterior injeção. A identificação tentativa de grupos derivados de malonil foi obtida a partir dos espectros de UV, tempo de migração e por hidrólise da amostra. Um estudo da composição de diferentes metabólitos primários e secundários da folha de soja, a saber: flavonóides, ácidos orgânicos, açúcares, cátions, ânions e ácidos graxos livres, foi realizado por variadas formas de extrações. Para o capsicum explorou-se a extração de capsaicinas por dispersão de matriz em fase sólida (MSPD). Os sorventes testados foram florisil, C-18 e sílica, sendo avaliados diferentes solventes para eluição. Um estudo de otimização da extração de cafeína em amostras de guaraná em pó foi realizado, utilizando-se, como referência, um extrato obtido em Soxhlet. Os polifenóis da camomila foram extraídos em ultrassom em diferentes tempos e temperaturas, comparada a análise por maceração e processador industrial, utilizando como extrator, o meio hidroglicólico. / The interest for plants of medicinal and cosmetic application demands methods with efficient extraction. Sample preparation is one of most important steps in the development of an analytic methodology in herbal preparation. The present work proposes methodologies for the analysis of the secondary metabolites in natural products, with emphasis in extraction procedures. The following plants were evaluated: soy (Glycine max), capsicum (Capsicum anuum), chamomile (Matricaria chamomilla), guaraná (Paullinia cupana), mate (Ilex paraguariensis) by the use of capillary electrophoresis. The first proposed method was applied to the determination of isoflavones in soy germ capsules from four different pharmaceutical laboratories. Peak assignment of unknown isoflavones in certain samples was assisted by hydrolysis procedures, migration behavior and UV spectra comparison. A study of the composition of metabolites and nutrients as flavonoids, organic acids, carbohydrates, cations, anions and fatty acids were evaluated in soy leaf. An easy, rapid method of extraction was performed for capsicnoids in Capsicum anuum by Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD). Different solid phases C18, silica and florisil were tested. To guaraná different methodologies of extraction were tested (ultrasound, turrax) compared to exhaustive Soxhlet extract. The influence of operating parameters (temperature, time) on the extraction efficiency of chamomile by ultrasound was studied, compared extract by maceration and processing. The mixture of water and glycol was used.