A infecção de corrente sanguínea (ICS) causada por bactérias multirresistentes tem alta mortalidade em pacientes receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). A Pseudomonas aeruginosa é um dos agentes mais frequentes e de difícil tratamento nessa população de pacientes. Objetivos: Avaliar características clínicas, microbiológicas e moleculares de 30 isolados de P. aeruginosa resistente à carbapenêmicos (PARC) em ICS de pacientes submetidos a TCTH e a presença de sinergismo antimicrobiano in vitro. Métodos: Os dados clínicos foram obtidos retrospectivamente de prontuários médicos e registrados em banco de dados. Análises bivariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar determinantes de desfechos clínicos e uma curva de sobrevida foi construída. Determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) dos antimicrobianos por meio de microdiluição, foram realizados ensaios de sinergismo por método de checkerboard e time-kill, avaliação da clonalidade por eletroforese em campo pulsado e detecção de genes codificadores de mecanismos de resistência e virulência por reação em cadeia de polimerase. O sequenciamento do genoma completo (WGS) dos principais clones foi realizado por Nextera XT, utilizando a tecnologia Illumina MiSeq. Resultados: A maioria dos pacientes era do gênero feminino, com mediana de idade de 48 anos. Neutropenia foi presente em 93% dos pacientes e colonização prévia por PARC em 32%. A mortalidade em 14 dias foi 68%; a maioria dos pacientes que morreram foram transplantados alogênicos (79% vs. 17% entre receptores de transplante autólogo; p=0,012). Pacientes tratados com duas ou três drogas não apresentaram diferença estatisticamente significante na mortalidade até 14 dias após a ICS. Foram avaliados 30 isolados bacterianos. Todos apresentaram alto nível de resistência ao meropenem (MERO): CIM90 > 512 ug/mL; dois terços eram resistentes à amicacina (AMK) (CIM 2-512 ug/mL) e todos mantinham sensibilidade à colistina (COL). Muitos isolados (17/30) alcançaram efeito sinérgico in vitro pelo método time-kill com a combinação MERO mais COL, mas não com AMK. Nenhum antagonismo foi observado. Houve menor mortalidade em pacientes cujo isolado apresentou sinergismo entre COL e MERO quando comparados a pacientes portadores de isolados sem sinergismo, sem significância estatística. O gene de carbapenamase mais identificado foi blaSPM e 6 isolados apresentaram blaSPM e blaKPC. Os isolados apresentaram genes relacionados com virulência, tais como toxA, exoS e lasB; pacientes com ICS causada por P. aeruginosa que abrigava o gene lasB apresentaram maior risco de evoluir para o óbito. O WGS mostrou que os clones abrigavam SPM-1, Tn4371, mutações em porinas, em partes das bombas de efluxo, nas proteínas ligadores de penicilina (PBP) e pertenciam a ST277. Conclusão: As ICS por PARC cursaram com alta mortalidade em pacientes submetidos à TCTH. Houve uma grande proporção de resultados positivos para sinergismo entre os antimicrobianos in vitro, mas não foi possível demonstrar benefício estatisticamente significante no uso da terapia combinada com três drogas. Os clones carreavam SPM-1, Tn4371 e pertenciam a ST277 / Bloodstream infection (BSI) has high mortality in hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients and Pseudomonas aeruginosa is an important and challenging organism. Objectives: To evaluate clinical, microbiological and molecular features of carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) isolates from BSI identified among HSCT patients and address in vitro synergy of antibiotic combination. Methods: Patient medical records were retrospectively reviewed and registered in a database. We used bivariate and multivariate analyzes to investigate determinants of clinical outcomes, and demonstrated overall mortality using a survival curve. We determined minimal inhibitory concentrations (MIC) for antimicrobials and in vitro synergies using checkerboard and time-kill assays, pulsed-field electrophoresis (PFGE) for clonality assessment and polymerase chain reaction (PCR) to detect carbapenamases and virulence genes were performed for all isolates. Whole genome sequence (WGS) of main clones was performed by Nextera XT, using Illumina MiSeq technology. Results: Most patients were female, median age was 48 years old. Main baseline disease was acute leukemia and 68% received allogeneic HSCT. 93% of patients had neutropenia and 32% had prior CRPA gut colonization.14-day mortality was 68%; mortality was higher among allogeneic HSCT recipients compared to autologous HSCT recipients (79% vs. 17% p = 0,012). Patients treated with two or three drugs did not present a statistically significant difference in 14-day mortality after BSI. In total, 30 bacterial isolates were analyzed; all presented a high resistance level to meropenem (MERO): MIC90 > 512ug/mL; two thirds were also resistant to amikacin (AMK) (MIC 2-512 ug/mL) and all were susceptible to colistin (COL). Many (17/30) isolates achieved in vitro synergistic effect in time-kill assay with the association of MERO and COL, but synergistic effect was not observed with AMK, by time-kill. No antagonistic effect was observed. There was a tendency towards better survival in patients whose CRPA isolate had in vitro synergy between COL and MERO without statistical significance. The most frequent carbapenamase gene identified was blaSPM, and six co-harboured both blaKPC and blaSPM. Isolates presented genes related to virulence factors such as toxA, exoS and more patients with BSI caused by P. aeruginosa harbouring gene lasB evolved to death. WGS analysis showed that clones harboured SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277. They also presented mutations in genes related with porins and efflux pumps, as well in penicillin binding proteins (PBPs). Conclusion: CRPA BSI as associated with high mortality in HSCT recipients. A large proportion of isolates had in vitro synergy; however, we could not demonstrate statistically significant benefit in the use of combination therapy. Clones carried SPM-1, Tn4371 and belonged to ST277

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O uso extensivo e indiscriminado de antibióticos tem contribuído para um aumento do número de infecções causadas por A. baumannii e P. aeruginosa resistentes a uma grande variedade de agentes antimicrobianos, incluindo β-lactâmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar características fisiológicas e moleculares da resistência aos carbapenêmicos em P. aeruginosa e A. baumannii isolados em um hospital terciário. A partir de estudos com amostras clínicas de pacientes admitidos num hospital terciário foram isolados, em 2012, A. baumannii (n=44) e P. aeruginosa (n=28) resistentes aos carbapenêmicos e em 2013, P. aeruginosa (n=19) e A. baumannii (n=44) com igual fenótipo. As amostras bacterianas recuperadas em 2012 foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 e blaOXA-143 foram testados por PCR. A partir das linhagens isoladas no estudo de 2013, testes fisiológicos foram realizados para avaliar a atividade hemolítica, estresse oxidativo, tolerância aos biocidas, formação de biofilme e determinação da resistência aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA e blaNDM-1), sistemas de efluxo (adeB, mexB, mexD, mexF e mexY) e perda de porina (oprD) foram pesquisados por PCR. Foram analisados dados epidemiológicos de todos os pacientes avaliados. No estudo de 2012, a polimixina B foi a única droga eficaz para todos os isolados. Os marcadores genéticos foram observados apenas em isolados de Acinetobacter. O genótipo mais frequente observado foi blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), seguido por blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). Os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 não foram detectados. Uma elevada taxa de mortalidade foi observada (> 70%) entre os pacientes. No estudo de 2013, idade avançada, predomínio de indivíduos internados em UTI, uso de dispositivos médicos invasivos, como cateter venoso, tratamento anterior com fluoroquinolonas ou ß-lactâmicos em combinação com um inibidor da β-lactamase e estadia prolongada no hospital foram fatores predisponentes para infecção por estes microrganismos. Colistina demonstrou atividade, in vitro, contra todas as amostras bacterianas avaliadas. Tigeciclina foi também efetiva para linhagens de A. baumannii. P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos não foi capaz de produzir hemolisinas. Essas linhagens foram menos tolerantes ao estresse oxidativo e alguns biocidas, mas mostraram um aumento da capacidade de formação de biofilme em relação aos isolados sensíveis. Os principais mecanismos de resistência presentes em linhagens de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foi síntese de oxacilinases (OXA-23, OXA-51 e OXA-143), ausência de oprD e presença de bomba de efluxo (AdeABC). Em P. aeruginosa foram encontrados genes para bombas de efluxo (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM), blaSPM-1, além de ausência de oprD. Estes resultados confirmam a dificuldade de manejo terapêutico de pacientes com infecções associadas a microrganismos multirresistentes, com impacto direto na mortalidade e controle epidemiológico dessas linhagens nos centros de saúde. / The non-fermenting Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are widespread in the environment and are increasingly associated with severe nosocomial infections. Extensive and indiscriminate use of antibiotics has contributed to an increased number of infections caused by A. baumannii and P. aeruginosa that are resistant to a wide variety of antimicrobials, including β-lactams. This study aimed to evaluate physiological and molecular characteristics of carbapenem resistance in P. aeruginosa and A. baumannii. From studies with clinical samples from patients admitted to a tertiary hospital, were isolated in 2012 A. baumannii (n=44) and P. aeruginosa (n=28) resistant to carbapenems and in 2013, P. aeruginosa (n=19) and A. baumannii (n=44) with similar phenotype. The bacterial samples recovered in 2012 were submitted to antibiotic susceptibility testing. Genetic markers related to β-lactamases synthesis blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 and blaOXA-143 were screened by PCR. From strains recovered in the 2013 study, physiological tests were performed to evaluate hemolytic activity, oxidative stress, biocides tolerance and biofilm formation, besides determination of antimicrobial resistance patterns. Genetic markers related to β-lactamases synthesis (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA and blaNDM-1), efflux systems (adeB, mexB, mexD, mexF and mexY) and loss of porin (oprD) were screened by PCR. Epidemiological data about all of these patients were analyzed. In the 2012 study, polymyxin B was the only effective drug for all isolates. Genetic markers were observed only in Acinetobacter isolates. The most frequent genotype observed was blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), followed by blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). The genes blaOXA-24 and blaOXA-58 were not detected. High mortality rate (> 70%) between the pacients was observed. In a prospective study, advanced age, predominance of individuals hospitalized in ICU, use of invasive medical devices, such as venous catheter, previous treatment with fluoroquinolones or β-lactams in combination with β-lactamase inhibitor and prolonged stay in hospital were predisposing factors for infection by these microorganisms. Colistin has shown activity, in vitro, against all assessed bacterial samples. Tigecycline was also effective for strains of A. baumannii. Carbapenem-resistant P. aeruginosa was not able to produce hemolysin. These strains were less tolerant to oxidative stress and some biocides, but they showed increased ability of biofilm formation in relation to susceptible isolates. The major mechanisms of carbapenems resistance present in A. baumannii strains was oxacilinases synthesis (OXA-23, OXA-51 and OXA-143), oprD absence and efflux pump presence (AdeABC). In P. aeruginosa was found genes encoding efflux pumps (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM) and blaSPM-1; besides oprD absence. These results confirm the difficulty of therapeutic management of patients with infections associated with multidrug resistant microorganisms, with direct impact on mortality and epidemiological control of multidrug-resistant strains in health centers.

Mycobacterium tuberculosis est responsable de 8,7 millions de nouveaux cas de tuberculose et de 1,4 millions de décès en 2011. L’émergence de souches résistantes aux deux antituberculeux majeurs, isoniazide et rifampicine, (MDR) et aux antibiotiques de seconde ligne (XDR), ainsi que la difficulté d’éradiquer les formes « dormantes » du bacille nécessitent la recherche de nouveaux antibiotiques. Les β-lactamines n’ont jamais été utilisées en thérapeutique car M. tuberculosis produit une β-lactamase à large spectre, BlaC. Cependant, l’association d’une β-lactamine appartenant à la classe des carbapénèmes, le méropénème, et d’un inhibiteur de β-lactamase, l’acide clavulanique, est active sur M. tuberculosis incluant des souches XDR. Notre objectif a été de caractériser les cibles des carbapénèmes qui sont atypiques chez M. tuberculosis, parce que le peptidoglycane de cette bactérie contient majoritairement (80%) des ponts interpeptidiques formés par une classe particulière de transpeptidases, les L,D-transpeptidases. Nous avons comparé les cinq L,D-transpeptidases de M. tuberculosis au niveau de leur activité in vitro dans la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane et dans la réaction d’inactivation par les carbapénèmes. Nous avons ainsi pu montrer que les cinq L,D-transpeptidases sont fonctionnelles in vitro. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt4 et LdtMt5 sont capables de former des ponts interpeptidiques du peptidoglycane reliant l’acide aminé en position 3 d’un substrat tétrapeptidique donneur à l’acide aminé en position 3 d’un substrat tétrapeptidique accepteur. Ces mêmes enzymes peuvent également utiliser la D-méthionine comme accepteur dans une réaction d’échange de la D-Ala4 du substrat tétrapeptidique. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt3 et LdtMt4 forment un complexe covalent avec les carbapénèmes. La réaction d’inactivation des L,D-transpeptidases par les carbapénèmes se déroulent en deux étapes. Dans un premier temps, un intermédiaire covalent réversible est formé (constante catalytique k1) puis la deuxième étape aboutit à la formation de l’acylenzyme (constante catalytique k2). La détermination des constantes catalytiques d’inactivation k1 et k2 a révélé d’importantes différences entre les carbapénèmes. Excepté pour LdtMt1, l’imipénème inactive plus rapidement les L,D-transpeptidases que les autres carbapénèmes suggérant que des modifications de la chaine latérale pourraient être envisagées pour optimiser l’activité « anti-mycobactérienne » de cette classe de β-lactamines. Nous avons en parallèle initié l’étude de la régulation des L,D-transpeptidases dans différentes conditions de culture ce qui permettra à terme d’identifier les L,D-transpeptidases essentielles pour la croissance et la persistance de M. tuberculosis. Ce travail pourrait déboucher sur l’identification de cibles essentielles permettant l’éradication des formes dormantes de M. tuberculosis qui sont très difficile à traiter. / Mycobacterium tuberculosis is responsible for 8.7 million of new cases of tuberculosis (TB) and 1.4 million of deaths in 2011. The emergence of strains resistant to the two first-line anti-TB drugs, isoniazid and rifampicin, (MDR), to second line-drugs (XDR) and the difficult to kill dormant forms of the bacilli require the discovery of new anti-TB antibiotics. β-lactams are usually not considered for tuberculosis treatment since M. tuberculosis produces a broad-spectrum β-lactamase, BlaC. However, the combination of β-lactam belonging to the carbapenem class, meropenem, with β-lactamase inhibitor, clavulanate, is notably active on XDR strains. Our aim was to characterize the carbapenem targets, atypical in M. tuberculosis, since peptidoglycan of this bacteria contains a majority (80%) of cross-links formed by a special transpeptidase family, the L,D-transpeptidases. We have compared the five L,D-transpeptidases of M. tuberculosis for their in vitro activities with respect to peptidoglycan dimers formation and for inactivation reaction by carbapenems. Thus, we have showed that the five L,D-transpeptidases were functional in vitro. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt4 et LdtMt5 were able to form peptidoglycan cross-links binding the third amino acid of a donor tetrapeptide substrate with the third amino acid of an acceptor tetrapeptide substrate. These enzymes were also able to use D-methionine as an acceptor in exchange reaction of D-Ala4 of the donor tetrapeptide substrate. LdtMt1, LdtMt2, LdtMt3 et LdtMt4 formed a covalent adduct with carbapenems. The inactivation reaction of L,D-transpeptidases by carbapenems proceed through two steps. In first, a reversible covalent adduct is formed (catalytic constant k1), followed by a second step leading to acylenzyme formation (catalytic constant k2). The determination of kinetic constants of inactivation k1 et k2 revealed important differences between carbapenems. Except for LdtMt1, Imipenem inactivates L,D-transpeptidases more rapidly than other carbapenems indicating that modification of the carbapenem side chain could be used to optimize their anti-mycobacterial activity. In parallel, we have started the study of the L,D-transpeptidases regulation in various culture conditions will allow identifying the L,D-transpeptidases essential for growth and persistence of M. tuberculosis. This work might lead to identification of essential targets allowing eradication of M. tuberculosis dormant forms, which are difficult to treat with conventional anti-TB drugs.

Antibiotic resistant bacteria are threatening human health, and the resistance is progressingfaster than the development of new antimicrobial compounds. Antibiotic resistant infections cost enormous sums of money and resources, but most importantly human lives. Therefore, early prediction and detection of antibiotic resistance in bacteria are research areas of high priority. The use of analytical instruments such as matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) is a powerful tool for research in antibiotic resistant bacteria, both as quick microbe identification and for other areas in the field.Due to its relatively easy interpretable spectra provided by the soft ionization technique, and ability to ionize macromolecules without compromising sample integrity, it has also been used for biomarker screening for detection of antimicrobial resistance. Although these studies have shown promising results, the area is still progressing and needs further method development and standardized protocols. This study aimed to use MALDI-TOF MS for carbapenemaseassociated screening in Klebsiella oxytoca. The presumed key spectral peaks would derive from presence of the enzyme Verona integron-encoded metallo-β-lactamase, type 1 (VIM-1), and would not be found if VIM-1 were absent. The isolates, carrying the enzyme, used in the study were isolated from wastewater and river water in Örebro, Sweden. Bacteria genus and species was determined by MALDI-TOF identification, whereupon the microbes were tested for antibiotic susceptibility using the disk diffusion method. Carbapenem hydrolysis assay was used to confirm the presence/absence of functional carbapenemase. A genotypic confirmation was performed by polymerase chain reaction and gel electrophoresis. Mass spectra from MALDI-TOF were compared for identification of possible biomarker peaks that could indicate carbapenem resistance. Nine key mass spectral peaks were found that could potentially be used as biomarkers in future studies. The peaks differentiated two groups of Klebsiella oxytocaisolates, one group producing functional carbapenemase and one group that did not, consistent with the aim of this study.

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.

Nos últimos anos a incidência de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes aumentou expressivamente. Esse fenômeno não foi acompanhado pelo desenvolvimento de novos antimicrobianos, resultando em infecções cuja opção de tratamento é a combinação de antimicrobianos. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens são importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), e capazes de adquirir resistência a várias classes de antimicrobianos, como os carbapenêmicos e polimixinas. Os testes que avaliam sinergismo in vitropodem ser uma ferramenta importante na escolha do tratamento antibiótico adequado para infecções causadas por microrganismos multirresistentes. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de sinergismo in vitroque possam ser utilizados na rotina de laboratórios de microbiologia clínica como alternativa ao método considerado padrão ouro (time-kill). Foram selecionados para o estudo 48 isolados Gram-negativos não fermentadores (20 A. baumannii e 28 P. aeruginosa) e 14 fermentadores (S. marcescens) do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência identificados por PCR e sequenciamento total do genoma. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antimicrobianos e avaliação do sinergismo pelos métodos time-kill (TK), disco aproximação (DA) e CIM:CIM razão.A concordância dos métodos foi avaliada por teste de kappa e os resultados discordantes foram classificados em tipos de erros baseado no FDA.Os isolados apresentaram alta proporção de resistência a meropenem e 7 isolados de A. baumanniiapresentaram resistência a colistina. A combinação de colistina com fosfomicina ou meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de A. baumanniiresistentes a colistina pelo DA e TK. Por outro lado, a combinação de fosfomicina-meropenem apresentou concordância boa pelo teste de kappa e baixo número de erros entre os métodos TK e DA para todos os isolados de A. baumannii. Para os isolados de P. aeruginosa não foram detectados efeitos sinérgicos pelos métodos DA e CIM:CIM razão.O método CIM:CIM razão apresentou alta concordância com o TK entre os isolados de A. baumannii resistentes a colistina. A combinação ceftazidima-avibactam com meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de S. marcescensportadores do gene blaKPC-2 pelo DA e TK. O método de DA apresentou uma boa correlação com o TK para a combinação de fosfomicina-meropenem e ceftazidima-avibactam-meropenem, com baixa porcentagem de erros menores, podendo ser utilizado para avaliar sinergismo in vitro para essas combinações. Não foi identificado no estudo efeito antagônico, portanto, foram encontrados somente erros menores / In recent years, the incidence of infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria has increased. This event has not been accompanied by the development of new antimicrobials, resulting in infections which treatment option is the combination of antimicrobials. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens are important causesof Hospital Acquired Infection (HAI), and able to acquire resistance to multiple classes of antimicrobials, such ascarbapenems and polymyxins. Synergism testing may be an important tool in choose the appropriate antibiotic treatment. The aim of this study was to evaluate in vitro synergism methods that can be used in a clinical microbiology laboratory as an alternative to the method considered the gold standard (time-kill).For the study were selected 48 non-fermenting (20 A. baumannii and 28 P. aeruginosa)and 14 fermenting(S. marcescens) Gram-negativeisolates from LIM-54strains bench with different resistance mechanisms identified by PCR and total genome sequencing.Minimum antimicrobial inhibitory concentration and synergism evaluation by time-kill (TK), disk approximation (DA) and MIC: MIC ratio were performed. Agreement of the methods was evaluated by kappa test and the discordant results were classified in types of errors based on the FDA. The isolates showed high proportion of resistant to meropenem and 7A. baumannii isolates showed resistance to colistin. The combination of colistin with fosfomycin or meropenem showed high synergistic effect for colistin-resistant A. baumannii isolates by DA and TK.On the other hand, the combination of fosfomycin-meropenem showed good concordance by kappa test and low number of errors between TK and DA for all A. baumannii isolates.For P. aeruginosa isolates no synergistic effects were detected by DA and MIC: MIC ratio.The method MIC: MIC ratio showed high concordance with the TK among the colistin-resistant A. baumannii isolates.The combination ceftazidime-avibactam with meropenem showed high synergistic effect for the isolates of S. marcescenscarryingblaKPC-2 gene by DA and TK. The DA showed a good agreement with TK for the combination of fosfomycin-meropenem and ceftazidime-avibactam-meropenem, with a low percentage of minor errors, and could be used to evaluate synergism in vitro for these combinations

Objetivo: Reduzir a transmissão de Enterobactérias resistentes a carbapenêmicos (ERC) em uma unidade de terapia intensiva com intervenções baseadas em simulações por um modelo matemático desenvolvido. Desenho: Ensaio antes e depois com um período basal de 44 semanas e um período de intervenção de 24 semanas. Métodos: O estudo foi conduzido em uma Unidade de Terapia Intensiva Médica (UTI) de um hospital de ensino terciário. Desenvolvemos um modelo de transmissão de ERC em uma UTI e medimos todos os parâmetros necessários para a entrada do modelo. Foram estabelecidas metas de adesão à higienização das mãos e às precauções de contato com base nas simulações e conduziu-se uma intervenção focada em atingir essas métricas como metas, com auditoria semanal da unidade e reuniões com a equipe para dar feedback sobre o desempenho. Resultados: As metas para a adesão à higienização das mãos e às precauções de contato foram alcançadas na terceira semana do período de intervenção. Durante o período basal, o R0 calculado foi de 11, a prevalência mediana de pacientes colonizados por ERC na unidade foi de 33% e ultrapassou 50% por três vezes. No período de intervenção, a prevalência média de pacientes colonizados por ERC passou para 21%, com uma mediana semanal do Rn de 0,42 (intervalo: 0 a 2,1). Conclusões: As simulações ajudaram a estabelecer e atingir metas específicas para controlar as altas taxas de prevalência de ERC e reduzir a transmissão de ERC dentro da unidade. O modelo foi capaz de prever os resultados observados. Este é o primeiro estudo em controle de infecção que mede a maioria das variáveis de um modelo matemático na vida real e o aplica como uma ferramenta de apoio à decisão para a intervenção / Objective: To reduce the transmission of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) in an intensive care unit with interventions based on simulations by a mathematical model. Design: Before-after trial with a 44-week baseline period and a 24 week intervention period. Setting: Medical Intensive Care unit (ICU) of a tertiary care teaching hospital. Participants: All patients admitted to the unit. Methods: We developed a model of transmission of CRE in an ICU and measured all necessary parameters for the model input. Goals of compliance with hand hygiene and with isolation precautions were established based on simulations. An intervention focused on achieving these goals was conducted with weekly auditing and feedback. Results: The goals for compliance with hand hygiene and contact precautions were reached on the third week of the intervention period. During baseline period, the calculated R0 was 11, median prevalence of patients colonized by CRE in the unit was 33% and exceeded 50% on three occasions. In the intervention period, median prevalence of colonized CRE patients was 21%, with a median weekly Rn of 0.42 (range: 0 to 2.1). Conclusions: The simulations helped to establish and to achieve specific goals in order to control the high prevalence rates of CRE and reduce CRE transmission within the unit. The model was able to predict the observed outcomes. This is the first study in infection control to measure most variables of a model in real life and to apply the model as a decision support tool for intervention

INTRODUÇÃO: Infecções hospitalares por agentes multirresistentes (MR) acarretam custos significativos, elevada morbidade e mortalidade. A transmissão cruzada de MR é dependente da existência de pacientes e ambientes colonizados, as fontes, e da existência da via de transmissão, representada principalmente pelas mãos dos profissionais de saúde. As altas taxas de infecção hospitalar na unidade de terapia intensiva da neurologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo e o aumento na frequência de isolamento de Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos despertaram o interesse no estudo da colonização por estes agentes dos pacientes admitidos na unidade e o efeito de medidas de intervenção educativas na prevenção da colonização. MÉTODOS: O trabalho consistiu em um estudo quasi-experimental com três períodos (pré-intervenção educativa - PI, pós-educação-PE e pós-álcool gel - PA) nos quais eram colhidos swabs orais, axilares e retais de todos os pacientes à admissão, após três dias da admissão e semanais. Para a análise da coorte, foram excluídos os pacientes que já apresentavam colonização por PMR e AC à admissão e aqueles pacientes que, por permaneceram internados na UTIN por período inferior a três dias, tiveram culturas colhidas apenas à admissão. Entre o PI e o PE, foi realizada uma intervenção educativa que consistiu no treinamento dos profissionais de saúde visando higienização das mãos e isolamento de contato. Entre o PE e o PA, foi realizada a segunda intervenção que consistiu na disponibilização de álcool-gel para higienização das mãos na unidade. A adesão à higienização das mãos antes e após o contato com os pacientes e a adesão ao uso correto de luvas foram avaliadas antes e após cada intervenção. Calculou-se a pressão de colonização em cada período e a colonização à admissão. RESULTADOS: 1) Não houve diferenças entre os períodos em relação a idade, sexo, APACHE II, dias de internação prévios. 2) A intervenção educativa melhorou a adesão à higienização das mãos antes e após o contato com os pacientes e ao uso correto de luvas. No PA, apesar da disponibilização de álcool-gel, a adesão à higienização das mãos e ao uso correto de luvas decresceu a valores similares ao PI. 3) A probabilidade de se tornar colonizado ao longo do tempo por PMR e AC aumentou progressivamente do PI para o PE e para o PA. A densidade de incidência de colonização por PMR e AC por 1000 pacientes-dia foi de 24,8 no PI, 43,3 no PE e 67,5 no PA. 4) A pressão de colonização por PMR e AC foi diferente entre os três períodos, com média de 14,7 no PI, 38,2 no PE e 53,3 no PA. Este aumento deveu-se, principalmente, à admissão de pacientes já colonizados provenientes do Pronto Socorro. CONCLUSÃO: Para o controle da transmissão cruzada de AC e PMR são importantes intervenções educativas que visem o aumento na adesão à higienização das mãos. Entretanto, provavelmente é necessário o monitoramento da pressão de colonização e o planejamento de ações visando atuação mais abrangente, locadas nas unidades que representam fontes externas de indivíduos colonizados / Nosocomial infections by resistant pathogens are a major public health concern due to their related costs, morbidity and mortality. The cross transmission of resistant pathogens are dependent on the existence of a source, colonized patients or environment, and on carriage by the healthcare workerss hands. The increasing incidence of infections and colonization by Acinetobacter spp. (AC) and carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA) in the Neurology intensive care unit (NICU) at Hospital das Clínicas of Universidade de São Paulo led to the study of the colonization by these pathogens and the efficacy of interventions on prevention. METHODS: This was a quasi-experimental study with three periods (pre-interventional- PI, post-educational PE and post-alcool hand rub implementation PA). In each period, patients had surveillance cultures (oropharyngeal, axillary and rectal) collected on admission, 3rd day and weekly. Patients who were colonized by CRPA or AC on admission in the NICU and patients who had just one set of cultures collected were excluded from the study. Between PI and PE, an educational intervention focused on hand hygiene and contact precautions was conducted. By the end of PE, an intervention based on the installation of alcohol hand rub dispensers was applied. Hand hygiene and glove use compliance were evaluated before and after each intervention. Colonization pressure was calculated in each period as well as colonization on admission to the ICU. RESULTS: 1) There were no differences in patients age, sex, APACHE II score and number of days in the hospital previous to NICU admission between the periods 2) The educational intervention increased hand hygiene and glove use compliance. In the PA, beside alcohol hand rub dispensers, hand hygiene and glove use compliance decreased. 3) The probability of becoming colonized by CRPA and AC during NICU stay increased over the periods. The incidence density of colonization by CPRA and AC by 1000 patient-days was 24,8 in PI, 43,3 in PE and 67,5 in PA. 4) Colonization pressure by CPRA and AC was different between periods: 14,7 in PI, 38,2 in PE and 53,3 in PA. The increase in the colonization pressure was due to the admission of patients already colonized, mainly from the Emergency room. CONCLUSIONS: Control of cross transmission of AC and CPRA requires efforts to increase hand hygiene compliance, monitoring of colonization pressure and interventions aimed at units that are sources of colonized patients

INTRODUÇÃO: Nas últimas três décadas E. aerogenes e E. cloacae vem sendo reportado como importante patógeno de infecção relacionada a assistência à saúde e vem cada vez mais apresentando resistência a vários antibióticos incluindo os carbapenêmicos. Poucos estudos, entretanto, avaliaram os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Enterobacter no Mundo e no Brasil. OBJETIVO: Avaliar a presença de genes codificadores de carbapenemases, genes de ?- lactamases de espectro estendido e de bomba de fluxo AcrAB-TolC e alteração de proteínas de membrana externa de 44 isolados de E. aerogenes e 8 isolados de E. cloacae resistentes aos carbapenêmicos de 03 hospitais brasileiros. MATERIAL E MÉTODOS: Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em caldo, com os antibióticos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigeciclina e Polimixina B e para Fosfomicina foi realizado o teste de diluição em ágar, segundo CLSI. Foi realizado PCR para identificar os genes codificadores de Serino Beta-lactamase da Classe A de Ambler (blaKPC, blaIMI e blaGES), de Metalo-beta-lactamase da Classe B de Ambler (bla IMP, blaVIM, blaGIM, blaSIM, blaSPM e blaNDM), de Oxacilinases da Classe D de Ambler (bla OXA-48), as ESBL (blaTEM, blaCTX e blaSHV) e da bomba de efluxo AcrAB-TolC. A tipagem molecular foi feita pela técnica de PFGE, as proteínas de membrana externa pelo método de SDS-PAGE e a atividade da bomba de efluxo por meio da determinação da CIM dos carbapenêmicos com e sem inibidor Carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTADOS: No período de 2005 a 2011, foram analisados, 130 isolados de Enterobacter spp, 105 (80,8%) dos isolados foram identificados como Enterobacter aerogenes, destes 44 (41,9%) apresentaram resistência ao Imipenem, Ertapenem ou Meropenem e 25 (19,2%) foram identificados como Enterobacter cloacae, destes 8 (32,0%) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Os isolados de E. aerogenes apresentaram CIMs que variaram de 2 a 128ug/mL para Imipenem, 4 a 64ug/mL para Meropenem e para Ertapenem 1 a >=128 ug/mL e os isolados de E. cloacae apresentaram CIMS que variaram de 8 a 64?g/mL para Imipenem, 2 a 16ug/mL para Meropenem e 8 a 64 ug/mL para Ertapenem. Todos isolados foram sensíveis a Fosfomicina, Polimixina B e Tigeciclina. A única carbapenemase identificada foi KPC, que estava presente em ambos isolados e em todos hospitais estudados. Os 39 isolados de E. aerogenes apresentaram 5 clones diferentes, sendo o clone A predominante. Os 5 isolados de E. aerogenes do Hospital de Itapecerica da Serra pertenciam ao mesmo clone. Os 8 isolados de E. cloacae apresentaram 2 clones diferentes. E a maioria dos isolados analisados apresentarou mecanismos de resistência aos carbapenêmicos como: gene blaKPC associado com o gene blaTEM e/ou blaCTX, associado com diminuição ou ausência de proteína 35-36kDa e 39 kDa. CONCLUSÃO: Em nosso estudo foi observado alta resistência aos carbapenêmicos nos isolados de E. aerogenes e E. cloacae nos 3 hospitais estudados. Os mecanismos observados que contribuíram para a resistência aos carbapenêmicos foram: a presença de KPC, ESBL e impermeabilidade da membrana para os isolados de E. aerogenes e para os isolados de E. cloacae foi observado também como mecanismo o gene da bomba de efluxo AcrART. Para os isolados de E. aerogenes, não foi observado o gene da bomba de efluxo, mas todos isolados analisados apresentaram atividade da bomba de efluxo para os carbapenêmicos, possivelmente nos indicando a presença de outra bomba de efluxo ainda não identificada / INTRODUCTION: In the last three decades, E. aerogenes and E. cloacae have been reported as important opportunistic pathogens in humans. They have been showing an increase resistance to multiple antibiotics including carbapenem. Few studies, however, evaluated the mechanisms of resistance to carbapenem in Enterobacter species in the world and in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the presence of genes encoding carbapenemases, genes of beta- lactamases of extended spectrum and AcrAB TolC- efflux pump and amendment of outer membrane proteins of 44 isolates of E. aerogenes and 8 isolates of E. cloacae carbapenems resistant of 03 Brazilian hospitals. METHODS: To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), microdilution broth test was performed for the followings antibiotics: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigecycline and Polymyxin B and agar dilution for Fosfomycin, according to CLSI. PCR was performed to identify the genes encoding Serino Beta-lactamase Class A Ambler (blaKPC, blaIMI and blaGES) of Metallo-beta-lactamase Class B Ambler (blaIMP, blaVIM, bla GIM, blaSIM, blaSPM and blaNDM) of Oxacilinases Class D Ambler (blaOXA-48), the ESBL (blaTEM, blaSHV and blaCTX) and efflux pump AcrAB-TolC. Molecular typing was performed by PFGE, outer membrane proteins by SDS-PAGE method and the activity of the efflux pump by carbapenem´s MIC by agar diluition with and without inhibitor Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTS: In the period from 2005 to 2011, 130 isolates of Enterobacter spp were analyzed, 105 (80.8%) isolates were identified as Enterobacter aerogenes, of these 44 (41.9%) were resistant to Imipenem, Meropenem or Ertapenem and 25 (19.2%) were identified as Enterobacter cloacae, and 8 (32.0%) showed resistance to carbapenems. The isolated E. aerogenes presented MIC ranging from 2 to 128?g /ml for Imipenem, 4 to 64ug /ml for Meropenem and Ertapenem 1 to >= 128 mg /mL. E. cloacae isolated showed MIC ranged from 8 to 64ug / ml for Imipenem, 2 to 16ug / ml for Meropenem and 8 to 64 mg / mL to Ertapenem. All isolates were susceptible to fosfomycin, polymyxin B and tigecycline. The only carbapenemase identified was KPC, which was present in both isolated and in all hospitals studied. The 39 isolates of E. aerogenes presented five different clones, the clone A being predominant. The five isolates of E. aerogenes in the Hospital of Itapecerica da Serra belong to same clone. Eight isolates of E. cloacae showed two different clones. Most of the isolates analyzed showed resistance mechanisms to carbapenems like: blaKPC gene associated with blaTEM gene and / or blaCTX associated with a decreased or absent protein 35- 36kDa and 39 kDa. CONCLUSION: In our study, we observed high carbapenem resistance in isolates of E. aerogenes and E. cloacae in the three studied hospitals. The observed mechanisms that contributed to resistance to carbapenems were: the presence of KPC, ESBL and impermeability of the membrane in E. aerogenes and in E. cloacae isolates. E. cloacae presented also that gene of the efflux pump AcrART. Among E. aerogenes, the gene wasn´t observed, but all isolates analyzed demonstrated active efflux pump to carbapenems possibly indicating the presence of other efflux pump still unidentified

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.